電子顯微鏡的 In situ hybridization 方法에 關한 硏究 : Human papillomavirus 와 Epsteinbarr virus를 對象으로

기근홍 全南大學校 1995 국내박사

분자생물학적 수기가 발달함에 따라 진단병리학이나 세포 발생학 분야에서 이를 응용하는 등 그 이용범위가 넓어지고 있다. 또한 광학현미경에서 시행되던 in situ hybridization(ISH로 약기함)이 전자현미경적 수준에서 시도되어 세포의 미세구조와 함께 DNA나 RNA의 정확한 국지화가 가능해졌다. 이러한 전자현미경적 ISH의 경우는 조직 절편의 제작과정이나 염색과정에서 선택되는 재료에 따라 그 결과에 많은 영향을 주게 된다. 이에 저자는 면역조직화학적 염색, 광학현미경적 ISH 그리고 연쇄중합반응(polymerase chain reaction)을 시행하여, human papillomavirus(HPV) 감염이 확인된 자궁경부의 편평세포암종과, Epstein-Barr virus(EBV)의 존재가 확인된 세포주를 대상으로 여러 방법에 따른 포매후 전자현미경적 in situ hybridization을 시행하고, 기존의 연구결과와 비교한 결과는 다음과 같다. 1. 조직을 0.2% glutaraldehyde와 4% paraformaldehyde 용액에 고정한 경우에 양성 황금과립의 부착이 많았다. 2. 포매제는 Unicryl resin과 Lowicryl K4M을 이용한 경우에만 양성결과를 얻을 수 있었으며, Epon에 포매된 조직에서는 반응을 볼 수 없었다. 그리고 Unicryl resin을 이용한 경우 조직 절편제작이 더 용이하였다. 3. 조직내의 단백을 제거할 목적으로 시행한 효소 처리에는 proteinase K, trypsin을 이용하였으며 모두 세포구조의 관찰이 용이하였다. 그러나 이들의 농도를 높이면 세포구조의 관찰이 용이하지 않았다. 4. DNA 변성 방법은 70% formamide와 standard saline citrate(SSC)의 혼합액, 0.5N sodium hydroxide 단독 사용, 0.5N sodium hydroxide와 SSC를 혼합한 경우로 시행하였으며 이들 모두에서 양성 결과를 얻을 수 있었으나 0.5N sodium hydroxide만을 사용한 경우 배경 염색이 적은 더 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 5. DNA탐색자의 hybridization은 온도와 반응 시간을 달리하였으나 차이는 발견하지 못하였고 37℃에서 1시간정도 반응시키는 것이 좋으리라 생각된다. 6. 황금과립은 핵질내에 광범위하게 산재하여 있었으며, 특히 핵막에 연한 부분과 핵질이 뭉쳐져 진한 부분에 많았다. 관찰되는 양상은 대개 소군집 형태이거나 구상으로 뭉쳐져 있는 형태가 많았다. 이상의 연구결과로 전자현미경적 in situ hybridization시 가장 좋은 결과를 얻으려면 0.2% glutaraldehyde-paraformaldehyde 용액으로 고정하고 unicryl로 포매한 조직을 1 ㎕/ml proteinase K로 처치하고 0.5N sodium hydroxide로 DNA를 변성시켜 각종 탐색자를 반응시킨다. 반응은 37℃에서 1시간정도 시키고 황금과립으로 부착시켜 관찰하면 각종 viral DNA를 인지할 수 있으며, 이를 응용한 진단병리학적 이용이 가능하리라 여겨진다. In situ hybridization has become a standard method for localizing DNA or RNA sequences in tissue or cell preparation. The technique developed in electron-microscopic level enable the precise subcellular localization. A method was developed for detection of specific viral DNA. We have tested various methods and technique to detect specific viral DNA through ISH at electron microscopic level. Postembedding method of ultrastructural ISH is developed and successfully applied for the detection of human papilloma-virus(HPV) type 16 in squamous cell cercinoma of the uterine cervix and Epstein Barr virus in EBV infected leukemia cell line. Following results are made. 1. The best results were obtained in 0.2% glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde fixed tissue or cell block. 2. The labelling was best observed on Unicryl resin and Lowicry K4M resin sections. Epon sections showed no reactivity. Thin section of Unicryl resin was more easier than Lowicry K4M resin. 3. Enzymatic predigestion with proteinase K, pepsin and trypsins gave good results. However, high concentration of these produce a poor results due to excessive destruction of cellular component. 4. Alkali treatment with 0.5N sodium hydroxide made successful results in denaturation of target DNA. 5. The labelling density of gold particles was independent on incubation time or temperature in hybridization step. 6. The viral DNA labelling was localized mainly within the nucleus, both within and at the edge of electron dense regions, and below the nuclear membrane. And the labelling was seen in the form of dense, roughly spherical shape. In conclusion, best results are obtained by the conditions that tissues fixed by 0.2% glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde solution, embedded with Unicryl resin, protein denaturation by 0.1 ㎕/ml proteinase K, DNA denaturation by 0.5N sodium hydroxide, and reaction with DNA probe.

흰쥐 뇌 편도체에서 (³H)-ketanserin 결합에 의한 Serotonin 신경연접의 전자현미경적 연구

김자예 梨花女子大學校 1989 국내박사

포유류의 뇌에서는 여러가지 신경전달물질이 분비되어 뇌의 여러 기능에 관여하고 있으며 그 중에서 serotonin은 수면, 체온조절, 통각감수, 성장호르몬 분비 및 생식등의 기능에 관여하고 있는 것으로 보고되고 있다. Serotonin 신경섬유는 특히 여러 대뇌피질, 신선조체, 중뇌의 봉선핵, 편도체, 송과체등에 고밀도로 분포되어 있다. 포유류의 뇌에서 편도체는 선조체의 복측부에 자리잡고 있는 신경핵의 집합체로서 시상하부, 시상, 대뇌피질, 선조체로 신경섬유를 투사하며 또 후구, 시상하부, 흑질과 복측 피개야, 청반 및 봉선핵으로부터 신경섬유를 받고있다. 본 연구는 흰쥐 뇌의 편도체에서 serotonin 신경섬유를 식별하고 또한 그의 신경연접의 미세구조를 자세히 관찰하기 위하여 측뇌실에 serotonin 길항제인 [`^3 H] - Ketanserin을 주입한 다음 편도체내의 serotonin 수용체의 분포상태를 광학 및 전자현미경 자기방사법으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 광학현미경 표본에서 은입자의 대부분은 신경모에 표지되었고 소수는 신경세포에 표지되었다. 전자현미경 표본에서 거의 대부분의 은입자는신경세포막에 근접해서 표지되었다. 은입자의 대다수는 수상돌기와 축삭의 가느다란 가지에 표지되었고 소수는 굵은 수상돌기, 또는 신경세포체에 표지되었다. 표지된 연접에서는 소원형 소포를 함유한 축삭종말이 비대칭의 축삭-수상돌기 연접을 이루고 있었다. 위와같은 사실로 보아서 편도체에서 소원형 소포를 함유한 비대칭의 축삭-수상돌기 연접의 상당수는 serotonin_2 수용체를 갖고 있으며 이들 연접의 축삭은 serotonin 신경섬유라고 생각한다. The neurotransmitters which are released from mammalian brain play the important roles in various brain functions, and serotonin has been implicated in the regulation of sleep, body temperature, pain perception growth hormone secretion, and reproduction. Most serotonin synthetizing neurons are situated in the raphe nuclei of mesencephalon and their axons are widely distributed in the brain including the entire cerebral cortex. Also very high densities are found over the mammilary bodies, claustrum and nucleus lateralis of the amygdala. The amygdala in the mammalian brain is a complex of nuclei located in the ventral part of striatum. It is known that amygdala has many axonal connection with the various brain areas. It projects the efferent fibers to the hypothalamus, thalamus, cerebral cortex, and striatum. And it receives the afferent fibers from the olfactory bulb, hypothalamus, substantia nigra, and ventral tegmental area, locus ceruleus, and raphe nuclei. This study was performed to identify the serotoninergic synapses in the amygdala of the rat. Identification of the serotoninergic synapses has been done by autoradiography after cerebroventricular administration of `^3 H - Ketanserin. When examined by the light microscopic autoradiographs, most of the labeled silvergrains were detected in the neuropil and some of them in soma. By the electron microscopic autoradiographs, almost all of the labeled silver grains were detected near the vicinity of the nerve cell membrance. We found most of silver grains were located in the thin branches of the dendrites or soma. In case of labeled synapses, the axon terminals contained small round vesicles and showed asymmetric contact with dendrites. In this context, it implies that a lot of asymmetric axo-dendritic synapses with small round vesicles have the serotonin_2 receptors, and the axon terminals of these synapses are serotoninergic fibers.

實驗的 腦梗塞에서 毛細血管 構築에 關한 電子顯微鏡的 硏究

조진호 全南大學校 1987 국내석사

뇌경색증 환자의 전산화 단층 촬영상 관찰되는 대조 강화 효과의 요인을 규명하기 위하여 성숙백서에서 실험적으로 경색증을 유발시켜 경색부위의 모세혈관 변화를 광학 및 전자현미경으로 관찰하였다. 경색증은 자기용혈편을 우측 내경동맥에 주입하여 일으켰으며 1일, 2일, 1주, 2주, 4주 및 8주후에 검색하였다. 초기(1일-1주)의 변성기에서는 모세혈관의 변성과 괴사를 볼 수 있었고 증기(2주-4주)의 증식기는 신생 모세혈관의 증식을 특징으로 하였으며 후기(8주)의 수복기에서는 내피세포의 성숙을 볼 수 있었다. 신생 모세혈관에서 연접장치는 잘 형성되었고 기저막은 연속적으었으며 내피세포 세포질의 혈관강내 돌기와 세포질내 음소포가 다수 출현하였다. 이와 같은 소견은 신생 모세혈관에서 혈액-뇌관문 기능은 비교적 잘 유지되나 투과성은 증가될 것임을 암시하는 것이다. 따라서 임상적으로 전산화 단층 촬영상 대조강화 효과가 뇌경색증의 중기에 뚜렷이 관찰되는 것은 혈액-뇌관문의 기능장애로 인한 것이라기 보다는 신생 모세혈관 내피세포의 투과성 증가에 기인할 것으로 추정되었다. Experimental brain infarcts in rats were studied light and electron microscopically to investigate the factor(s) controlling contrast enhancement on CT scans of the infarcts. Brain infarction was induced by injection of fine autologous blood clots through the right internal carotid artery and the affected brain was processed for examination 1 day, 2 days and 1, 2, 4 and 8 weeks after the injection. The lesion of early, necro-degenerative stage (1 day to 1 week) showed structural disintegration of capillary endothelial cells with dissolution of tight junctions. The lesion of middle, regenerative stage (2 to 4 weeks) was characterized by proliferation of new capillaries. They had well-formed tight junctions and continuous basement membrane. The endothelial cells, however, had intraluminal villous projections and many pinocytotic vesicles, suggesting an increased permeability. The capillaries matured at late, reparative stage (8 weeks), appearing similar to those in normal brain tissue except that they were loosely surrounded by atrocytic foot processes. It was presumed that the increased permeability of new capillaries might play an important role for contrast enhancement observable clinically during the middle stage (2 to 4 weeks).

모래쥐 神經下垂體의 電子顯微鏡的 硏究

이은주 全南大學校 1988 국내박사

모래쥐 신경하수체의 미세구조를 전자현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 모래쥐 신경하수체는 신경분비축삭섬유 및 팽대부, 하수체세포, 모세혈관 및 혈판주위간극으로 구성되어 있고 신경분비축삭 섬유 및 팽대부는 그 내부구조에 따라 네가지 종류가 있었다. 즉 크기와 내용물에 있어서 광범위하게 다양한 신경분비과립으로 내부가 거의 채워져 있는 경우, 용해소체가 많은 경우, 세포내소기관이 거의 없고 축삭세포질의 전자밀도가 매우 낮은 경우, 다른 팽대부보다 크기가 작고, 미세소포가 세포막 가까이에 밀집하여 있는 경우 등이었다. 대다수의 하수체세포는 길고 불규칙한 세포질돌기를 세포의 한쪽방향으로 내고 있으며, 주위에 많은 신경분비축삭섬유 및 팽대부를 둘러싸고 있었다. 세포질돌기부에 많은 미세사와 미세관이 있으며 골지부가 발달되어 있고, 미세사와 미세관이 조면내형질망 주위에 밀집하는 구조가 특이하였다. 세포내소기관의 양상이 대다수의 하수체세포와 유사하나 세포질의 전자밀도가 더 높은 다수 하수체세포들이 있었다. 모세혈관은 유창성모세혈관이며, 혈관주위간극은 두께의 변동이 매우 심하고, 주위 하수체세포, 신경분비축삭섬유 및 팽대부 사이로 분포하고 있었다. 혈관주위 간극과 신경분비축삭팽대부 또는 하수체 세포가 접촉하는 부분은 산발적으로 전자밀도가 증가되어 있었다. The fine structure of the neurohypophysis of the Mongolian gerbil was studied by electron microscope. The neurohypophysis of the Mongolian gerbil was consisted of the neurosecretory axons and their dilatations, pituicytes, capillary and perivascular spaces. Based on the predominant figures of the intracellular structures, the neurosecretory axons and their dilatations were classified into four different types: Type I is characterized by abundant neurosecretory granules of various size and density; type II by abundant lysosomal bodies; type III by an electron-lucent matrix with few organelles; type IV by numerous microvesicles. Pituicytes were generally elongated and irregular in shape, giving rise to slender, long cytoplasmic processes. The axons and their dilations are frequently indented within pituicyte cytoplasm. The cytoplasmic processes of pituicytes contain numerous fine filaments and specific structures formed by rEr and fine filaments. Pituicytes with a dark cytoplasm relative to the electron-lucent cytoplasm of the major pituicytes were observed. No ultrastructural difference in their cytoplasmic organelles between the dark and major pituicytes was noted. The neurohypophysis was vascularized by a dense network of fenestrated capillaries. The perivascular space consisted of two basement membrane and intervening layer was very variable in width and the extensions originating from this space penetrated the surrounding neural parenchyma. The electron density increased sporadically in the contact site of the perivascular space with the neurosecretary axon dilatations or pituicytes.

Glycerol이 백서 좌골신경에 미치는 영향에 관한 전자현미경적 소견

서춘교 경북대학교 1991 국내석사

삼차신경통 치료에 사용되는 glycerol이 말초신경섬유에 미치는 효과를 알아 보기 위해 웅성백서의 우측 좌골신경에 무수 glycerol, 좌측 좌골신경에 생리식염수를 적용하여 1주, 2주, 3주, 4주후의 신경섬유의 신경주막하 근접부위에 발생되는 조직병리학적 변화를 전자현미경으로 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 실험군 1주째에 무수 glycerol로 인해 수초층의 분리현상, 수초의 종창 및 축삭의 압박현상이 관찰되었으며 실험군 2주째에서는 이러한 현상이 더욱 현저하게 일어났으며 수초의 이탈 및 축삭의 용해현상도 관찰되었다. 실험군 1주째에 소신경섬유보다 대신경섬유에서 파괴현상이 더욱 현저하게 나타났다. 실험군 1주째에 무수초 신경섬유보다 유수초 신경섬유에서 파괴현상이 더욱 현저하였다. 실험군 2주째에 schwann세포의 세포질내에 이탈된 수초가 나타났는데 이는 schwann 세포의 탐식작용으로 여겨진다. 실험군 3주째에 신경섬유의 초기 재생현상이 관찰되었으며 실험군 4주째에서는 신경섬유의 재생현상이 현저하게 관찰되었는데 이는 schwann세포에 의한 신경섬유의 재생작용으로 여겨진다. The purpose of this experimental study is to investigate the effects of glycerol when anhydrous glycerol is applied topically to the sciatic nerve of rats. For this study, 32 Sprague-Dawley male albino rats were used as the experimental animals. The right sciatic nerve of rats applied with anhydrous glycerol was used as the experimental group and the left sciatic nerve of rats applied with physiological saline was used as the control group. Eight rats were sacrificed every first, second, third and fourth week and the sciatic nerves were removed. All specimens were fixed in 2.5% glutaraldehyde solution and post-fixed with 1 % osmium tetroxide solution. The specimens were embedded in epon 812, cross-sectioned into 60nm thickness and stained with lead acetate. After this procedures, the specimens were observed with electron microscope. The obtained results were as follows : 1. Myelin lamella seperation, swelling of myelin sheath and axonal compression were observed at first week and maximal destructive changes including myelin disintegration and axonolysis were noted at second week in the experimental group. 2. The destructive change was more severe in the large nerve fiber than the small nerve fiber at first week in the experimental group. 3. The destructive change was more severe in the myelinated nerve fiber than the unmyelinated nerve fiber at first week in the experimental group. 4. The schwann cell containing disintegrated myelin was observed at second week in the experimental group, it seems to be phagocytosis of schwann cell. 5. The early restitution of nerve fiber was started at third week and the marked restitution of nerve fiber was observed at fourth week in the expermental group. This restitution of nerve fiber can be considerd as the effect of schwann cell.

토끼의 말초신경 손상 후 역행성 변성에 관한 전자현미경적 연구

이경민 고신대학교 대학원 1999 국내박사

PURPOSE: Peripheral nerves go through degeneration after injury. There are many reports on degenerative changes following nerve injury including changes at injured portion, it’s distal portion, and nerve cell body. But there are only few studies available on changes occurring at proximal nerve portion between injured nerve portion and nerve cell body after nerve injury. So, this study was done to investigate the morphometric and morphologic changes occurring at proximal nerve portion after nerve injury. MATERIAL AND METHOD : 30 New Zealand white strains rabbits were used and divided into two groups; one-control group, the other-experimental group. The experimental group was further subdivided into 5 subgroups according to the duration of compression on posterior tibial nerve at ankle joint; group Ⅰ - compressed for 4 days, group Ⅱ - compressed for 7 days, group Ⅲ - compressed for l2 days, group Ⅳ - compressed for 14 days, group Ⅴ - compressed 7 days and waited for 7 days after release. Each group comprized 5 rabbits. Rabbits were sacrificed according to predetermined time after compressive nerve injury. Proximal and distal nerve tissues were acquired by sectioning 1 and 3cm proximal portions of injured area. The histologic and electron microscopic changes along with morphometric changes occurring on the axon, perineurium, and myelin sheath of proximal portion of injured nerve were investigated. RESULTS : On light microscopic view, the axon was displaced to peripheral of nerve fiber or disappeared and the myelin sheath was thickened, and also with time, there were dramatic loss of nerve fibers and increased volume of connective tissues. On electron microscopic view, the proximal nerve tissues of group Ⅰ, Ⅱ showed lamellar separation at mid-portion of myelin sheath due to demyelination during the initial compression period and with time, the segmentation of myelin sheath proceeded toward periphery, being transformed into ovoid segment and these ovoid segments were seen to be contained inside vacuoles in the cytoplasm of Schwann's cells. Meanwhile, the distal nerve tissues, direct demyelination process proceeding from periphery toward center was observed. In group Ⅴ, remyelinating nerve fibers were seen after removal of compression. But in group Ⅳ, which continue nerve compression, many vacuoles with variable sized and swollen mitochondria were seen filling the cytoplasm of Schwann’s cell and nuclear atrophy of Schwann's cell was observed in both proximal and distal nerve tissues. As for epineurium, group Ⅱ showed hypertrophied connective tissue cells containing many variable sized vesicles within their cytoplasm. In group Ⅳ, connective tissue cells containing large vesicles were observed and many collagen fiber bundles were seen in extracellular spaces. The morphometric results were as follows ; the cross-sectional area of nerve fiber was increased initially in proportion to nerve compression time and reached highest value in group Ⅱ(p<0.01) and then started to decline, and reaching much lower level than that of control group in group Ⅳ(p<0.01). But there were no significant difference of nerve fiber cross-sectional area between group Ⅴ and control group. The cross-sectional area of myelin sheath was increased in proportion to nerve compression time and reached highest value in group Ⅲ(p<0.01), but declined to much lower value than that of control group in group Ⅳ(p<0.01). The ratio of myelin sheath cross-sectional area over nerve fiber cross-sectional area was also increased in proportion to nerve compression time until group Ⅲ, but in group Ⅳ, the ratio was lower than that of control group. Cross-sectional area of mitochondria in axon was reduced in group Ⅰ(p<0.05), but started to increase reaching highest value in group Ⅲ and then, began to decline again in group Ⅳ. But group Ⅴ, which undergone continuous nerve compression, showed significant increase comparing with other groups(p<0.01). Cross-sectional area of mitochondria with in Schwann's cell was incremsed with time reaching toward group Ⅲ and Ⅳ. group Ⅴ showed smaller value than group Ⅱ, but with no statistical significance. As for cross-sectional area of neurotubule in axon, group I showed no significant difference with control group. But group Ⅲ and Ⅳ showed increased values(p<0.01) and group Ⅴ showed lower value than group Ⅲ(p<0.01 ). Conclusion : Through above results, morphological changes of retrograde degeneration occurring on proximal nerve portion following peripheral nerve injury were recognized and assessed. These findings may provide a basis for the understanding of disease entities showing proximal nerve degeneration following peripheral nerve injury. 목적: 말초신경 손상 후의 손상부 신경이나 손상 원위부 신경 그리고 신경세포체에 발생하는 변화에 대하여는 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 신경손상 후 신경세포체와 신경손상부 사이의 근위부 신경에 대한 연구는 미진한 상태에 있어 신경손상 후 근위부 신경에 발생하는 역행성 변성의 형태학적 변화를 규명하기 위하여 본 연구를 시행하였다. 실험재료 및 방법 : 실험동물은 New Zealand White strain 토끼 30마리를 암수 구별 없이 사용하였다. 실험은 신경손상을 주지않은 대조군과 신경손상을 준 실험군으로 구분하여 시행하였다. 실험군은 족관절 부위의 후경골 신경을 4일간 압박한 군(Ⅰ군), 7일간 압박한 군(Ⅱ군), 12일간 압박한 군(Ⅲ군), 14일간 압박한 군(Ⅳ군)과 7일간 압박하고 압박을 제거한 후 7일을 경과시킨 군(Ⅴ군)의 5개군으로 나누어 각 군당 토끼 5마리씩을 배정하여 시행하였다. 실험군 토끼의 후경골신경에 압박손상을 가하고 시간경과 후 토끼를 희생시켜 손상을 가한 근위부 3cm와 1cm 지점의 후경골신경을 횡절단한 근위부, 원위부 신경조직을 얻어 손상 근위부 말초신경의 수초, 신경초 및 축삭에 발생한 조직학적 변화와 전자현미경적인 변화를 관찰하였고 형태계측학적 조사를 시행하였다. 결과: 광학현미경 소견에서는 신경섬유에서 축삭이 한쪽으로 밀려있거나 소실되어 있었고 수초의 두께는 두꺼워져 있었으며 시간이 경과할수록 신경섬유의 현저한 소실과 결합조직의 양적 증가를 보였다. 전자현미경 소견에서는 Ⅰ, Ⅱ군의 근위부 신경조직에서 신경압박 초기에 수초가 중간부에서 수초층판의 분리가 발생하였으며, 압박이 지속될 수록 가장 자리쪽 수초가 난원형 구획으로 분절되어 시반세포의 세포질 내의 여러 개의 공포 속에 들어 있었다. 원위부 신경조직에서는 수초의 가장자리로부터 중심 쪽으로 진행되는 직접적인 탈수초화 현상을 보였다. V군에서는 압박제거 후 재수초화를 보이는 섬유들을 관찰할 수 있었으나 신경압박이 지속되었던 Ⅳ군에서는 근위부와 원위부 신경조직 모두에서 시반세포의 핵위축 현상을 보였고 세포질내 다양한 크기의 많은 공포와 종창된 사립체가 관찰되었으며 신경섬유는 거의 소실되었다. 신경외막의 소견은 Ⅱ군에서 비후된 결합조직 세포의 세포질 내에 크고 작은 소포들이 많이 분포하고 있었고 Ⅳ군에서는 소포의 크기가 다소 커졌다. 형태계측을 실시한 결과 신경섬유 단면적은 Ⅱ군에서 가장 크게 나타났으며(p<0.01) 그 후 시간이 경과할수록 점차 감소되어 14일 압박군인 Ⅳ군에서는 대조군보다 현저히 감소되었다(p<0.01). 그러나 Ⅴ군에서는 신경섬유 단면적이 대조군과 차이가 없었다. 수초의 단면적은 신경 압박시간이 길어질 수록 계속 증가하여 Ⅲ군에서 가장 크게 나타났으나(p<0.01) Ⅳ군에서는 대조군보다 현저히 감소하였다(p<0.01). 신경섬유에서 수초의 단면적이 차지하는 비율은 Ⅲ군까지는 신경 압박시간이 길어질 수록 증가되었으나 Ⅳ군에서는 대조군보다 오히려 감소하였다. 축삭 내 사립체의 단면적은 Ⅰ군에서는 감소되었으나(p<0.05) 그 후 점차 증가되어 Ⅲ군에서 최고에 이르렀고 Ⅳ군에서는 다시 감소하였으나 의미 있는 차는 없었다. 그러나 Ⅴ군에서는 지속적인 압박을 가한 군들에 비해 현저한 증가를 보였다(p<0.01). 시반세포 내 사립체 단면적은 신경 압박시간이 길어질 수록 증가하여 Ⅱ군에서 가장 컸으나(p<0.01) Ⅲ군과 Ⅳ군으로 갈 수록 작아졌다. Ⅴ군에서는 가장 큰 단면적을 보였던 Ⅱ군에 비하여 작아지는 경향을 보였으나 통계적 유의성은 없었다. 축삭 내 신경소관 단면적은 Ⅰ군에서는 대조군과 의미 있는 차가 없었으나 Ⅱ군과 Ⅲ군에서는 증가하였고(p<0.01) Ⅴ군에서는 가장 큰 단면적을 보였던 Ⅲ군에 비해 감소하였다(p<0.01). 결론: 이상의 결과로 말초신경 손상으로 인한 근위부 신경에 나타나는 역행성변성의 형태학적, 미세구조적 변화를 확인하였고, 이러한 결과는 말초신경 손상시 근위부 신경변성을 보이는 질환을 이해하는데 기초적 자료를 제공해 줄 수 있을 것으로 사료된다.

齧齒類의 腸管 Paneth 細胞에 關한 電子顯微鏡的 硏究

이대열 全南大學校 1990 국내박사

설치류에서 동물종에 따른 Paneth세포 분비과립의 형태학적 및 조직화학적 차이를 구명하기 위해 백서, 마우스, 모래쥐 십이지장에서 조직화학, 면역세포화학 반응을 시행하여 광학현미경적 및 전자현미경적 관찰을 시행하였다. H-E염색 표본에서 Paneth세포는 세가지 동물 모두 eosin에 짙게 염색되는 산호성 과립을 함유하고 있었다. PTAH 염색에서 Paneth세포 분비과립의 염색성은 마우스에서는 강한 양성반응을, 백서에서는 음성반응을 나타냈으며 모래쥐에서는 반응이 다양하여 일부과립에서만 양성반응을 보였다. Lysozuyme 항체를 이용한 면역세포화학 반응에서 마우스와 백서 Paneth 세포는 양성 반응을 보였으나 모래쥐 Paneth 세포는 음성반응을 보였다. 전자현미경 관찰에서 Paneth세포는 동물종에 관계없이 외분비세포의 특징을 보였다. 즉 Paneth세포는 핵이 기저부에 위치하고 핵하부 세포질에는 풍부한 조면내형질망이, 핵주위에는 잘 발달된 Golgi장치가, 핵상부 첨부 세포질에는 많은 분비과립이 관찰되었다. 그러나 분비과립의 형태는 동물에 따라 현저한 차이를 보였다. 백서에서 분비과립은 직경 0.5∼1.5㎛의 구형과립으로 내부에 농도가 균일한 농심부를 갖는 경우와 과립성 또는 섬유성 물질을 함유하고 있는 경우로 구별되었으며 한계막과 농심부사이에 휘륜부는 없었다. 마우스에서 분비과립은 1∼2㎛의 구형과립으로 대부분 농도가 균일하고 짙은 구형의 농심부를 갖고 한계막과의 사이에 휘룬부가 존재하였다. 일부 분비과립은 용해소체와 융합되고 휘륜부에 myelin양막물질을 함유하고 있었다. 모래쥐에서 분비과립은 0.5∼2㎛의 구형과립으로 Paneth세포에 따라 상이한 두 종류의 분비과립을 함유하고 있었다. 하나는 농심부솨 한계막 사이에 휘륜부를 □는 형으로 농심부는 마우스와는 달리 농도가 균일하지 않고 과립상이었으며 휘륜부에 미세섬유성 물질로 채워져 있었다. 다른 하나는 휘륜부가 없이 농도가 균일하나 짙□ 다양한 과립성 기질에 불규칙한 농심부가 출현하였다. 기타 각 동물의 Paneth세포에는 간혹 거대공포가 관찰되었으며 특히 모래쥐의 경우는 이들 거대공포가 자주 관찰되었다. 전현적 면역세포화학 반응은 세가지 동물에서 모두 양성 반응을 보였으□ lysozyme에 양성인 면역 교질금은 주로 분비과립에 국한되어 있었다. 이상의 관찰 결과로 같은 설치류에서도 동물에 따라 Paneth세포의 분비과립 형태가 다름을 알 수 있었고, 분비과립의 형태와 조직화학반응이 동물에 따라 다름은 분비과립에 함유된 물질이 동물간에 서로 상이할 수 있음을 암시하는 것이었다. The purpose of this study was to clarify the light and ultrastructural characteristics of Paneth cells in the rat, mouse and mongolian gerbil. Paneth cells were studied by light and electron microscopy using histochemical and immunocytochemical methods with special reference to secretory granules. In H-E stained sections, Paneth cells of all laboratory animals contained eosinophilic secretory granules. In PTAH staining, the secretory granules of Paneth cell of a mouse stained intensely, but those of a rat stained poorly. The secretory granules of Paneth cell of a mongolian gerbil stained partly with PTAH. A strong immunoreaction for 1ysozyme was observed in the secretory granules of Paneth cells of a rat and mouse, but no immunoreaction was observed in those of a mongolian gerbil. The fine structure of Paneth cell was generally similar to that of exocrine gland. The nucleus was situated in the basal portion of the cell. A well developed rough endoplasmic reticulum filled the portion of the cell below the nucleus. An extensive Go1gi complex was located above the nucleus. The large secretory granules are found between the nucleus and luminal surface of the cell. Occasionally, the Paneth cells of all animals, especially of mongolian gerbil, had a large vacuole in the supranuclear cytoplasm. Fusion of the vacuole and secretory granules was noted in some instances. The fine morphology of the secretory granules of Paneth cell showed significant differences according to the families of the rodents. In rat Paneth cells, the secretory granules are spherical, 0.5-1.5㎛ in diameter, and contained homoge neous electron dense matrix or finely granular and fibrillar materials. The granules had no halo between the matrix and limiting membrane. In mouse Paneth cells, the secretory granules are spherical, 1-2㎛ in diameter, and consisted of a homogeneously dense core and electron lucent pale halo. Some granules appeared to fuse with 1ysosome and contained myelinated membranous fragments in the halo. There are two types of granules in the Paneth cell of mongolian gerbil. One type of the granules consisted of dense granular core and electron lucent halo filled with finely fibrillar materia1s. The other type of the granules contained electron dense core surrounded by fine granular matrix with variable density. In ultrastructural immuunocytochemistry for 1ysozyme, immunoreactive gold particles are present on the secretory granules and a large vacuole of Paneth cell in all animals. These results indicate that the secretory granules of Paneth cells are different in morphology and histochemical and immunocytochemical staining properties among laboratory animals, and suggest, therefore, that consistents of secretory materials are different according to the families of the rodent species.

자라 膵臟 Intermediate 細胞에 關한 電子顯微鏡的 免疫細胞化學 硏究

권현 全南大學校 1989 국내박사

췌장에서 선포세포와 내분비세포의 공통적인 특징을 갖는 소위 intermediate 세포는 인간을 위시한 여러 동물 종의 정상 또는 병적상태의 췌장에 출현한다고 한다. 그러나 intermediate 세포의 본태 구명은 함유된 내분비과립의 형태학적 특징에 의한 것뿐으로 내분비과립에 대한 항원-항체반응을 이용한 증명은 없다. 본 연구에서는 자라 췌장에서 intermediate 세포의 출현을 관찰하고 이들 세포가 함유한 내분비과립의 본태를 immunogold를 이용한 전자현미경적 면역세포화학 반응으로 밝히고자 하였다. 면역세포화학 반응은 glucagon과 insulin에 대한 것이었으며 초박절편에 rabbit anti-hyman glcagon serum과 guinea pig anti-human insulin serum을 일차항체로 하여 반응시킨후 protein A-gold에 반응시켰다. 자라 췌장에서 intermediate 세포는 효소원과립과 내분비과립을 동시에 함유하고 또한 풍부한 소포상의 조면내형질망을 함유하고 있었다. 이들 과립은 서로 뒤엉켜 있거나 서로 다른 세포질 영역으로 구분되어 출현하였다. 이들 세포는 몇개가 모여 집단을 이루고 있었으나 세포사이의 경계가 명확하지 않아 마치 하나의 다핵 거대세포처럼 보였다. 면역세포화학 반응에서 intermediate 세포는 함유된 내분비과립의 반응 여부에 의해 몇가지로 세분되었다. 제일 흔히 관찰되는 형은 insulin항체에 양성인 acinar-beta 세포였고, 다음은 glucagon 항체에 양성인 acinar-alpha 세포였다. 간혹 양측을 모두 함유한 acinar-alpha, beta 세포도 관찰되었다. 이상의 결과로 자라 췌장에는 정상에서도 intermediate 세포가 존재함을 알 수 있었고, 미세구조 만으로는 식별이 곤란한 내분비과립의 분류를 immunogold를 이용한 면역세포화학 반응으로 명확히 구별할 수 있었다. The occurrence of intermediate cells with the morphoiogical features of both acinar islet cells has been described in the normal and pathologic pancreas of various animal species including human.The characterization of these cells, however, mainly dpended on the morphology of the endocrine granules .In the present study, I report the presence of the intermediate cell in pancreas of the fresh water turtle and further characterize the nature of endocrine granules by applying immunogold electron microscopy. Immunocytochemical staining for glucagon and insulin was done on thin sections by protein A-gold technique using rabbit anti-human glucagon and guinea pig anti-human insulin sera as primary antibodies. Intermediate cells of the pancreas in the fresh water turtle were characterized by intermingled zymogen and endocrine granules and extensive vesicular rohgh endoplasmic reticulum. Occasionally they had two distinct cytoplasmic areas, one containing similar morphology of acinar cell , the other exhibiting characteristics of the islet cell. These cells were predominantly arranged in clusters and the boundaries were not discernible except for the fragments of cell membranes, thus it appeared to be a multinucleated giant cell. In most cases, the immunoreactive intermediate cells encountered were acinar-beta cell (heavely labeled by a antibody to insulin) or acinar-alpha cell (heavely labeled by a antibody to glucagon). The predominant type was acinar-beta cell. These results indicate that intermediate cells are normally occurring cells in pancreas of the fresh water turtle, and the endocrine granules which are often ambiguous or even difficult to identify by fine morphology alone can be clearly characterized by the use of immunogold technique.

人胎兒 細氣管支上皮의 發育에 關한 電子顯微鏡的 硏究

문병탁 全南大學校 1990 국내박사

坐高 20mm(貽齡 7.5週)부터 270mm(胎齡 30.5週)까지의 人胎兒를 對象으로 細氣管支上皮의 發育過程을 電子顯微鏡으로 觀察하여 다음과 같은 結果를 얻었다. 坐高 40mm(貽齡 10週)때 細氣管支는 單一細胞인 圓柱上皮가 僞重層上皮를 이루고 있었다. 上皮細胞는 中央에 큰 核을 가지고 있었으며 細胞質에는 小器官이 少數이고 糖原顆粒이 大部分을 차지하고 있었다. 60mm(胎齡 11.5週)때 細氣管支는 單層上皮로 纖毛細胞, 無纖毛細論, 基底細胞, 未分化細胞 및 顆粒含有細胞로 構成되어 있었고 無纖毛細胞는 細胞質의 小器官들이 核上部에 位置하고있었다. 90mm(胎齡 14週)때 細氣管支上皮細胞에 無纖毛細胞의 數가 增加하였고 一部 細胞의 核上部 細胞質에 電子密度가 높은 顆粒을 含有하고 있었다. 小顆粒含有細胞들은 單獨 또는 集團으로 上皮細胞들 사이에 介在하여 基底膜을 따라 分布하였다. 坐高 120mm(貽齡 16.5週) 때 纖毛細胞의 核下部 細胞質에는 電子密度가 낮은 顆粒을 含有하고 있었으며 貽齡이 增加함에 따라 細氣管支上皮는 無纖毛細胞가 大多數였고 電子密度가 높은 多數의 分泌顆粒이 核上部의 細胞質에 存在하였다. 坐高 250mm(胎齡 29週)와 270mm(胎齡 30.5週) 때 細氣管支上皮에 無纖毛 Clara 細胞가 最初로 出現하였다. 이 Clara細胞는 두 가지 形態로 區訓되었으며 Clara 細胞와 基底細胞들은 成人의 것과 類似하였다. 이와같은 硏究結果는 人胎兒 絪氣管支上皮의 發育에 따른 微細構造를 밝힌 것으로써 大體로 上皮細胞의 分化 發育이 出生直前에 大部分 이루어짐을 시사하였다. The development of the terminal bronchioles was studied by electron microscope in human fetuses ranging from 20mm to 270mm crown rump length. At 40mm fetus, the epithelial lining of terminal bronchioles was composed primary of one cell type. The cells were columnar in shape with a central nucleus, few organelles, and large amount of cytoplasmic g1ycogen. At 60mm fetus, the terminal bronchiolar epithelium was found to be a simple columnar type composed of ciliated cells, nonciliated cells, basal cells, undifferentiated cells, and granule-containing cells. Nonciliated cells had concentrations of organelles in the apical portion of their cytoplasm. At 90mm fetus, nonciliated cells were much more abundant, and a small number of cells had electron-lucent granules in their apices. Ciliated cells had an electron-lucent cytoplasm with moderate numbers of mitochondria and rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Basal cells, were low cuboidal in shape with electron-dense cytoplasm and small amount of organelles. The small granulecontaining cells were scattered along the basement membrane between other epithelial cells and appeared as single cell or in groups. At 120mm fetus ciliated cells had variable numbers of electron-lucent granules in the basal cytoplasm. Nonciliated cells were more numerous and had more secretor)'granules in apical cytoplasm from 12mm fetus onward. Between 250mm and 270mm fetuses, nonciliated clara cells were first observed on mophological basis, two distinct types of Clara cell were recognized. Nonciliated Clara cells and basal cells resembling these cells in adults were present. The findings 3nay suggest that most of the differentiation of bronchiolar epithelium in the human fetuses occurs prior to birth.

週齡에 따른 생쥐 Leydig세포의 전자현미경적 구조

서의수 慶北大學校 1990 국내석사

주령(週齡) 의 증가에 따른 생쥐 Leydig세포의 광학현미경적 형태와 초미세구조에 관한 변화는 다음과 같다. 1. 생후 1주군에서 미분화된 Leydig세포는 정세관 주위에서 관찰할 수 있었고, 핵은 방추형이며, 핵질과 핵막에는 이염색질이 많이 분포하고, 세포질에는 소포체와 사립체가 조금 분포하나 그 이외의 세포소기관은 거의 없었다. 2. 3주군에서의 Leydig세포는 아직 완전히 분화되지는 않았으나 정세관 주위에서 관찰되었다. 핵은 난형이며, 핵막의 일부 함입과 이염색질의 부착이 있고 세포질에는 잘 발달된 무과립성 내형질망과 membrane whorl이 있으나 그 이외 세포소기관의 발달은 미약하였다. 3. 5주군에서는 완전히 분화한 Leydig세포들의 군집이 정세관 주위에서 관찰되었다. 핵은 거의 원형이며, 핵에는 진염색질이 분포하며, 세포질에는 사립체의 발달이 현저하고, 그 이외의 세포소기관은 약간 증가하였다. 4. 7주군에서는 잘 발달된 정세관의 구조와 잘 분화된 Leydig세포들의 군집을 tubule의 각 공간에서 관찰할 수 있었다. 세포는 핵이 원형으로, 핵막은 뚜렷하고 세포질에는 무과립성 내형질망 지방소적, 용해소체, 사립체, 당원입자 등이 아주 잘 발달되어 있었다. This study was performed to investigate the ultrastructure of the Leydig cell on aging of the mouse. The results obtained were as follows. One week after birth: The undifferentiated Leydig cells are found around seminiferous tubules. The nucleus showed the fusiform shape. The heterochromatin was found to be adherent to the nuclear membrane and to be dispersed in the nucleoplasm. The smooth endoplasmic reticulum and mitochondria were poorly developed, and the other cell organelles did not appear at this stage. The cytoplasmic vacuolations began to appear. After 3 weeks: Not fully differentiated Leydig cells are present around tubules. The nucleus had oval shape, and some nuclear membrane was caved and adhered to the heterochromatin. The smooth endoplasmi.c reticulum and membrane whorl were well developed. But the other cell organelles were poorly developed. After 5 weeks: Clusters of fully differentiated Leydig cells are found around the tubules. The nucleus had round shape, and the nucleoplasm included an euchromatin. Numerous mitochondria were observed at this stage. After 7 weeks: Clusters of fully differentiated Leydig cells are located in the interspace of each tubules. The shape of nucleus was round, and nuclear membrane was prominent. The smooth endoplasmic reticulum, lipid droplets, lysosomal dense body, mitochondria, ribosome and glycogen were increased markedly in number.