Analysis of the role of RAD51 in CRISPR/Cas9-mediated genome editing

박서정 중앙대학교 대학원 2023 국내석사

크리스퍼 기반의 유전자편집기술은 빠르고 효율적으로 유전자 조작을 가능하게 하는 3세대 편집기술이다. 캐스9이라고 불리는 효소에 의해 DNA 상에 형성된 이중가닥절단 부위에서 해당 기술의 작용이 일어난다. 크리스퍼 유전자가위기술의 눈부신 발전과 여러 종류의 응용에도 불구하고, 캐스9이 어떻게 특정 DNA 서열을 인식하고, 절단하기 위한 최종 복합체를 형성하는가에 대해서는 여전히 밝혀진 바가 적다. 목표 DNA 서열과 가이드 RNA, 캐스9이 적절하게 복합체를 이루는 것은 캐스9의 효과적인 효소작용을 돕기 때문에, 이는 곧 유전자편집기술의 높은 효율성과 직결되므로 해당 분야에 대한 연구가 중요하다. 이러한 측면에서 크리스퍼 유전자가위기술의 편집효율을 증진시키고자 본 논문에서는 RAD51이 함께 발현되는 크리스퍼/캐스9 시스템을 개발하였다. RAD51는 DNA 상의 이중가닥절단에 대한 수선기작 과정에서 단일가닥 DNA에 결합해 상동성에 기반하여 수선을 돕는 단백질이다. 본 연구에서는 RAD51이 함께 발현되는 크리스퍼/캐스9 시스템에서 유전자편집기술의 효율이 knock-in 뿐만 아니라 knock-out 방식에서 효과적으로 향상되는 것을 밝혔다. GAPDH와 SMC3 유전자를 목표 유전자로 하여 각각의 유전자에 대해 크리스퍼 유전자가위기술을 적용하여 돌연변이를 도입한 후 유전자발현의 감소량을 살펴본 결과, 단백질 발현이 약 1.9배 이상 감소한 것을 밝혔다. 또한 RAD51이 과발현됨으로써, 목표 유전자에 대한 상동성 서열을 포함하는 공여체 DNA가 존재하는 환경에서 knock-in 방식에 의한 유전자 삽입 효율도 증가하는 것을 확인했다. 본 논문에서 개발한 크리스퍼/캐스9-RAD51 시스템은 knock-in 뿐만 아니라 knock-out 방식에서 유전자편집기술의 효율 증진을 불러옴으로써 다양한 분야에서 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다. Genome editing based on CRISPR-associated technology is commonly used to alter the genomes rapidly and efficiently. Especially, in CRISPR/Cas9 system, Cas9 as endonuclease is guided to target DNA sequence by gRNA and generates active complex including Cas9-gRNA-target DNA, causing DNA double-strand breaks (DSBs). However, despite rapid advance in Cas9 engineering, how Cas9 may perceive and cleave is still unclear. Effective Cas9 activity correlates to appropriate assembly of this complex, which leads to elevated efficacy of genome editing. To improve these limitations, I develop a CRISPR/Cas9-RAD51 plasmid expressing RAD51, which is responsible for DSB repair via homologous recombination (HR). I uncover that over-expression of RAD51 can significantly enhance the efficiency of CRISPR-mediated genome editing in both gene knock-out and knock-in processes. When CRISPR/Cas9-RAD51 plasmid was introduced in cells, protein expression level of the target genes (cohesin SMC3 and GAPDH) was diminished by more than 1.9-fold compared to the CRISPR/Cas9 system without RAD51. Additionally, CRISPR/Cas9-RAD51 promoted the knock-in efficiency of DsRed donor DNA. Thus, the CRISPR/Cas9-RAD51 system is valuable for performance requiring specific and efficient genome edits not accessible to HR-deficient cell and for establishing CRISPR/Cas9-mediated knockout technology.

E2 유전자편집을 통한 생육기간 단축 콩 계통 개발 및 특성 규명

이수진 경상국립대학교 대학원 2024 국내석사

콩(Glycine Max L.)은 높은 단백질, 지방, 섬유질을 함유하는 작물이며, 세계 인구가 증가함으로써 높아지는 식량, 연료에 대한 수요에 기여할 수 있기 때문에 콩의 생산량과 품질을 개선시키기 위한 육종 연구가 활발히 진행되고 있다. 최근 기후변화가 진행됨에 따라 향후 국내 콩 재배 시 고온에 의한 피해가 발생할 것으로 예상되어 콩의 재배지를 북상시키기 위해 고위도 적응 가능 콩 계통을 개발할 필요성이 대두되고 있다. 고위도에서 재배되는 품종은 장일 조건에 적응할 수 있도록 조기 개화 및 성숙 형질을 갖추어야 하고, 저온에 대한 내성 형질 또한 필요하다. 조기 개화 및 성숙 형질을 가진 콩 계통 개발을 위해 CRISPR-Cas9 시스템으로 콩의 개화 억제 유전자 GmE2을 편집시켰으며, 대조구와 형질전환체의 개화 및 성숙 표현형을 분석하였고, GmE2 유전자가 저온 스트레스에 대한 반응에 관여하는지 알아보기 위한 스트레스 처리에 따른 유전자 발현 분석 실험 또한 진행하였다. GmE2와 E2 h1 유전자를 같이 편집시킨 GmE2/E2 h1 CT GE 형질전환체는 대조구와 비교하였을 때 빠른 개화와 성숙을 보였고 GmE2 유전자만 편집시킨 GmE2 ST GE 형질전환체는 그보다 조금 덜한, 즉 WT 식물체와 GmE2/E2 h1 CT GE 형질전환체의 중간 표현형을 보였다. 이 실험 결과를 통해 GmE2 유전자를 homolog와 함께 편집하는 것이 조기 개화 및 성숙 표현형에 더 큰 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. GmE2/E2 h1 CT 형질전환체의 개화 유전자 발현을 분석한 RT-PCR, qRT-PCR 실험을 통해 개화 억제 유전자 GmE2 , GmE2 h1 의 기능 억제가 개화 관련 유전자들의 발현에 영향을 미쳐 대조구에 비해 조기 개화 및 성숙 형질이 나타나게 되는 것으로 추정할 수 있었다. 비생물적 스트레스 처리에 따른 유전자 발현 분석 실험에서 저온, 건조, 고염 스트레스를 처리한 샘플에서 GmE2와 homolog유전자 발현 변화가 나타났다. 가장 큰 발현 변화를 보인 스트레스 처리가 저온이었던 점을 통해, 향후 고위도 적응 품종 개발에 GmE2와 그 homolog 유전자가 이용될 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. Soybean (Glycine Max L.) has been used in various industrial fields because of its high protein, fat, and fiber content. Thus, the breeding of soybean cultivars with increased productivity and quality has progressed worldwide. Recently, global warming due to climate change is threatening stable soybean production, so the development of soybeans suitable for the changed climate conditions is required. It has been known that the E2 gene plays critical roles in the adaptation of soybean to various geographical regions by controlling flowering and maturation times. In this study, soybean genome editing lines targeting E2 and E2 homolog1 (E2 h1) genes were generated using a CRISPR-Cas9 system, and their flowering and maturation phenotypes were analyzed. The simultaneous editing of GmE2 and GmE2 h1 genes, GmE2/E2 h1 common target (CT), by using the CRISPR/Cas9 system promoted the flowering and maturation of soybean transgenic plants compared to wild-type (WT) plants. These genome editing (GE) plants showed shorter plant height, fewer branches, and lower yield than WT. Moreover, the GmE2 single target (ST) GE plants in which only the GmE2 gene was edited showed an intermediate phenotype between WT plants and the GmE2/E2 h1 CT GE plants in terms of flowering and maturation phenotypes and plant architecture. The results suggested that the GmE2 and GmE2 h1 genes function redundantly in the regulation of soybean flowering and maturation, and the editing of these genes has additive effects on flowering and maturity. The expressions of GmE2 and GmE2 h1 genes were induced in response to various abiotic stresses including cold stress, suggesting that GmE2 and GmE2 h1 genes function in the soybean responses to not only day-length but also cold temperature. The results suggest that GmE2 and GmE2 h1 genes would be good targets for developing soybean cultivars with shortened growth period and cold tolerance, which are useful for cultivation in high-latitude areas, where soybean cultivation is limited because of long day-length and early frosting.

유전자 편집 기법을 이용한 콩 개화억제 유전자 GmFT4 및 GmFT6 기능 규명

김채연 경상국립대학교 대학원 2023 국내석사

산업적 관점에서의 유전자변형식품 산업의 발전방향에 관한 연구 - 산업혁신체제 이론을 바탕으로 -

장원 서울대학교 대학원 2023 국내석사

본 연구는 국내 유전자변형식품산업에 대한 원활한 형성과 지속적인 성장을 위한 발전방향에 관한 고찰을 수행하였다. 산업혁신체제론에 기반을 둔 산업분석을 통해 국내 유전자변형식품산업의 발전방향을 논의한 결과는 다음과 같다. 첫째, 국내 유전자변형식품 산업의 발전방향 중 지식과 기술 측면에서는 현시점 시장화가 이루어질 유전자변형식품산업에 대해 3세대 유전자 가위 기술인 크리스퍼 카스 기술을 식품산업에 적용하기 위한 방안을 연구할 필요성이 있다. 둘째, 국내 유전자변형식품 산업의 발전방향 중 활동주체와 네트워크 측면에서는 유전자변형식품의 혁신주체 기업들의 CSR 활동을 이행해야 할 필요성을 제안하였다. 셋째, 국내 유전자변형식품 산업의 발전방향 중 기관과 제도 측면에서는 GMO와 관련한 연구개발의 지원과 소비자 대상의 조사기관, 그리고 식품 개발과 유통사항을 관할하는 컨트롤타워 조성이 무엇보다 시급하다는 필요성을 제언하였다. 이상의 연구결과에서 나아가 국내 유전자변형식품에 대한 다수의 후속연구들이 진행되어 산업적 발전이 이루어질 수 있는 토대가 마련되기를 기대한다. This study conducted a review of the direction of development for the smooth formation and continuous growth of the domestic genetically modified food industry. The results of discussing the development direction of the domestic genetically modified food industry through industry analysis based on the theory of industrial innovation system are as follows. First, in terms of knowledge and technology among the development directions of the domestic genetically modified food industry, it is necessary to study ways to apply CRISPR/Cas9 technology, a third-generation genetic scissors technology, to the food industry. Second, in terms of activities and networks among the development directions of the domestic genetically modified food industry, it was suggested that CSR activities of companies that innovate genetically modified food should be implemented. Third, in terms of institutions and systems among the development directions of the domestic genetically modified food industry, it was suggested that it is most urgent to support R&D related to GMO, research institutes for consumers, and to create a control tower that oversees food development and distribution. Furthermore, it is expected that some follow-up studies on genetically modified foods in Korea will be conducted to lay the foundation for industrial development.

Virus-mediated gRNA Delivery and Genome Editing in Nicotiana benthamiana

박다연 서울대학교 대학원 2019 국내석사

Targeted modification of plant genome using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein-9 (Cas9) system enables precise modification of target genes. For genome editing, Cas9 protein and guide RNA (gRNA) need to be delivered into target cells effectively. However, genome editing has been hindered by lack of efficient delivery of CRISPR/Cas9 reagents or difficulty in efficient transformation in some plant species. Here, I tested feasibility of using viral vectors including Tobacco rattle virus (TRV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV) and Potato virus X (PVX) for delivering gRNA. When virus accumulation was evaluated by fluorescent protein tagged four viral vectors, fluorescence signal was detected in upper un-inoculated leaves and flowers. After confirming virus spreading, I used TRV-mediated genome editing as a case study for genome editing. N. benthamiana transgenic plants expressing the Cas9 gene driven by Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S or maize ubiquitin promoter (Ubi) promoters were used to investigate their differences in efficiency of genome editing. TRV-vector carrying gRNA targeting the phytoene desaturase (PDS) gene were delivered by Agrobacterium infiltration to transgenic N. benthamiana plants. The target specific mutations were tested at 20 days post inoculation with surveyor assays in both infiltrated and systemic leaves. Moreover, sequence modification were confirmed by Sanger sequencing of PDS. Systemic leaves of plant treated with TRV mediated genome editing showed 4 to 5 bp deletion upstream of protospacer adjacent motif (PAM) sites. These results demonstrate that TRV-mediated gRNA delivery can generate target specific mutations in Cas9 transgenic N. benthamiana. CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 유전자 편집기술은 목표 유전자의 정확한 변이를 가능하게 하였다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하기 위해서는 Cas9 단백질과 guide RNA (gRNA)가 목표하고자 하는 세포에 전달되어야 하지만 몇 작물에서는 효율적인 유전자 전달 방법이 확보되어있지 않다. 본 연구에서는 효율적인 유전자 편집기술을 위해 바이러스 벡터를 이용하여 식물체로 gRNA의 전달의 가능성을 확인하고자 Tobacco rattle virus (TRV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV), Potato virus X (PVX) 네 가지의 형광 단백질이 부착된 바이러스를 담배 (Nicotiana benthamiana)에 접종하였고 바이러스 별 전이 비교를 통해 TRV를 이용한 gRNA 전달 및 유전자 편집기술을 시행하였다. TRV를 이용한 유전자 편집기술은 카로티노이드 합성에 관여하는 Phytoene desaturase (PDS) 를 목표로 하여 아그로박테리아를 통한 잎 접종방식을 통해 TRV-gRNA 를 Cas9 형질전환 담배에 전달하였다. 돌연변이의 확인을 위해 접종 20일 후 식물체의 접종엽 및 미 접종 상엽에서 Surveyor assay 진행되었으며 미 접종 상엽의 DNA를 Sanger sequencing하여 염기서열 변이를 확인한 결과 목표 염기서열 구간에서의 4-5 개의 결실이 확인되었다. 본 연구 결과는 TRV를 이용한 Cas9형질전환체로의 gRNA 전달이 CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 편집기술의 적용이 가능한 것으로 보여진다.

유전자 편집 기술의 윤리·법·사회 문제 해결방안

이수빈 연세대학교 대학원 2019 국내석사

Genome editing technology is likely to evolve into a technology that enables fundamental prevention and treatment of genetic diseases. Recently, genome editing technology has been expanded to include research on human embryos. However, a growing concern exists regarding the use of genome editing technology on human embryo that can cause permanent genetic changes to future generations. Moreover, international discussions continue on conducting this research. Therefore, this study is aimed at exploring the recognition of ethics, legal, and social issues in genome editing and proposing a solution for our country using the comparison and analysis of country-specific regulations through an in-depth interview. As a result, the following ethical, legal, and social issues in genome editing are determined. First, the safety in genome editing technology is low, and the possibility of technology abuse is high. Second, genome editing technology applied to human embryos is expected to have a high potential for embryonic rights to life and humanity. Third, the use of genome editing technology, which requires high cost, will increase the possibility of a social gap. Fourth, international and domestic guidelines on the regulation of genome editing research are insufficient. Comparison of the country-specific regulations has resulted in the establishment of laws or guidelines that specify genome editing research using human embryo in most countries. Furthermore, these countries permit human embryo genome editing for limited research purposes only and prohibit its use for the purposes of clinical research. As a solution for ethical, legal, and social issues in genome editing, a limited approach to prevent the misuse of technology and continuous research for confirming its safety are necessary. Application of genome editing technology on human embryo should be allowed for basic research only, but using it for the purpose of pregnancy and childbirth should be banned. Moreover, a discussion on the boundary between treatment and enhancement to prevent the possibility of human variability is needed. It should also seek to reduce costs through government subsidies or private insurance to alleviate social disparities and to mitigate the burden of state finances. International cooperation has caused the establishment of international guidelines for genome editing research regulations and the need to amend the Bioethics and Safety Act. Genome editing is controversial in terms of morality, ethics, and science; however, the possibility of eradicating diseases, which is a long-standing human problem, is highly expected. We need ongoing discussions and research on the appropriate use and regulation of genome editing. It is hoped that experts' recognition of the ethical, legal, and social issues in genome editing and the comparison and analysis of the country-specific regulations will serve as a solution to help establish the legality and system of genome editing in South Korea. 유전자 편집 기술은 유전질환의 근본적 예방 및 치료를 가능하게 하는 기술로 발전될 가능성이 높다. 최근 유전자 편집 기술은 인간 배아를 대상으로 하는 연구로 확대되어 가는 추세이다. 그러나 인간 배아에 적용하는 유전자 편집 기술은 다음 세대에 영구적인 유전자 변화를 줄 수 있다는 우려가 높아 연구를 수행함에 있어 국제적인 논의가 계속되고 있다. 이에 본 연구는 국내·외 전문가들을 대상으로 심층면접 연구를 시행하여 유전자 편집 기술의 윤리·법·사회 문제에 대한 인식을 확인하고, 국가별 규제의 비교·분석을 토대로 우리나라의 해결방안을 제시하였다. 연구 결과, 유전자 편집 기술의 윤리·법·사회 문제는 첫째, 유전자 편집 기술은 기술의 안전성이 낮고, 기술의 오남용 가능성이 높다. 둘째, 인간 배아에 적용하는 유전자 편집 기술은 배아의 생명권 문제와 인류의 변종 가능성이 높을 것으로 예상된다. 셋째, 고가의 비용이 요구되는 유전자 편집 기술의 활용으로 사회적 격차 발생 가능성이 높아질 것이다. 넷째, 유전자 편집 연구의 규제에 대한 국제 및 국내 가이드라인이 미흡한 상황이다.국가별 규제 현황을 비교한 결과, 대부분의 국가에서 인간 배아 유전자 편집 연구를 특정 하는 법률 또는 가이드라인이 존재하였다. 그리고 제한된 연구 목적으로 인간 배아 유전자 편집을 허용하고 있는 국가들 모두 임상 연구 목적은 금지한다는 규정을 함께 명시하고 있음을 발견하였다. 유전자 편집 기술의 윤리·법·사회 문제 해결방안으로는 기술의 안전성 확인을 위한 지속적 연구와 기술의 오남용 방지를 위한 제한적 접근이 필요하다. 인간 배아 유전자 편집 연구는 기초연구는 허용하되 임신 및 출산 목적은 금지되어야 하며, 인류의 변종 가능성 방지를 위한 치료와 강화의 경계 논의가 필요하다. 또한 사회적 격차 해소를 위한 정부지원 또는 개인보험을 통한 비용 절감과 국가재정부담을 완화하기 위한 제도를 모색해야 한다. 국제적 공조에 의하여 유전자 편집 연구 규제에 대한 국제 가이드라인 마련과 현행 생명윤리법 개정 필요성이 제시되었다. 유전자 편집 기술은 과학적, 윤리적, 법적, 사회적, 종교적 측면에서 여러 가지 논란이 일고 있지만, 인류의 오랜 문제인 질병 퇴치에 대한 가능성이 기대된다. 따라서 인류 전체의 보건 향상을 위하여 기술을 현명하게 활용하기 위한 지속적인 논의와 연구가 필요하다. 이번 연구에서 파악된 유전자 편집 기술의 윤리·법·사회 문제에 대한 전문가들의 인식과 국가별 규제의 비교·분석에 따른 해결방안이 향후 우리나라 유전자 편집 기술의 법·제도 방안 수립에 도움이 되기를 기대한다.

CRISPR 유전자 가위를 통한 인간 배아 유전자 편집에 대한 인격주의 생명윤리적 고찰

손정우 가톨릭대학교 대학원 2019 국내석사

CRISPR-Cas genome editing technique, which utilizes the bacterial immune system, has significantly higher specificity and efficiency relative to previous techniques. It is used in a wide range of fields related to genetic engineering, especially is expected to contribute to human well-being and health. It has been used in a variety of organisms and cells ever since it was developed. But it can also be applied to genome editing of human embryos according to specific purposes. Meanwhile, human embryos gradually develop with internal unity according to their own genome from the moment they were fertilized. A human embryo, as an individual of a human species, is a person with the nature of human existence. A person is dignified because it is the only being that cannot be repeated in this world, not because of some ability. Therefore, Human embryos are dignified individuals just like any other human being, so their life, the most fundamental value, must be protected. Also they should not be used as a material. Then, genome editing of human embryo for treatment or prevention of genetic diseases seems ethically justified. However, there is a risk that CRISPR technology will cause unpredictable errors in the editing process, destroying the life of human embryo. Also, there is a problem that in vitro fertilization must be accompanied for editing. Genome editing of human embryo for human enhancement cannot be ethically accepted. In this case, others instrumentalize human embryo according to eugenic thinking, and cause inequality. Genome editing of human embryo for research can never be tolerated ethically. Because even if the outcome of the research brings enormous benefits to mankind, it puts the noble life of human embryo as collateral. 박테리아의 면역 체계를 활용한 3세대 CRISPR 유전자 가위는 이전 세대 기술과 비교하여 훨씬 높은 특이성과 효율성을 가지고 있다. 그리하여 유전공학과 관련된 광범위한 분야에서 널리 활용되고 있으며, 특히 난치 유전 질병의 치료 및 예방을 통해 인류의 복지와 건강에 크게 기여할 것이라 전망되고 있다. 그래서 CRISPR 기술은 개발된 이래 지금까지 다양한 종류의 생물과 세포에서 사용되었다. 하지만 이 기술은 특정한 목적에 따라 인간 배아의 유전자 편집에도 적용될 여지가 있다. 한편 인간 배아는 수정된 순간부터 자신의 유전체 정보에 따라 내적인 통일성을 가지고 조직적으로 점진적으로 발달해가며, 인간 종의 한 개체로서 인간 존재의 본성을 가진 인격이다. 인격은 어떤 능력을 가지고 있어서가 아니라 이 세상에서 반복될 수 없는 유일한 존재이기 때문에 존엄하다. 따라서 인간 배아도 존엄한 인격으로서 다른 인간과 마찬가지로 가장 근본적인 가치인 생명을 보호받아야 하며, 수단이나 도구로 사용되어서는 안 된다. 그러므로 유전 질병 치료 및 예방 목적의 인간 배아 유전자 편집은 윤리적으로 정당해 보인다. 그러나 편집 과정에서 CRISPR 기술이 예측 불가능한 오류를 일으켜 도리어 배아의 생명을 파괴할 위험이 있고, 편집을 위해서는 체외수정이 동반되어야 한다는 문제가 있다. 증강 목적의 인간 배아 유전자 편집은 존엄한 인격으로서 자신의 삶을 풍부하게 실현해 나갈 인간 배아를 우생학적 사고에 따라 타인이 수정의 순간부터 도구화하여 불평등을 야기하므로 윤리적으로 용인될 수 없다. 마지막으로 연구 목적의 인간 배아 유전자 편집은 설령 그 결과물이 인류에게 막대한 이익을 가져다준다고 하더라도 인간 배아의 고귀한 생명을 담보로 한다는 점에서 윤리적으로 결코 용인될 수 없다.

유전자 편집 소 수정란의 효율적 생산 및 유전자 적중 효율 검증

김민지 대구대학교 대학원 2017 국내석사

형질전환 및 질환모델 동물 생산은 유전자 기능 연구와 질병 기전을 연구하는데 필수적이며 상업적으로 적용되어 고부가가치 산업으로도 주목 받고 있는 연구 분야이다. 그러나 현재까지 형질전환 및 질환모델 동물 생산에 있어서 타깃 유전자의 적중 기술에 의한 유전자 편집 수정란의 생산 효율이 매우 낮은 상황이다. 특히, 미세주입 기술을 이용한 타깃 유전자 적중 기술을 통해 형질전환 동물을 효율적으로 생산하기 위해서는 다양한 조건의 확립이 요구된다. 뿐만 아니라, 형질전환 수정란의 유전자 적중 여부 확인, 분석 및 품질 개선에 대한 연구가 추가적으로 필요하다. 따라서 본 연구의 목적은 유전자 편집 수정란의 지속적인 생산을 위한 미세주입 기술 조건 구축과 유전자 적중 효율 개선을 위한 시스템을 구축하는 것이다. 우선, 타깃 유전자 도입을 위한 미세주입기술에서 사용되고 있는 유전자 편집 기술의 조건을 구축하기 위해 효율이 가장 좋았던 넉인 벡터를 선택하여 실험에 사용하였다. 유전자 편집 기술인 CRISPR/Cas9 시스템에 사용되는 nuclease을 Cas9 protein과 mRNA 두 군으로 나누어 실험을 수행하였다. 미세주입된 배반포들의 GFP 발현 및 유전자 적중율을 확인해 본 결과, Cas9 protein을 사용한 군에서 그 효율이 mRNA를 사용한 군보다 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 다음으로 타깃 유전자 도입을 위한 미세주입과정에서 발생되는 물리적 손상을 줄여 준다고 알려진 cytochalasin B(CB)를 조작용 용액에 첨가하여 수정란에 미세주입을 실시한 후 생존율을 조사하였다. 그 결과, CB를 첨가한 수정란에서 배반포 발달율(18.5 ± 2.0%)이 CB를 첨가하지 않은 대조구(11.2 ± 3.5%) 보다 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 이후, CB 첨가 조건에서 미세주입된 수정란의 배반포 발달과 품질 향상에 도움을 준다고 알려진 멜라토닌(0.1 µM)을 첨가하여 체외배양을 실시하였다. 그 결과, 멜라토닌을 첨가한 그룹에서 배반포 발달율(23.8 ± 4.9%)이 멜라토닌을 첨가하지 않은 대조구(18.2 ± 2.2%) 보다 유의적으로 증가하였다. 또한, 타깃 유전자 도입을 위해 미세주입 후 수정란에서 DNA 손상이 발생하게 되는데 이러한 DNA 손상을 줄여준다고 알려져 있는 멜라토닌을 첨가하여 생산된 배반포를 대상으로 면역형광염색법을 이용하여 DNA 손상을 확인하였다. DNA 손상 단백질인 H2AX139ph와 DNA 복구 단백질인 RAD51을 이용하여 DNA 손상을 확인한 결과, 멜라토닌을 첨가한 그룹에서 DNA 손상이 더 많이 복구가 된 것을 확인하였다. 결론적으로 본 연구결과는 형질전환 및 질환모델 동물 생산에 있어서 기반이 되는 타깃 유전자 도입을 위한 효율적인 미세주입 조건과 높은 품질의 배반포 생산 체계를 구축함으로써 유전자 편집 수정란의 지속적이고 안정적인 생산과 궁극적으로 유전자적중 동물의 생산에 기여할 수 있을 것으로 기대된다. Production of transgenic animals in mammals has been applied in various fields, such as commercial applications, diseases models and recombinant biomedical proteins production. Transgenic animals have been produced using direct transfer methods of target gene editing by microinjection. However, the producing efficiency of gene edited embryos in livestock is very low. Therefore, the objective of this study is production of high quality blastocyst and establishment of appropriate microinjection condition for introduction of target gene. First, I identified the bovine embryos development until blastocyst stage after microinjection by using CRISPR/Cas9 system according to protein or mRNA of Cas9. As a results, I confirmed that blastocyst development of Cas9 mRNA injected group was significantly increased than that of Cas9 protein injected group (Cas9 mRNA: 25.6 ± 13.4% vs Cas9 protein: 18.9 ± 1.3%; p < 0.05). And, green fluorescence protein (GFP) expressions were detected in most of blastocysts derived from Cas9 protein and Cas9 mRNA injected groups. Also, the gene targeting rate of blastocysts were increased in embryos of Cas9 protein injected group compared to embryos of Cas9 mRNA injected group (p < 0.05, Cas9 protein; 30% vs Cas9 mRNA; 19%). Then, I treated the cytochalasin B (CB) within injection medium for reduction of microinjection damage, and microinjected embryos were cultured in CR1aa medium supplemented with 0.1 µM melatonin. As a result, blastocysts development of microinjected embryos in CB treated group was significantly higher than that of non-treated group (CB+: 18.5 ± 2.0% vs CB-: 11.2 ± 3.5%; p < 0.05). After performing of microinjection under CB treated condition, I investigated the developmental capacity and blastocyst quality by treatment of melatonin (Mela, 0.1 µM) in culture medium. As expected, the embryo developmental competence of microinjected embryos was significantly increased in Mela+ embryos compared with Mela- group (Mela+: 23.8 ± 4.9% vs Mela-: 18.2 ± 2.2%; p < 0.05). Next, to investigate DNA damage in blastocyst stage embryos, fluorescence expressions of H2AX139ph (DNA damage protein) and RAD51 (DNA repair protein) were observed by using immunofluorescence staining. DNA damage in developing blastocysts was reduced in the CB and Mela treated embryos. In this study, I verified the improvement of knock-in efficiency in microinjected bovine embryos by using Cas9 protein. Also, my results demonstrated that positive effect of CB and Mela treatment improves the embryonic developmental competence and their blastocysts qualities via reduction of microinjection damage in gene editing bovine embryos.

벼와 토마토에서 유전자가위를 이용한 HY5 유전자 편집

박현서 원광대학교 일반대학원 2022 국내석사

HY5 유전자는 asn-arg/lys-leu의 서열로 구성된 bZIP 도메인을 갖고 있으며, 식물의 발달과 생합성, 다양한 신호전달체계에서 많은 역할을 하는 유전자이다. 애기장대에서 유전자의 기능에 대한 많은 연구가 진행되었지만 작물인 벼(Oryza sativa)와 토마토(Solanum lycopersicum)에서는 연구가 많이 진행되지 않았다. 애기장대의 HY5 유전자의 orthologues 분석과 phylogenetic tree 분석을 통해 벼와 토마토에서 OsHY5.1, OsHY5.2, OsHY5.3, SlHY5 유전자를 각각 확인했다. 확인된 유전자를 기반으로 OsHY5s와 SlHY5 유전자를 클로닝 하였으며, CRISPR/Cas9 system을 이용해 유전자를 편집했다. 편집한 유전자는 deep-sequencing과 sanger-sequencing을 통해 유전자 염기서열의 편집을 확인하였다. OsHY5.1 유전자는 target1에서 36bp, 39bp, 25bp의 염기가, target2에서 159bp의 염기가 결실된 것이 확인되었다. 편집된 식물체의 아미노산 서열을 바탕으로 단백질 서열을 분석하였고 target1의 25bp와 target2의 159bp가 삭제된 식물체에서 단백질의 비정상적 번역으로 early stop codon이 생성된 것을 확인했다. OsHY5.2 유전자는 target1에서 46bp, 40bp의 염기가, target2에서 14bp의 염기가 결실되었다. 세 패턴 모두 단백질의 비정상적 번역에 의해 early stop codon이 생성된 것을 확인했다. OsHY5.3 유전자는 아데닌(A)과 티민(T)이 삽입된 두 개의 패턴과 6bp가 삭제된 한 개의 패턴으로 총 3개의 패턴을 확인했다. 세 패턴 모두 종자의 크기가 왜소하고 뿌리 발육이 좋지 못했으며 발아율이 현저하게 낮은 것을 볼 수 있었다. 또한, 티민이 삽입된 패턴의 경우 야생형과 비교하여 엽색이 뚜렷하게 옅은 것을 확인할 수 있었다. 아데닌이 삽입된 패턴은 단백질의 비정상적 번역에 의해 종결 코돈이 생성되지 않는 것을 확인했으며, 티민이 삽입된 패턴은 그 위치에 바로 종결 코돈이 생성돼 early stop codon을 확인했다. 6bp가 삭제된 패턴은 도메인의 앞쪽 단백질 2개가 결실된 것을 확인하였다. SlHY5 유전자는 2bp, 49bp의 염기가 삭제된 두 패턴을 확인했다. 두 패턴 모두 단백질의 비정상적 번역에 의한 early stop codon을 확인할 수 있었다. 엽색이 녹색인 야생형과 비교하여 돌연변이 식물체에서는 옅은 연두색을 띠었고 잎의 끝에서부터 하얗게 말라가다가 결과적으로 회복이 되지 않는 표현형을 보였다. 본 연구에서는 벼와 토마토에서 CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 벼에서 총 11개 패턴의 순계 계통 식물체와 토마토에서 2개 패턴의 순계 계통 식물체를 각각 확보하였고 토마토 야생형 식물체에서 조직별로 HY5 유전자의 발현량을 확인하였으며 염기의 삭제 또는 삽입에 의한 단백질의 이상 번역, 이에 따른 표현형을 확인했다. 또한, 토마토에서 HY5의 과발현 식물체 2개 계통을 확보하였다. 추후 연구를 통해 앞서 확보한 돌연변이 식물체와 함께 과발현 식물체를 확보하여 벼와 토마토에서 HY5 유전자의 기능을 밝히는 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다. The HY5 gene is a transcription factor comprising a bZIP domain family with asn-arg/lys-leu motif. It has been found to play a variety of roles in plant developmental stage, biosynthesis, and several signaling pathways in Arabidopsis thaliana. However, there are few studies of the HY5 gene in rice (Oryza sativa) and tomato (Solanum lycopersicum). Through the orthologues analysis of Arabidopsis HY5 gene, three of OsHY5.1, OsHY5.2, OsHY5.3, and single SlHY5 genes are isolated in Rice and Tomato, respectively. Cloning of OsHY5 and SlHY5 was conducted based on the separated genes, and genes were edited using the CRISPR/Cas9 system. Editing of the target gene was confirmed through deep-sequencing and sanger-sequencing. The OsHY5.1 gene had 36bp, 39bp, and 25bp bases deleted from target1 and 159bp bases deleted from target2. Protein sequences were analyzed based on the amino acid sequence of the edited plants, and 25bp of target1 and 159bp of target2 were found to have been generated early stop codons by abnormal translation of proteins in the deleted plants. The OsHY5.2 gene was deleted 46 bp and 40 bp bases from target1 and 14 bp bases from target2. In all three patterns, it was confirmed that early stop codon was produced by abnormal translation of proteins. The OsHY5.3 gene identified a total of three patterns: two patterns in which adenine (A) and thymine (T) were inserted and one pattern in which 6bp was deleted. In all three patterns, it was confirmed that the seed size was small, the root showed an impaired phenotype, and the germination rate was significantly low. In addition, in the case of a pattern in which thymine was inserted, it was confirmed that the leaf colour was clearly pale green compared to the wild type. It was confirmed that the pattern in which adenine was inserted did not produce a termination codon by abnormal translation of the protein, and the pattern in which thymine was inserted created immediately at that location, confirming the early stop codon. In the pattern in which 6bp was deleted, it was confirmed that two proteins in the front of the domain were lost. The SlHY5 gene identified two patterns in which 2bp and 49bp bases were deleted. Compared to the wild type, the leaf colour turn pale green, and it showed blight phenomenon from the end of the leaf and eventually died. In both patterns, early stop codon due to abnormal translation of proteins were confirmed. In this study, CRISPR/Cas9 technology was used in rice and tomato to obtain a total of 11 patterns in rice and 2 patterns in tomato, the expression level of the HY5 gene by WT tissue in tomato was confirmed, and abnormal translation of proteins by deletion or insertion of bases, and phenotypes accordingly were confirmed. In addition, two lines of overexpressed plants of HY5 gene were secured in tomato. Through further research, it is thought that research should be conducted to reveal the function of the HY5 gene in rice and tomato by securing overexpression plants along with mutant plants previously secured.

자유주의 우생학에 관한 생태신학적 비판 및 재구성

김광연 연세대학교 대학원 2018 국내박사

Throughout history, people have recognized that “to be a superior race means to have extraordinary intelligence, appearance, healthy body and spirit” differentiating the ordinary. Since the criterion to determine a superior human entirely depends on the contemporary perspectives such as sociocultural values, a standard to be a superior gene also must be various. Although it does not form a social consensus in the definition, every human being’s desire to get a superior DNA is gradually coming to reality by means of eugenics. The eugenics has been developed in two ways: one is the‘negative eugenics’that eliminates recessive trait and/or disqualified character; the other is the‘positive eugenics’that takes only dominant trait through gene selection. As time passes, however, the eugenics finally is transformed into liberal eugenics which is going in accordance with bioengineering technology. The liberal eugenics, unlike the former theory, is to strengthen the superior gene only by means of DNA selection based on individual freedom of human right. The goal of liberal eugenics is to heal all the diseases and ailment, and to improve human species as well. When it comes to the first issue of ‘healing diseases’, it helps the pregnant pre-moms give birth a healthy baby by prenatal diagnosis to see if there is genetical problem and/or eliminating serious DNA, they would take prior action to avoid it when something wrong is found accordingly. Regarding the second issue of ‘improving human species’, it serves for the pregnant women to get superior baby having aid of gene selection. This technology recently leads to gene editing, DNA manipulation, personally customized baby, and even human cloning. Unlike the prenatal diagnosis aimed for healing ailment, artificial improvement of gene might cause a bio-hierarchy system, so-called ‘genetical discrimination’which has nothing to do with simple healing or genetical improvement. The appearance of spoon-class in modern society (new hierarchy in human dignity classifying human by inherent status) may bring about‘life-politics’causing acute struggles between the ruler and the ruled. It also leads to polarization in human society and finally brings side effects such as status adhesion, or unnecessary bias on human dignity innate. In many ways, the technology of gene editing and customized baby is closely connected with human basic right as well. By the emerging of gene manipulation skill, traditional understanding of human being has faced new challenges. Cloning technology in the age of liberal eugenics, is carrying out new experiments such as gene editing of embryo, customized baby, human cloning under the cloak of improving human species. In this chaotic situation, the needs of new stage about human dignity will soon rise to the surface. Though the eugenics has many appropriateness on theory, it has left variety of ethical problems behind as well. This study is designed to investigate the pros-and-cons around gene editing, personally customized baby, and species improvement in human cloning. Based on many debates and arguments, it tries to provide some insight in a sound doctrine of human-centered biotechnology or the biblical/theological perspective of bioengineering. Having the above issues in mind, this dissertation is designed to establish a eco-centered view and its eco-theological critique of liberal eugenics in terms of the following four aspects. First, the traditional understanding of human being especially in theological field is too outdated to criticize the rapidly developing view on liberal eugenics. In this context, a new counteraction is strongly needed to cope the huge upheaval of natural science with a competitive measure based on the communal responsibility of human dignity. As biotechnology is so uncertain in its essence and future result, the negative side of it is also clearly presented as much as positive one. Nobody can fathom the chaotic outcome that biotechnology might bring. Second, this study criticizes human-centeredness that recent biotechnology has in itself. On this groundwork, a new significance of human dignity will be highlighted in eco-theological perspective. This argument will proceed not only to defend the ontological ground but also for a new understanding of Christian anthropology. Third, this article shows a considerable countermeasure to make up for an aperture brought by communicational dissonance between natural science and religious doctrine. In comparison to the liberal eugenics showing a dazzling development, the corresponding effort of the theological area is still short to overtake. To make the gap narrow, this researcher provides a ground for mutual dialogue to discuss life-discourse. Finally, the study gives a negative comment on species discrimination and its side effect, so-called status dissension, from which it is suggested a life-egalitarianism, as Jesus says in the Sermon on the Mount as a universal command to all humankind“love your neighbor as yourselves.”The Lord Jesus lowered Himself even to the sinner comforting them. The incident of washing the disciples’feet was a typical example of life-egalitarianism. His caring for the socially marginalized can be a ground for rebuttal. The most urgent thing to be done is to reshape Jesus’s teaching. His love reaches every realm of nature in which all mankind live and breathe. As seen above, this study analyses some fabrications of modern technology in a critical way such as gene & embryo editing, gene-political issues, and liberal eugenics. Consequently, several findings will come up with a new countermeasure debated in context of‘ethical responsibility of community’and‘life-egalitarianism.’ Unlike the past, the future of biotechnology is very closely at hand. The age of human cloning will come shortly, and when it comes to reality, relationship between the cutting edge of technology and its ethical significance collectively might be shaken altogether. The future will come entirely depending on current technology and its ethical interpretation indeed. To cope with this huge challenge, the Christian community in this human cloning age has to take a corresponding countermove in advance not only in individual dimension but also en masse. For the reason, this dissertation strongly suggests a ground for mutual dialogue among bioengineering experts, legal scholars in medical treatment, bio-ethicists, and health care-ethicists etc. The Christian community as a whole has to cope with the huge challenge of natural science especially in biotechnology. A human clone is also a human having its own dignity. Albeit it has somehow disparate or repulsive feeling, The bioethics-centered community of Christian perspective has to rise to a higher ground in this hot and competitive debates. 과거에 사람들은“탁월한 인종이 된다는 것은 남들과는 다른 지능과 외모, 건강한 체형과 정신을 갖추는 것”이라고 알고 있었다. 탁월한 인종이란 기준은 어디까지나 그 사회나 문화 내에서 제시되어진 것이기 때문에 상대적일 수밖에 없고 가치관의 다양성 만큼이나 좋은 유전자의 기준도 각기 달랐다. 이런 상대적 기준에도 불구하고 좋은 유전자를 얻고 싶어 하는 인간의 소원은 우생학이 등장하면서 이룰 수 있게 되었다. 자유주의 우생학은 질병치료와 인간 종(種)의 개량을 목표로 한다. 먼저 질병 치료의 기능은 유전적 질환 여부를 사전에 검사하고 예방하는 차원으로 심각한 질환을 가진 유전자를 선별하여 특정 유전질환을 예방하는 것과‘산전 진단’을 통해 건강한 아이를 출산할 수 있게 해 준다. 다음으로 인간 종의 개선을 목적으로 하는 자유주의 우생학은 인류에게 유전자를 선별하여 우수한 유전형질을 가질 수 있게 해주었다. 이 기술은 유전자를 조작하고 선별해서 유전자 편집과 맞춤아기는 물론 인간복제 기술까지 이어지는 실험이다. 유전적 질병 치료를 목적으로 하는 유전자 검사와 산전 진단과는 달리 복제 기술과 맞춤형 아기, 유전자 선별을 통한 개량은 단순한 질병치료와 종의 개선을 넘어 유전자 차별로 인한 생명계급을 초래할 수 있다. 생명계급의 발생은 지배와 피지배 사이의 격차를 낳게 하기 때문에 생명정치의 영역으로 이어지게 된다. 뿐만 아니라 계층 간의 심한 양극화로 야기되는 생명계급 발생과 위계는 사회적 신분의 고착화와 신분의 차별과 같은 많은 문제를 야기할 수도 있다. 그리고 생명공학 시대에 유전자 편집 기술과 맞춤아기를 만드는 기술은 단순한 종의 개량을 넘어 인간 존엄성과도 밀접하게 연결된다. 오늘날 유전자 조작과 관련된 실험이 등장하면서부터 과거 전통에서 다룬 인간 존엄성과 인간 이해의 방법들은 한계를 드러내기 시작했다. 자유주의 우생학 시대에 시행되는 복제 기술은 인간 출생 이전의 존재, 즉 유전자 편집, 디자이너 베이비(designer baby), 인간 복제 등 우수한 종의 개량을 목적으로 실험들이 진행되고 있어서 인간 존엄성에 대한 새로운 이해와 방법들이 더욱 절실하게 되었다. 우생학은 분명 인간의 질병을 치료하고 생명을 연장시키는 데 명분을 가지고 있지만 이 명분 이외에도 많은 윤리적 문제를 가지고 있다. 이를 염두에 두고 이 논문은 자유주의 우생학의 목표 가운데 하나인 유전자 편집과 맞춤아기, 복제 기술을 통한 인간 종의 개량에 나타나는 윤리적 문제를 살펴볼 것이다. 그리고 이러한 기술이‘생태중심’이 아닌, 인간의 편리성만을 추구하는‘인간중심성’과 연결되는 점을 인식하고, 생명공학 기술에 나타난 인간중심성의 출발점을 성서에서 발견하고 이에 대한 신학적 비판을 논의할 것이다. 이를 염두에 두고 논자는 자유주의 우생학 시대의 신학적 비판을 다음과 같은 목적을 가지고 연구하고자 한다. 첫째, 자유주의 우생학 시대에 인간 생명을 대상으로 생명공학자들은 유전자를 조작하고 실험을 연구하고 있다. 심지어 복제 기술이 등장하면서 기존의 신학적 인간이해는 한계가 있다. 이에 논자는 생명복제 시대에 필요한 신학적 인간 이해와 생태윤리를 제시하고자 한다. 둘째, 논자는 유전자 편집과 맞춤아기, 인간 종의 개량에 나타나는 윤리적 문제와 생명공학 기술의 이면에 자리 잡고 있는‘인간중심성’을 비판하고, 인간 중심성에서 비롯된 윤리적 문제를 논의하기 위해 생명공학 시대의 인간 이해를 살필 것이다. 인간 존재에 대한 생물학적 이해를 요구하는 시대에 논자는 인간 본성 회복과 인간 존엄성의 근거를 제시하여 인간 삶의 가치와 진정성의 중요성을 논의할 것이다. 셋째, 이 논문의 목표 가운데 하나는 신학과 생명공학 기술 사이의 소통의 부재에 대해 비판하는 것이다. 생명공학 기술의 발전과 함께 자유주의 우생학 시대가 열리면서 복제기술과 유전자 치료 및 조작 기술이 엄청난 속도로 발전하고 있다. 그러나 이런 과학 기술의 발전에 대한 신학적 이해와 성찰들이 한국 사회에서 아직 부족하다. 이러한 상황을 주시하면서 생명공학 기술과 신학적 이해 사이의 소통과 서로의 학문에 대한 교류 및 상호협력의 필요성을 언급할 것이다. 그리고 이 논문은 생명복제 기술 시대에 유전자 조작 기술과 인간 본성 길들이기, 배아편집 기술의 문제, 유전자 정치 등의 문제점을 인식하고, 자유주의 우생학에 대한 생태신학적 비판을 제시할 것이다. 자유주의 우생학 시대에 필요한 윤리적 방법으로‘공동체의 생태윤리’와‘생명평등주의’를 제시할 것이다. 우선 공동체의 생태윤리를 제시하는 이유는 기존의 신학적 전통과 새로운 생명공학 기술의 접점을 이루는데 한계가 있기 때문이다. 과학 기술의 발전 속도와 형이상학적이고 존재론적인 신학적 인간 이해가 서로 다르기 때문에 복제 시대에 맞는 신학적 접근과 책임이 요청된다. 그렇기에 일부 과거 전통을 고집하는 신학적 이해에서 벗어나 새로운 과학 기술을 적용하는 신학적 비판이 뒤따라야 하고 복제 시대에 요구되는 윤리가 제시되어야 한다. 논자는 복제 시대의 종차별과 계급 사회에 따른 생명계급 시대에 필요한‘생명평등주의’를 제시할 것이다. 예수 그리스도의 가르침과 정신에서 비롯된‘네 이웃을 네 몸과 같이 사랑하라’는 생명평등의 가치들을 성서적 입장에서 제시하고, 이를 통해 생명평등주의와 생명담론의 필요성을 제시할 것이다. 기존의 생명윤리에 관한 신학적 논의가 학계와 종교계에서 논의되고 대화하는 과정에서 너무 다른 견해를 보여주었다. 논자는 이들의 의견이 마치 평행선처럼 서로 접점이 불가능했던 한계를 인정하고, 피할 수 없는 복제 시대에 새로운 생명윤리 공동체를 제안하고 싶다. 미래 생명공학 시대는 과거와 달리 그 발전 속도가 너무 빠르게 진행되고 있다. 언젠가는 인간 복제시대가 도래하게 될 것이고 윤리적 성찰과 무관하게 과학 기술이 발전하게 되면 그 균형은 상실하게 된다. 미래의 어느 순간은‘갑자기’오는 것이 아니기에 다음 세대를 위해 현재의 과학 기술과 윤리적 성찰이 필요하다. 기독교 공동체는 생명복제 시대를‘지금부터’준비하고 어느 순간 복제 인간과 유전자 변형으로 태어난 존재가 등장하게 되면 준비된 자세로 공동체에서의 역할을 다해야 할 것이다. 생명공학을 연구하는 과학자, 의료법학자, 생명윤리학자, 의료윤리학자 그리고 신학자들은 충분한 논의를 통해 생명윤리공동체를 만들어가야 한다. 이 공동체에서는‘생명담론윤리’를 제안하고 이 논의 과정에서 질병치료는 적극 권장하되, 인간의 지나친 이기심에서 비롯된 비윤리적인 실험과 인간복제 실험에 대해서는 비판해야 할 것이다. 끝으로 논자는 복제 시대는 언젠가 온다는 것을 전제로 미래 복제 시대에 대한 기독교 공동체의 준비를 요청할 것이다. 복제 인간은 우리와 동등한 존재를 가진 인간이다. 지금 당장 우리가 복제 인간에 대해 혐오감과 이질감을 가질 수 있지만‘기독교생명윤리공동체’가 구성되어 복제 인간에 대한‘거리두기’에서 그들을 따뜻하게 맞아주는‘가까이 다가가기’의 실천과 준비를 해야 할 것이다.