친수성과 세포적합성을 가지는 조직공학용 천연/합성고분자 Hybrid 지지체 개발에 관한 연구

조상호 韓南大學校 大學院 2004 국내석사

어느 시기에서나 매일 수 많은 사람들이 인체의 조직이나 기관의 손상으로 인해 병원을 드나들고 있다. 조직공학은 이렇게 손상되거나 제 기능을 하지 못하는 기관을 대체하고 새로운 조직을 만들어낼 가능성을 제공한다. 최근 3차원적 구조를 갖는 다공성 고분자 지지체를 제조하기 위해 많은 방법들이 사용되고 있다. 그러나 이러한 다공성 고분자 지지체를 만드는데 있어서 가장 크게 부각되고 있는 문제점 중의 하나는, 고분자들이 소수성이므로 이들로부터 지지체 제조시 지지체의 다공질 내로 세포 및 배양액 등이 제대로 침투하지 못하며, 일단 침투된 세포들도 소수성 다공질 표면으로의 점착 및 증식에 상당한 제약을 받는다는 점이다. 이를 해결하고자 본 논문의 2장에서는 각각 비율을 달리하여 혼합한 alginate/PVA 혼합용액을 2% CaCl2를 사용하여 alginate를 가교하고, freeze-thawing 방법을 사용하여 PVA를 가교하여 친수성과 다공성, 세포적합성을 갖는 고분자 지지체를 제조하였다. Alginate/PVA의 혼합비, 가교조건, freeze-drying 조건 등 조건을 달리하여 제조한 지지체들은 SEM, mercury intrusion porosimeter, 조직공학용 지지체의 물성 분석을 위해 자체 고안한 biaxial mechanical strength tester 등을 통해 다공질 형태, 다공도, 친수성, 유연성, 기계적 물성을 평가하였고 고분자 지지체 내에서 조직세포의 점착 및 증식 현상을 관찰하였다. Alginate 겔은 보통 약물 전달용 혹은 bead 형태로 응용이 가능하다. 일반적으로 alginate 겔은 Ca^(2+) 이온을 이용하여 가교시키는 것이 가장 보편적인 방법이며, 특히 CaCl_(2)가 주로 사용되고 있다. 그러나 가교시 CaCl_(2)를 사용할 경우, alginate와의 가교결합속도가 매우 빠르고 가교시간의 조절이 어려우며, 주사주입이 어려운 정도의 비교적 강한 물성의 가교를 형성하여 세포를 포함한 alginate hydrogel의 제자리 (in situ) 이식에는 다소 어려움이 있다. 이를 해결하고자 본 논문 3장에서는 가교제로 CaSO_(4)를 사용하여 가교속도의 조절, 주사주입이 가능한 alginate 하이드로겔을 제조하였고, alginate 하이드로겔의 세포친화성을 향상시키고자 polyvinyl alcohol (PVA)을 혼합하여 세포 적합성을 평가하였다. 본 연구의 결과, 기존의 천연고분자 지지체 및 합성고분자 지지체 각각이 가지는 단점을 보완한 친수성과 세포적합성을 동시에 가지는 천연/합성 고분자 hybrid 지지체를 제조하였다. 또 가교제로 CaSO_(4)를 사용하여 가교속도의 조절, 주사주입이 가능한 alginate/PVA hydrogel을 제조하였다. 본 논문의 연구 결과를 통해 조직 재생 및 기타 조직공학적 재생이 가능한 생체재료로 다양하게 응용할 수 있을 것으로 기대된다. Every day thousands of people of all ages are admitted to hospitals because of the damages of the tissue and organ. Tissue engineering offers the possibility to creat completely natural tissue and replace failing or malfunctioning organs. Recently, several techniques have been used to manufacture porous polymeric scaffolds having 3-dimensional structure. But these scaffolds usually have limitations for some applications because of their hydrophobicity and stiffness. These properties led to be inefficient in cell seeding and growth as well as handling difficulties. In chapter 2 of this study, alginate/PVA hybrid scaffolds with different alginate and PVA compositions were fabricated by a modified freeze-drying method and the following crosslinking of sodium alginate (using 2 % CaCl_(2)) and PVA (using freeze-thawing method) in the hybrid scaffolds. We were recognized that the hybridized scaffolds having a different alginate and PVA compositions were investigated by compressional mechanical test, water absorption, dimensional stability (in D. I. water), and cell culture (chondrocyte, cell density : 1 × 10^(5) cells/scaffold) which was evaluated by SEM and MTT assay. Alginate gels have been used in both drug delivery and cell encapsulation applications in usually bead forms. Generally alginate gels have been produced by contacting alginate solution with CaCl2 solution. The major disadvantage of this system is that the gelation rate is too fast and hard to control; the resulting structures are not uniform (different crosslinking rates for surface and inside regions) and 3-dimensional structures with complicated shape are difficult to achieve. Also prepared alginate gels are hard to be injected (only very mildly crosslinked alginate gels can be injected). In chapter 3 of this study, we prepared injectable alginate hydrogels with controllable gelation rate by using CaSO_(4) as a crosslinking agent. The gelation rate of alginate/CaSO_(4) mixture solution can be controlled by adjusting CaSO_(4) content. This alginate gel system can be injected into body or injected into molds with complicated shape to prepare 3-dimentional porous scaffolds for tissue engineering applications. Using this method, we also prepared injectable alginate/polyvinyl alcohol (PVA) blend hydrogels with different PVA composition. PVA is a synthetic polymer with good elasticity and cell compatibility. The gelation mechanism and rate control, mechanical properties and cell compatibility of the prepared alginate and alginate/PVA blend gels were investigated.

연골재생을 위한 젤란검/글리콜키토산 하이드로겔 조성물의 특성 및 효과 평가

이수미 전북대학교 일반대학원 2020 국내석사

젤란검은 높은 함량의 물을 가지며 자연 유래 세포외기질과 유사하여 결손된 조직을 재생하기 위한 연골 조직공학 재료로 널리 사용되어진다. 그럼에도 불구하고, 젤란검 자체는 세포 접착 부위가 불충분하여 세포가 생존하고 증식할 수 있는 충분한 생물학적 환경을 제공하지 못한다. 따라서 이 연구에서는 젤란검을 글리콜 키토산과 물리적으로 블렌딩하여 연골 조직 공학에 적용 할 젤란검의 기계적 특성 및 미세 환경을 향상시켰다. 물리 화학적 연구는 형태학적 연구, 팽윤 비율, 중량 감소 및 졸 분율로 수행되었다. 기계적 특성 분석은 연골 조직 공학 재료의 가용성을 확인하기 위해 압축 테스트 및 유변학적 연구가 수행되었다. 또한, 하이드로겔의 개선된 마이크로환경을 확인하기 위해 형태 연구, 생체적합성, 세포 생존력 및 세포 독성, 생화학 분석, 유전자 발현 및 조직학적 연구와 같은 체외 연구를 수행하였다. 전체 결과에서 적절한 양의 글리콜 키토산의 첨가는 기계적 및 생물학적 특성을 개선시켰고 물질의 생체적합성 및 연골재생이 향상된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 젤란검/글리콜 키토산 하이드로겔은 연골 조직 공학의 재료로써의 가능성을 확인하였고 잠재적 재료가 될 것으로 기대된다. Gellan gum has a high content of water and is similar to natural-derived extracellular matrix (ECM), and is widely used as a cartilage tissue engineering material to regenerate defective tissue. Nevertheless, gellan gum itself has insufficient cell adhesion sites and does not provide a sufficient biological environment for cells to survive and proliferate. Therefore, in this study, gellan gum was physically blended with glycol chitosan to improve the mechanical properties and microenvironment of gellan gum to be applied to cartilage tissue engineering. The physicochemical studies were conducted with morphological studies, swelling ratio, weight loss and sol fraction. Mechanical properties analysis was carried out by compression tests and rheological studies to confirm the availability of cartilage tissue engineering materials. In addition, in vitro studies such as morphology studies, biocompatibility, cell viability and cytotoxicity, biochemical analysis, gene expression and histological studies were conducted to confirm the improved microenvironment of the hydrogel. From the overall results, it was confirmed that the addition of an appropriate amount of glycol chitosan improved mechanical and biological properties, and improved biocompatibility and cartilage regeneration of the material. Therefore, gellan gum/ glycol chitosan hydrogel has been confirmed as a potential material for cartilage tissue engineering and is expected to be potential materials.

약물전달시스템 및 조직공학용 천연/합성 고분자 복합소재 응용에 관한 연구

정준재 전북대학교 일반대학원 2020 국내박사

약물전달시스템은 기존 존재하던 약물을 이용하여 낮은 부작용과 효율적인 응용으로 배합을 통한 효율 증대, 장기, 조직, 세포에 약물을 전달하기 위한 제형 개발, 신약개발 비용 대비 큰 효율의 장점이 있다. 약물전달시스템은 경구, 경피, 주사, 점막, 이식 등 다양한 방법으로 환자에게 적용되고 있다. 조직공학은 조직 및 장기의 기능 상실 또는 손상을 치료하기 위해 생체조직의 대체품을 만들어 이식함으로써 생체기능의 유지, 복원, 향상을 목적으로 한다. 생체조직의 대체품은 천연고분자와 합성 고분자를 이용한 천연/합성 고분자 복합소재가 주목받고 있다. 천연/합성 고분자 복합소재는 천연 물질에서 유래한 천연고분자와 폴리에스터 계열의 생분해성 고분자를 융합한 것으로 인체 내에서 면역거부 반응이 없고 안정적인 기계적 강도를 가지며 질병 진단 및 치료, 질병이나 사고로 손상된 신체의 부위를 대체하는 목적으로 사용된다. 본 연구는 약물전달시스템 및 조직공학에서의 천연/합성 고분자 복합소재의 응용을 확인하고자 빠른 약물 방출 거동을 보이는 속방정과 젤라틴 기반의 캡슐제, 형광을 가지는 지지체를 제조하여 천연/합성 고분자 복합소재의 응용에 관한 연구를 실시하였다. 속방정은 니자티딘을 모델 약물로 선정하고 젖당과 미결정 셀룰로오스를 천연/합성 고분자로 이용하여 고체분산체를 제작하였고, 캡슐제는 쿠에티아핀 푸마르산을 모델 약물로 선정하고 천연고분자인 젤라틴 캡슐과 폴리비닐피롤리돈 그리고 셀룰로오스 계열의 HPMC를 천연/합성 고분자를 이용하여 습식과립을 통해 과립을 제조하였으며, 지지체는 천연고분자인 젤란검과 형광을 가지는 합성 고분자인 FITC를 이용하여 약물전달시스템 및 조직공학에서의 천연/합성 고분자 복합소재의 응용에 관한 연구를 진행하였다. 고체분산체와 과립의 구조학적, 형태학적, 결정학적, 열적 특성 분석, 약물 방출 거동을 평가하기 위해 FTIR, SEM, XRD, DSC, 생체 외 방출 거동, HPLC를 실시하였으며, 지지체의 물리적 특성평가 및 생체 내 평가를 위해 팽윤도, 분해도, MTT 등을 실시하였다. 또한, 조직학적 염색을 통해 염증 반응을 평가하였다. 실험 결과 니자티딘과 젖당, 미결정 셀룰로오스를 이용한 속방정과 쿠에티아핀 푸마르산, HPMC, 폴리비닐피롤리돈 그리고 젤라틴 기반의 캡슐을 이용한 캡슐은 경구 약제학적 이상적인 약물 방출 거동을 확인할 수 있었고, 천연고분자인 젤란검과 형광을 가지는 지지체는 우수한 생체 적합성과 세포 증식 및 우수한 기계적 물성을 확인할 수 있었다. 천연/합성 고분자를 이용한 이번 연구를 통해서 약물전달시스템 및 조직공학에서 속방정 및 캡슐, 형광을 가지는 지지체의 응용 가능성을 제시할 수 있으며 이와 더불어 천연/합성 고분자 복합소재는 각 분야에서 다양한 방법으로 응용될 것이라 사료된다.

치주조직공학의 현황

이지선 서울대학교 치의학대학원 2012 국내석사

1. 연구목적 본 연구의 목적은 기존에 발표된 연구논문들의 고찰을 통해 치주조직의 재생과 수복을 위한 치주조직공학에 대한 현황파악에 초점을 맞춰 조직 재생 기술을 점검해보고 최근의 기술적인 진보에 기초하여 치주조직공학의 연구 방향을 논의하는데 있다. 2. 연구대상 및 방법 PubMed를 통하여 치주조직공학의 연구 결과와 무작위 대조군 연구(randomized controlled trial), 체계적 검토 연구(systematic review) 등에 대한 검색을 바탕으로 치주조직공학의 현주소를 파악하고, 조직공학(tissue engineering), 유전자 치료(gene therapy) 등의 분야에서 진행되고 있는 연구를 통하여 치주조직공학의 앞으로의 연구과제와 나아가야 할 방향에 대하여 고찰하였다. 3. 연구결과 치주조직공학의 목표는 전통적인 방법으로는 치유될 수 없었던 치주질환을 치유할 수 있는 새로운 임상적 적용 방법을 확립하는 것이다. 적절한 세포 원천을 확립하고 가장 적합한 생체 재료를 개발해내고 세포가 증식하고 분화할 수 있는 3차원적인 환경을 만들어내기 위한 요소 등은 앞으로 더 많은 연구가 진행되어야 하지만, 치주조직의 재생 치료를 위한 조직공학은 계속 성장해오고 있고, 점차 그 분야를 확장하고 있다. 이미 상용화된 성장인자가 임상적으로 이용되고 있으며, PDGF, FGF-2, PRP등을 임상적으로 적용시키기 위한 연구가 활발히 진행 중이다. 치주재생치료에 레이저를 이용하려는 시도도 계속되고 있지만, 그것의 임상적인 적용은 아직 연구가 필요하다고 하겠다. 4. 결 론 치주조직의 재생을 위한 치주조직공학은 임상적으로 성과를 거두고 있지만, 그러한 성과는 골연하 결손부와 같은 한정적인 조건에서 가능한 것으로 보다 폭넓은 적용을 위해서 많은 연구가 진행되고 있다. 1. Objective This review focused on analysis of current status of periodontal tissue engineering is to discuss future possibilities associated with periodontal tissue regeneration based on recent technical advances. 2. Methods Studies dealing with effect and outcome, randomized controlled trial, systematic review of periodontal tissue engineering were searched through PubMed. By data abstraction and quality assessment, current periodontal tissue engineering was evaluated. Also, future challenges of this field was presented by analyzing current periodontal tissue regeneration technique. 3. Results The purpose of periodontal tissue engineering is to establish new clinical approaches to relieve peridontal disease that could have not resolved through traditional therapy. With recent advances in periodontal tissue engineering, we have been closer to the expectation of periodontal tissue regeneration in aspect of molecular biology. Researchers should pay attention to establishment of the optimal cell source, development of the most proper biomaterials, and reliable ways of expanding those cells in a three dimensional environment. Commercialized growth factor has been used, and researches for clinical application of PDGF, FGF-2, and PRP has been continued actively. Although researchers continued their efforts to use laser for periodontal regeneration therapy, more studies on its clinical application are under consideration. 4. Conclusion Periodontal engineering for periodontal tissue regeneration has been achieved the clinical outcomes, but they has been available in limited conditions such as infrabony defect. Therefore researchers are studying for wide applicability.

주사 주입이 가능한 조직공학용 생분해성 다공성 비드의 제조 및 분석에 관한 연구

이효정 韓南大學校 大學院 2006 국내석사

매년 전 세계적으로 돌발적인 사고나 질병으로 인하여 인체의 장기나 기관이 손상된 경우 장기이식의 방법이 사용되고 있으나, 필요한 장기의 수요에 비해 공급이 턱없이 부족한 실정이다. 따라서 인체의 장기나 기관을 인위적으로 재생시켜 장기부족 현상을 해결하고자 하는 학문이 바로 조직공학이다. 조직공학에서 인체조직의 재생을 위해 사용되는 기질 또는 지지체의 재료는 체내에 이식된 후에 주위 조직과 융화가 잘 되어야 하며 염증 반응이 없고 일정 기간이 지난 후 스스로 분해하여 이물질로 남지 않는 우수한 생체적합성을 가져야 한다. 또한 이러한 생분해성 다공성 지지체는 세포의 부착성이 우수하고 영양분과 산소의 공급이 원활하며 대사물질이 쉽게 제거될 수 있는 다공 구조를 지녀야 한다. 그러나 생분해성 고분자를 이용하여 3차원적 디스크형의 다공성 고분자 지지체를 제조하여 실험실적으로 세포배양을 할 경우 가장 큰 문제점은 고분자 지지체의 내부까지 배양액의 확산이 순조롭지 못하여 지지체 내부의 세포의 괴사를 일으킬 뿐만 아니라 실질적으로 환자에게 시술시 힘든 외과수술이 필수적이라는 점이다. 이에 반해 다공성 비드를 제조하여 세포 배양을 할 경우 배양액의 확산이 순조롭기 때문에 세포의 괴사를 막아주고 표면적이 커서 산소와 영양분의 공급이 원활하며, 환자에게 시술시 간단하게 몸 안에 주입할 수 있으므로 인위적인 외과수술을 수반하지 않아도 되며, 시술시간이 단축된다. 이 같은 장점으로 인해 조직 공학적 기능성 지지체로써의 다공성 비드에 관한 연구가 여러 기관에서 활발히 이루어지고 있는 실정이지만 현재까지 높은 다공도를 지니면서 다공이 균일하며 비드 및 다공 크기 조절이 가능한 다공성 비드가 제조되지 못하고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 높은 다공도를 지니면서 다공이 균일하고 다공 크기 조절이 가능하며 독성을 나타내지 않는 생체적합성을 지니는 다공성 비드를 제조하고. 이를 이용하여 다공성 지지체의 형태, 다공 크기, 세포 점착 단백질의 흡착에 따른 세포 점착 및 증식 거동과 조직적합성을 체계적으로 조사·비교하였다. 다공성 지지체의 형태에 따른 in vitro 세포배양 실험에서는 예상했듯이 3차원적 디스크형의 다공성 지지체보다 다공성 비드에서 세포 증식이 활발한 것을 확인하였으며, 다공 크기에 따른 in vitro 세포배양 실험에서는 세포 배양 초기에는 다공 크기가 작은 다공성 비드에서 세포의 증식이 좀 더 활발하나, 세포 배양 7일 이후부터는 다공 크기가 큰 다공성 비드에서 세포의 증식이 좀 더 활발한 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포 점착 단백질의 흡착에 따른 in vitro 및 in vivo 실험 결과, 콜라겐 코팅을 한 다공성 비드와 콜라겐 코팅을 하지 않은 다공성 비드 모두 세포 및 조직들이 고루 분포되어 잘 성장하는 것을 관찰할 수 있었다. 상기의 연구로부터 본 연구에서 제조되어진 주사주입이 가능한 생분해성 다공성 비드가 조직 공학적 기능성 지지체로써 훌륭한 후보재료가 될 수 있을 것으로 기대된다. Tissue engineering is an interdisciplinary field that applies the principles of engineering and life sciences to the development of biological substitutes thar restore, maintain or improve tissue function. Porous, biodegradable polymer scaffolds have been extensively utilized as temporal templates for regeneration of various tissues. A highly open porous structure with cell inter-connected pores is required not only to achieve sufficient in- and out-transport of nutrients and oxygen for subsequent cell proliferation and differentiation. Beads shaped supports have advantages over 3-dimensional scaffolds in that they impose fewer limitations on diffusional flow and are more favorable to the neovascularization. Microbeads also have a significant advantage, since they may be administered by injection, thus, as in the case of reflux, reducing the surgical reimplantation operation to an endoscopic treatment that is quicker, more comfortable for the patient and cheaper. The porous beads have been prepared by various methods including w/o/w emulsion solvent extraction/evaporation, freezing and lyophilizing, and incorporating gas pocket. However, their low and heterogeneous porosity, small pore size, difficulty of pore size control, and residual organic solvents are still remained as some limitations. To overcome these problems, we fabricated pore size controllable, injectable porous beads by combining phase separation (for nonporous bead fabrication) and melt-molding particulate leaching (for porous bead fabrication) methods. The various microbeads with easily injectable sizes and pore sizes fabricated in this study can be utilized for in vitro cell culture and in vivo animal study. From the in vitro cell culture, it was observed that the porous beads showed better cell growth than the porous 3-D scaffold, probably due to easy medium diffusion and higher surface area. The porous beads with 25-50μm pore size showed better cell growth behavior than those with 50-100μm until 7days, probably owing to their higher surface area. However, the porous beads with 50-100μm pore size showed better cell growth after 14days. From the in vitro cell culture and in vivo animal study, it was observation that the collagen coated porous beads showed better cell growth behavior than those with non-collagen coated porous beads. From the results, we recognized that the porous beads can be widely applicable as injectable cell carriers for tissue engineering applications.

전기방사 나노섬유의 제조와 조직공학 응용 동향에 대한 문헌 고찰

유슬미 서울대학교 치의학대학원 2015 국내석사

20세기가 컴퓨터와 유전공학, 신소재 기술 개발 등이 주를 이루는 신제어 기술의 시대였다고 한다면, 21세기는 10억분의 1 이하의 나노 기술이 열어가는 나노마이크로 시대라 할 것이다. 이번 연구는 여러 가지 나노섬유 제조기법 중 현재 가장 많이 사용되고 있는 전기방사 공정 기술과 나노섬유 소재의 활용에 힘입은 의학 및 치의학 분야의 변화 및 발전을 살펴보고자 한다. 특히, 결손된 조직의 대체 및 재생의 조직공학적 측면을 탐구해본다. 전기방사법으로 제조된 나노섬유는 극세직경, 큰 표면적비, 공극률 등의 장점을 가진다. 지금까지 전기방사법을 사용하여 나노섬유 제작에 성공을 거둔 폴리머는 약 100여종에 이르며, 폴리머뿐만 아니라 무기물 및 탄소섬유 제작도 가능하다. 전기방사로 제작되는 나노섬유의 물성은 공정 변수 및 물성 변수 등 약 15개의 인자에 의해 조절된다. 전기방사 나노섬유 지지체는 생체의 세포외기질(Extracellulaar matrix)과 그 물리적 성질이 유사하며, 표면적 대 부피비가 크고, 적당한 기공률 공정기법상 여러 가지 물리적 성질을 정확히 조절하고 제어하는 것이 가능하다. 또한 물질조성, 공정조건 변형, 방사 후 처리나 통해서도 섬유 및 지지체의 물성을 변화시킬 수 있다는 특징을 가지고 있다. 따라서 전기방사법으로 제작된 나노섬유는 세포의 부착 · 침투 · 증식에 알맞은 물성을 가질 수 있으며, 특히 세포 및 성장인자의 발육과 전달에 알맞아 최근 조직공학 및 재생 분야에 전략적으로 다가갈 수 있는 연구의 토대가 되고 있다. 이외에 전기방사 나노섬유는 표면 및 막 처리 기술, 전기전도성을 부여한 성공적인 전극재료, 열광전지용 발현체, 촉매 담체, 센서 등 여러 분야에서 그 활용성과 발전가능성을 인정받고 있는 재료 중 하나이다. 앞에서 요약한 것처럼 전기방사 나노섬유의 용도 및 그 활용은 다양한 분야에서 수도 없이 많은 성공적인 결과들을 낳았으나, 아직도 그 제조공정 및 응용기술의 개선점과 미개척 분야는 많이 남아 있는 실정이다. 많은 연구와 실험이 행해졌으나 제조공정 기술 분야에서는 2차원적 섬유 및 지지체를 최종 산물로 얻어내는 기술 및 사후 방출 기술에서의 분자-입자 결합 기술은 앞으로 더욱 더 보완되어야 할 측면이다. 또한 약물전달 시스템 및 단백질인자와 유전자의 조절 방출은 생체 시스템에 더욱 적합하고 특별한 설계가 요구된다.

Evaluation of functions and tissue compatibility of Poly (D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) for tissue engineering applications : 조직공학적 응용을 위한 Poly (D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA)의 성능과 조직적합성 평가

양원선 The Graduate School, Yonsei University 2003 국내박사

본 연구는 두 가지로 나뉘어 진행되었다. Part I에서는 poly (D,L-lactic -co-glycolic acid) (PLGA)와 인체유래 진피 섬유아세포의 복합체의 성능과 조직적합성을 평가하였다. Part II에서는 조직공학에서의 응용을 위해 TiO_(2)를 코팅한 PLGA 필름을 개발하고 이를 평가하였다. Part I : 조직공학과 상처 치유에 이용되는 생체재료는 세포의 성장과 조직형성을 물리·기계적으로 지지해 주어야 한다. 일반적으로, 조직공학에 이용되는 생체재료는 콜라겐, 알지네이트와 같은 천연재료와 bladder submucosa와 small-intestinal submucosa와 같은 세포가 없는 매트릭스, 마지막으로 polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), PLGA와 같은 합성 고분자로 나뉜다. 진피 대체물은 손상부위에 세포가 이동하도록 안내하는 역할을 해주어야 하고, 섬유아세포와 같은 진피조직의 세포에 대한 지지체로서의 기능을 해야 하며, 세포외기질들의 합성을 도울 수 있어야 한다. 손상부위에 잘 부착할 수 있어야 하고, 그 부위의 방어 기작과 상처치유에 도움을 주어야 하며, 탄력성과 항구성을 가져야 한다. 미적으로도 인간피부와 비슷한 형태를 나타낼 수 있는 성장력을 가져야 한다. 본 연구에서는 이전 연구에 근거하여, 3차원 다공성 PLGA 65/35를 선별하여 조직공학적 진피 대체물인 인체유래 진피 섬유아세포와 PLGA와의 복합체를 만든 후 이 복합체의 성능과 조직적합성을 평가하였다. 이를 위해, RT-PCR을 이용한 유전자 레벨에서의 제 1형 교원질을 확인하였고, 단백질 레벨에서의 교원질을 정량하였다. H & E 염색을 통하여 PLGA에서의 세포의 모양과 분포를 확인하였고, 면역조직화학 염색을 통하여 제 1형 교원질의 발현과 분포를 확인하였다. Part II : 플라즈마 기술은 재료의 표면을 원하는 대로 쉽게 변형 시킬 수 있어 생체재료의 세포 친수성을 증가시키기 위해 이용되고 있다. 또한, 플라즈마 처리를 통해 고분자 재료를 물리·기계적 특성의 변화 없이 대량으로 변형시킬 수 있다. 세포 친수성은 조직공학 분야에서 세포 지지체로서 이용되고 있는 PLGA와 같은 생분해성 고분자에 있어서 매우 중요한 요소이다. 본 연구에서는 PLGA 표면과 세포와의 상호작용을 증진시키기 위해 PLGA 표면에 magnetron sputtering 방법으로 TiO_(2)를 코팅하였다. PLGA 표면의 변화는 contact angle과 X-ray photoelectron spectroscopy (XPS)로 확인하였다. 세포 부착과 생장은 MTT와 scanning electron microsopy (SEM)으로 확인하였다. TiO_(2) 코팅된 PLGA 필름은 코팅이 안된 PLGA에 비해서 친수성으로 변하였고 세포 부착과 생장이 더 증가하였음을 확인 할 수 있었다. 또한, macrophage를 이용한 실험에서도 코팅되지 않은 PLGA와 비슷한 부착력을 확인 할 수 있었다. 따라서, TiO_(2) 코팅된 PLGA는 생체 적합한 세포 지지체로서의 응용 가능성이 있음을 확인 하였다. This study is divided into two categories. In part one, functions and tissue compatibility were evaluated in a composite of fibroblasts and poly (D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffold. In part two, TiO_(2)-coated PLGA film was developed and evaluated for tissue engineering. Part I : In tissue engineering and wound-healing applications, scaffold materials are utilized to provide a mechanical support for cell growth and tissue formation. Generally, three classes of biomaterials have been used for engineering of genitourinary tissues: naturally derived materials (e.g., collagen and alginate), acellular tissue matrices (e.g. bladder submucosa and small-intestinal submucosa), and synthetic polymers [e.g., polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)]. A dermal substitute should function as a guide for cells moving into the repair area, and serve as a scaffold for cells such as fibroblasts, and help synthesize extracellular matrix (ECM) components. It must adhere to the wound bed, support local defense mechanisms and wound healing. It must be elastic and have long-term durability and growth potential similar to human skin with good aesthetic quality. On the basis of previous study, we selected a three dimensional porous PLGA 65/35 and made composites of PLGA and human dermal fibroblast. The aim of this study is to develop the evaluation methods of function and tissue compatibility for tissue engineered dermal substitute. This study was focused on the functional analysis and tissue compatibility of artificial dermal substitute. The experiments were performed and confirmed at a level of gene expression (RT-PCR), protein expression (total collagen quantities) and histological analysis. Part II : Plasma technique can easily be used to introduce the desired functional groups or chains onto the surface of materials, so it has a special application to improve the cell affinity of scaffolds. Additionally, it has been demonstrated that plasma treatment is a unique and powerful method for modifying polymeric materials without altering their bulk properties. Cell affinity is the most important factor to be concerned with when biodegradable polymeric materials such as PLGA are utilized as a cell scaffold in tissue engineering. Therefore, in order to improve PLGA surface/cells interaction, we modified PLGA surface with TiO_(2) using magnetron sputtering method. The changes of their surface properties have been characterized by means of contact angle measurement and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). To confirm cell attachment and proliferation, MTT assay and scanning electron microscopy (SEM) were carried out. The results indicate TiO_(2)-coated PLGA film became hydrophilic and enhanced cell affinity and proliferation. We expect TiO_(2)-coated PLGA matrix can be a candidate for cell scaffolds in tissue engineering.

조직공학을 이용한 손상된 척추 신경의 기능적 복원

신유나 전북대학교 대학원 2008 국내석사

Regeneration of spinal cord using bone marrow stromal stem cell Bone marrow stromal stem cells (BMSCs) are widely known as a source of stem-like and progenitor cells. When BMSCs was transplanted into the normal animal central nervous systems, the cells are able to differentiate into neuronal cells. We tested experiment based on our assumption that transplantation of BMSCs into the spinal cord after a severe cord injury. Fabrication of nerve guidance channeled poly (L-lactide - co- glycolide) (75:25 by mole ratio of lactide to glycolide, PLGA) scaffold performed by ice-particle leaching method. It investigated as potential guidance channel. BMSCs were harvested from the femurs and tibias of adult female Fischer rats. BMSCs were suspended at 2 x 10^(6) cells/scaffold in PLGA scaffold with 200 ngBDNF. Fischer rats with the hiatus (T8-T9 : 5 mm, 3 mm ,1 mm and Cutting) created through the spinal cord resection were implanted by the PLGA scaffold consisting of BMSCs and BDNF. For histological evaluation, the implants were removed after 4 and 8 weeks. Thin sections were cut from paraffin embedded tissue and histological section were stained by hematoxylin and eosin (H&E) staining. Tissue slides also stained by immunohistochemical staining for neurofilament (NF), neuro-specific enolase (NSE). We measured the movement of regeneration of spinal cord using Basso-Beattie-Bresnehan Score and Motor Evoked Potentional (MEP) performed weekly up to 8 weeks post-injury. The BBB locomotor rating score measured in the four groups up to 8 weeks after a transaction. MEP designed a high-voltage transcranial electrical stimulator that exited motor cortex using electrode which were placed over the scalp. Histological examination confirmed the appearance of neural tissue in a group, which consists of PLGA scaffold with BMSCs and BDNF. Although the laminar organization observed in the native was lost, we were observed in the regenerated tissue. Preparation and Release profile of BDNF-loaded PLGA Scaffold Recently, brain-derived neurotrophicfactor (BDNF) is known for a protein that can induce the neuron. BDNF is a kind of neurotrophin family of proteins which have roles in regulating the existence, growth and differentiation of neurons within the developing nervous system. The goal of this study was to investigate release tendency of BDNF’s quality. A biodegradable and porous poly (L-lactide-co-glycolide) (75:25 by mole ratio of lactide to glycolide, PLGA) scaffold has been suggested for the application to cytokine carrier and tissue engineering. The brain-derived neurotrophic factor (BDNF) loaded PLGA scaffolds. The scaffold made by ice-particle leaching method and purpose of using this method was controlled release within porous polymer scaffold. The release amount of BDNF from BDNF loaded PLGA scaffold were observed for 4 weeks period in vitroat phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 at 37 ℃ incubator and the release amount of BDNF loaded in PLGA analyzed enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). It can be observed the open cell pore structure of porous scaffold and can be easily controlled the pore structure by the controlling of formulation factors resulting in the controlling of the release rate and the release period. The stability of BDNF during the preparation of PLGA scaffold was evaluated by comparing the released amount of total BDNF, assayed BDNF by ELISA. These results suggest that the released BDNF from BDNF loaded PLGA scaffold such as conduit type can be very useful for the nerve regeneration in the neural tissue engineering area. Prepared PLGA scaffold had definite porosity and amount of release increased with high content of BDNF. Also we observed that BDNF loaded in PLGA scaffolds had faster initial burst. In our study, these results propose that the released BDNF from BDNF loaded in PLGA scaffolds can regulate and controlled release for tissue engineering. Characterization of PLGA scaffold with SIS Tissue engineering holds great promise as away to repair and regenerate defectiveof damaged tissues and organs. Tissue engineering consists of three components: cells, scaffolds, and growth factors. From among these, the biomaterials that serve as scaffold substrates play a central role. The goal of this study was to investigate characterization of PLGA scaffold impregnated SIS for apply to tissue engineered spinal cord regeneration. PLGA is known for biodegradable, biocompatible polymer. SIS also has widely used as biocompatible material with minimum immune response and contains lots of variety of cytokines such as collagen and glycosaminoglycan. It was explored that the most suitable content of SIS to include in PLGA scaffold and the property of fabricated scaffolds by analyzing degradation behavior and cell proliferation in vitro. Molecular weight of used PLGA was 90,000 g/mol and SIS was isolated from pig’s jejunum and was pulverized by freezer mill. SIS powder was impregnated in PLGA scaffold to 0, 10 and 20% of weight of PLGA. The scaffold was fabricated by ice particle leaching method using 180 ~ 250㎛ size of ice particle. The porosity of these scaffolds wasexamined by mercury porosimetry. We observed morphology of scaffold by SEM. The degradation behavior of PLGA/SIS scaffold examined in 37℃ shaking incubator for 7 weeks under phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4). Variation of pH and weight with degradation were analyzed by pH meter. The changed molecular weight of scaffold was measured by GPC. Morphology of cells on the scaffolds was analyzed by fluorescent microscope. BMSCs were harvested from the femurs and tibias of adult female Fischer rats and cultured in Dulbeco's modified Eagle's mediumsupplemented with 10% fetal bovine serum and penicilline-streptomycine. We seeded 3 × 10⁴ cells of BMSCs in each scaffold. MTT assay carried out for the cell viability in PLGA/SIS. We confirmed that fabricated PLGA/SIS scaffold consisted of pores up to 95% and size of pores was uniformed. The morphology of the PLGA/SIS scaffold showed formation of interconnected and uniformed pores by SEM. We observed decrease of scaffold weight following to decrease of pH. The result of GPC showed that molecular weightdiminished with time. Cytotoxicity in PLGA scaffold with 10% SIS powder was better than PLGA scaffold contained 20% SIS and only PLGA scaffold. In these results indicate that the PLGA/SIS scaffold can be veryuseful for application in the tissue engineered spinal cord regeneration. This experiment progressedPLGA/SIS for regeneration of spinal cord injury. Through result of this study, physical property and cell viability was high in scaffold contained 10% SIS. Regeneration of spinal cord should follow axons regeneration. Current result could expect that the scaffold by ice particle leaching method contained 10% SIS suitable to nerve guidance channel. In addition, it might be secreting substance from SIS helps BMSC get into neuron cell and axons regrowth. It is progressing that experiment on neurogenesis of BMSC in PLGA/SIS in vitro, and implantation of PLGA/SIS seeded BMSCs in vivo. AdehesionBehaviorofHumanBoneMarrow StromalCells Adehesion Behavior of Human Bone Marrow Stromal Cells on a Wettable Polyethylene Surface Tissue engineering has the potential to revolutionize reconstructive surgery through the provision of engineeredtissues and organs. Tissue engineering consists of three components: cells, scaffolds, andgrowth factors. From among these, tissue-engineered construct that serve as scaffolds such as the adhesion and proliferation of cell to implanted surface depend on the surface characteristics. In this study, we investigated how human bone marrow stromal cells (hBMSCs) respond to surface property of scaffolds. We prepared modified low density polyethylene (LDPE) surfaces by treatment of radio frequency corona discharge, which gradually oxidizes the LDPE surface. As the surface wettability increased, that is moderate hydrophobic positions. The modified PE surfaces were characterized by measuring the static water contact angle. The viability of cells on PE films was characterized by MTT assay. And Cells adhered, oriented and grown on the microgrooved surfaces were observed by scanning electron microscope (SEM) and Optical microscope. In conclusion, these results indicate that the biological signals induced by cell adhesion depend on the wettability of the surface to which the cells attach.

토끼 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell)의 분화유도를 통한 생체조직공학적 인공연골 제작 연구

박형근 아주대학교 대학원 2002 국내석사

연골조직의 제작에는 이미 분화된 연골세포나 미분화 상태인 줄기세포가 이용될 수 있다. 연골세포는 필요한 세포수를 위한 장기간 단충배양 시 연골세포 고유의 표현형을 잃어버리는 단점이 있어서, 다양한 조직으로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포를 생체조직공학적 기법을 이용하여 인골조직으로 분화 시켜 제작해보았다. 중량이 500g인 토끼 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하여 PGA mesh에 고밀도 정적접종하고 in vitro에서 조건에 따라 TGF-β3를 첨가하여 1주간 전처리배양 후 누드마우스에 이식하여 1, 2, 3, 4, 8, 그리고 12주 후 생성된 조직을 회수하여 조직학적 검사와 면역조직화학적 검사를 통하여 뼈와 연골의 분화와 생성정도를 관찰하였다. TGF-β3를 첨가하여 전처리배양 한 조건에서 연골화 분화가 빨리 시작되었고, 시간이 지날수록 연골이 뼈 조직으로 분화되는 정도도 빨라졌다. 그러나 12주 후에는 조건에 관계없이 모두 완전한 뼈로 분화되었다. 결론적으로 in vivo 환경에서 중간엽 줄기세포는 연골을 거쳐 뼈로 분화하는 기전을 거치고 있으며 TGF-β3의 전처리는 그 분화 과정을 촉진하는 것으로 생각된다. Differentiated chondrocytes and undifferentiated stem cells could be used in the manufacturing of cartilage. As chondrocytes have disadvantage such as loss of chondrogenic phenotype in long term monolayer culture, cartilage was manufactured by using tissue engineering of mesenchymal stem cell (MSC) which can differentiate into variety of cell types. MSC was isolated and cultured from the rabbit weighing 500g, and it was seeded into PGA mesh and pre-cultured for 1 week with different TGF-β3 treated conditions. It was implanted into nude mice and tissues generated were recovered from 1, 2, 3, 4, 8 ,and 12 weeks respectively. Degree of bone and cartilage formation was analyzed with histology and immunohistochemistry assay. Pre-culture condition with TGF-β3 treatment showed early start of chondrogenic differentiation, and degree of bone and cartilage formation was promoted as time passed. But both of the cases differentiated into complete bone after 12 weeks. The results show that pretreatment of TGF-β3 promotes the differentiation process in vivo condition under the in vivo system where MSC differentiate into bone via cartilage formation.

조직공학기법을 이용한 바이오치주인대 개발에 관한 연구

韓美靜 동국대학교 2008 국내석사

Periodontal disease is a most serious oral disease developed in all age group of the whole world, and the object of the healing is a regeneration of the damage of tissues such as alveolar bone, periodontal ligament, cementum. Recently the bone graft and guided tissue regeneration (GTR) have been used for the reconstruction of periodontal tissues. I progressed this study using tissue engineering for regeneration of the alveolar bone and periodontal ligament. A lot of studies using periodontal ligament cells (PDLCs) have been reported, but dental pulp stem cells (DPSCs) that have less possibility of contamination at the primary culture is considered as a good cell source more and more, so I used DPSCs in this study. DPSCs from the tooth are adult stem cells which can differentiate into various cells at the specialization environment. It may include scaffolds providing the extracellular matrix, and special differentiation medium containing growth factors, cytokines and appropriate mechanical stimulation to differentiate DPSCs into the cells of another tissue. Also, a lot of DPSCs are necessary to be used in cell therapy, so the cells must be tremendously expanded in a short time. Therefore, I used some growth factors to promote proliferation of DPSCs, but lineage-specific differentiation condition is strongly necessary because of their multi-differentiation capacity into another cells such as osteoblast, chondrocyte, adipocyte during culture. So, I used basal medium (α-MEM) to proliferate DPSCs and made a osteogenic differentiation medium which consists of the basal medium and supplements, dexamethasone, β-glycerophosphate, and ascorbic acid to differentiate into osteoblasts. Also, chemical factors and mechanical factors play an important role in cell proliferation or differentiation. Therefore, I considered not only chemical factors but also mechanical factors to differentiate DPSCs into osteoblasts. In this study I tried to find the effect of mechanical stimulus on the differentiation of DPSCs into osteoblasts using a cell training bioreactor and flexwell system imposing cyclic mechanical strain whose parameters were 0.03 Hz, 5%, 8% strain or 0.2 Hz, 10% strain. As a result, DPSCs under cyclic strain showed more regularly oriented alignment and lower expression of CD90 and CD105 than control by microscopy and FACS analysis. In transcriptional level, type I collagen, type Ⅲ collagen, bone sialoprotein, osteocalcin, osteonectin, osteoprotegerin mRNA expressions of DPSCs under cyclic strain were higher than those of control. In that, it is thought that mechanical cyclic strain induced the loss of stemness of DPSCs, therefore improved the differentiation into osteoblasts.. In the experiment using scaffold, I made bio-scaffolds that can improve the differentiation into alveolar bone using BMP-2, hyaluronic acid and hydroxyapatite. As a result, it is found that the bio-scaffold containing three components at appropriate concentration was superior to the other bio-scaffolds in alveolar bone regeneration. In conclusion, DPSCs under optimal growth factors/cytokines and mechanical stimulation could differentiate into osteoblasts and also these cells with special bio-scaffold could reconstruct alveolar bone in vitro and in vivo. In the future, DPSCs and the bio-scaffold will be useful in the alveolar bone regeneration as well as ligament regeneration. 치주질환은 전 세계인종의 전 연령층에 이환되는 가장 심각한 구강질환의 하나이며, 치주치료의 궁극적인 목표는 치조골, 치주인대, 백악질 등 파괴된 조직의 재생에 있다. 오늘날 대부분 치주조직의 재생을 위해서 골이식술과 치주조직유도 재생술이 시행되고 있는데, 본 연구에서는 조직공학적 기법을 이용하여 치조골과 치주인대 재건을 목표로 연구가 진행되었다. 주로 치주인대 세포를 이용한 연구가 많이 이루어져왔으나, 일차 배양시 훨씬 오염의 가능성이 적은 치수세포가 좋은 세포원으로써 점점 사용되어지고 있으며, 본 연구에서도 치수세포를 사용하였다. 치아 내에 존재하는 치수세포는 다양한 stem cell의 하나로서 특별한 배양 및 분화 환경에서 다양한 세포로 분화할 수 있는 가능성을 지니고 있으며, 치수세포를 원하는 조직의 세포로 분화유도하기 위해서는 인체와 유사한 배양환경을 제공하는 스캐폴드, 분화에 필요한 성장인자 및 싸이토카인 등이 첨가된 특정 분화배지의 확립, 그리고 인대세포 분화유도를 위한 최적화된 기계적인 자극(응력/변형)을 주는 생물반응기 등을 모두 만족시켜야 한다. 또한 치수세포를 조직공학 및 세포치료에 이용하기 위해서는 많은 수의 세포가 필요하므로 단시간에 대량 배양되어야 한다. 치수세포의 증식을 촉진하기 위해 성장인자 등을 이용할 수 있으나 배양도중 골, 연골, 지방 등 다른 조직의 세포로 분화되는 문제점이 있어 본 연구에서는 기본 배지를 사용하여 세포 증식을 하였으며, 분화 시에는 다양한 첨가 물질을 첨가하여 분화배지를 제조하여 사용하였다. 세포 배양 시 화학적 요소뿐만 아니라 기계적 요소 또한 세포 반응에 중요한 역할을 한다. 그러므로 치수세포를 치조골세포로 분화시키기 위해서 화학적 요소뿐만 아니라 기계적 요소 또한 고려해야 한다. 먼저 기계적 자극이 세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포신축 훈련배양기를 이용한 결과 적정 분화배지 사용과 기계적 자극에서 치수세포의 분화에 효과적임을 확인하였다. 본 연구에서는 2차원 신축 훈련 배양기를 사용 시 0.03 Hz로 유사관련문헌들의 조건보다 낮은 주기 조건과 다양한 크기의 기계적 자극에서 치수세포의 증식과 골분화의 영향을 확인하였으며, 3차원 신축 훈련 배양기 사용 시에는 10%의 기계적 자극과 0.2 Hz의 주기에서 치수세포의 골분화능을 확인하였다. 다양한 assay방법과 골세포에 많이 발현하는 세포외기질인 제1형 콜라젠, 제 3형 콜라젠, 본시알로프로테인, 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 오스테오프로테게린 등의 mRNA 발현 및 조직검사를 통하여 적절한 기계적 자극에서 치수세포의 증식과 골분화능이 향상됨을 확인하였다. 골분화에 있어서 다양한 골분화 유도 물질 및 성장인자들은 중요한 역할을 하며, 배지 첨가물로서 또는 스캐폴드에 함유되어 많이 사용되어지고 있다. 본 연구에서는 BMP-2와 히아론산. 하이드록시아파타이트를 이용하여 치조골 분화에 보다 효과적인 바이오 치주인대용 복합스캐폴드를 제조하였다. 각 물질들의 골분화능은 이미 많은 연구들에서 알려져 왔으며, 본 연구에서는 물질들의 골분화 적정 농도를 찾아 하나의 복합 스캐폴드를 만드는데 목적을 두었다. 이러한 결과들은 다른 조직 및 장기의 세포도 적절한 기계적 자극이 주어진다면 체외에서 좀 더 효과적인 분화를 유도할 수 있을 것으로 판단되며, 치수세포를 이용한 바이오 치주인대용 복합 스캐폴드는 치주조직의 치료에 유용하게 이용될 것이다.