인간난관상피세포 및 Vero세포가 초기 생쥐배아의 발생에 미치는 영향에 대한 연구

김수곤 단국대학교 2002 국내석사

목 적 : 본 연구는 인간의 난관상피세포와 Vero세포를 각각 생쥐의 배아와 공배양함으로써 인간의 난관상피세포와 Vero세포의 공배양이 초기 생쥐배아의 발생에 미치는 영향에 대해 비교해보며, 공배양세포의 계대배양 및 동결-해빙이 공배양에 미치는 영향에 대하여 알아보고자 한다. 연구 방법 : 자궁절제술을 받은 가임기여성의 난관에서 채취된 난관 상피세포와 Vero세포를 배양하여 준비한 후, 생쥐에서 얻은 배아를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)을 첨가한 Ham's F-10 배양액에서 공배양하여 배아의 발달을 단계별로 관찰하고, Ham's F-10에 10% FBS가 첨가된 배양액에서 세포 없이 배아 단독으로 배양한 군을 대조군으로하여 비교 분석 하였다. 결 과 : 1. 난관상피세포 및 Vero세포와 공배양한 군에서 배아 발생률은 각각 81%와 79.5%로 나타났으며, 대조군의 65.5%에 비하여 유의하게 높게 나타났다(p<0.05). 난관상피세포 및 Vero세포와 공배양한 군에서 배아의 부화율(hatching)도 각각 63.5%와 60.5%로 대조군의 34.5%에 비해 유의하게 높게 나타났다(p<0.05). 2. 계대배양된 난관상피세포와 생쥐배아를 공배양하였을 때 배아의 발생률과 부화율을 살펴보면 각계대간 발생률 및 부화율에는 통계학적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다. 또한, Vero 세포와 생쥐배아를 공배양시 발생률과 부화율은 각각 83.3%와 63.3%로 계대배양된 난관상피세포와 생쥐배아를 공배양시와의 비교에서도 통계학적으로 유의한 차이가 나타나지 않았다. 3. 동결-해빙된 난관상피세포를 계대배양 후 생쥐배아와 공배양하였을 때 배아의 발생률과 부화율을 살펴보면 각계대간 발생률 및 부화율에는 통계학적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다. 또한 동결-해빙 후 배양된 Vero세포와 생쥐배아의 공배양에서는 발생률과 부화율은 각각 81.3%와 67.3%로 동결-해빙 후 계대배양된 난관상피세포와 생쥐배아를 공배양하였을 때의 발생률 및 부화율과 통계학적으로 유의한 차이가 나타나지 않았다. 4. 계대배양된 난관상피세포와 동결-해빙된 난관상피세포에서 생쥐배아와의 공배양시 각각의 발생률과 부화율은 유의한 차이는 나타나지 않았다. 또한 Vero세포와 동결-해빙된 Vero세포에서 생쥐배아를 공배양시 각각에서 발생률과 부화울은 유의한 차이가 나타나지 않았다. 결론 : 체외수정 시술에서 인간의 난관상피세포 및 Vero세포와의 공배양은 초기생쥐배아의 발달 및 부화에 증진 효과가 있음을 확인할 수 있다. 인간난관상피세포 및 Vero세포와 초기 생쥐배아를 공배양시 발생률과 부화율에는 유의한 차이가 없음을 관찰할 수 있다. 따라서 체외수정 프로그램시 인간난관상피세포나 Vero세포를 사용하여 공배양하면 임신성공률의 향상에 좋은 결과를 가져올 것으로 생각된다. 중심단어 : 공배양, 난관상피세포 Vero세포, 생쥐배아 Objective : The purpose of the study was to determine the effects of co-culture with oviductal epithelial cells and Vero cells on mouse embryo. The effect of the human oviductal epithelial cells and Vero cell on the development of the early mouse embryo was observed. The effect of subculturing and freezing and thawing on the co-culture was also observed. Method : For the control group, mouse embryos were cultured alone in Han's F10 with 10% FBS. Subcultured oviductal epithelial cell and Vero cell were cocultured in Han's F10 with 10% FBS with the mouse embryo and used as the treatment group. Development of mouse embryos were observed and were compared with the embryos cocultured with oviductal epithelial cells and Vero Cell. Result : 1. The development rate of embryos that cocultured with oviductal epithelial cell and Vero cell was significantly high (p<0.05) than control group. Hatching rate of embryos that co-cultured with oviductal epithelial cells and Vero cell was also significantly high (p<0.05) than the control group. 2. When subcultured oviductal epithelial cells were co-cultured with mouse embryo, there was no significant difference in development rate and hatching rate among subculture step. The development rate ans hatching rate between Vero cell and subcultured oviductal epithelial cells that cocultured with mouse embryo, has shown no significant difference. 3. When oviductal epithelial cells that have been frozen-thawed were co-cultured with mouse embryo, there was no significant difference in development rate and hatching rate among subculture step. The development rate and hatching rate between frozen-thawed Vero cell and subcultured frozen-thawed oviductal epithelial cell that cocultured with mouse embryo, has shown no significant difference. 4. No statistical significance was seen in the development rate and hatching rate between subcultured oviductal epithelial cells and frozen-thawed oviductal epithelial cells when cocultured with mouse embryo. No statistical significance was seen in the development rate and hatching rate between Vero cells and frozen-thawed when cocultured with mouse embryo. Conclusion : Oviductal epithelial cells and Vero cell may have a stimulatory role in early mouse embryonal development compared to control in vitro. There is no difference in coculture effect of oviductal epithelial cells and Vero cell on development of mouse embryo. As well, there is no significant difference was seen in development rate and hatching rate among subculture step, when early mouse embryo was cocultured with cells that subcultured and frozen-thawed. In IVF programs, it is believed that co-culturing with oviductal epithelial cells and Vero cell will increase pregnancy rate. Key words ; Oviductal cell, Vero cell, Coculture, Mouse embryo

치성낭종 상피세포의 증식, 분화 및 세포능동사망현상에 관한 면역조직화학적 연구

정성훈 강릉대학교 대학원 1999 국내석사

치성낭종 상피세포에 있어서의 증식성, 분화 활성 그리고 세포능동사망현상(apoptosis)을 알아보고자, 강릉대학교 치과대학 구강악안면외과에 내원한 환자들에게서 적출된 치성낭종 19례에 대하여 상피세포 증식기전에 연관되어 있다고 알려져 있는 세포증식 관련인자인 증식세포핵항원(proliferating cell nuclear antigen, PCNA), Ki-67, Rb 단백질, c-erbB-2 단백, MPM-2와 세포분화인자인 transglutaminase C, 열충격단백질 70(heat shock protein 70), 그리고 세포능동사망현상에 대한 면역조직화학적 연구를 시행하였다. 본 연구에서는 치성낭종 상피의 각화상태, 증식상태 및 염증상태를 조직학적으로 판별한 후 이에 따른 각종 세포 증식인자, 세포 분화인자 및 세포능동사망현상을 관찰할 수 있는 인자의 발현을 정상 구강 점막세포에서의 발현과 비교, 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 치성낭종 상피의 증식성은 PCNA, Ki-67, MPM-2, c-erbB-2, Rb 단백질의 항체를 이용하여 관찰한 결과 정상 구강점막에 비하여 다소 낮게 관찰되었으며, 비각화성 낭종상피보다는 각화 낭종상피에서 훨씬 증가되어 있었고, 염증세포 침윤으로 인한 대상성 상피증식 부위에서는 세포 증식이 매우 증가되어 있었다. 2. 치성낭종 상피의 분화성은 transglutaminase C를 이용한 항원성을 관찰한 결과 일반적으로 정상 구강 점막상피에 비하여 낮은 양성 반응을 보였고, 단방성이고 각화가 잘 되었으며 상피의 두께가 20-30층으로 비후되어 있는 치성낭종 상피에서는 각화층에 국한되어 강한 양성 반응을 보였다. 또한 열충격단백질 70은 모든 치성낭종 상피세포에서 강한 양성반응을 보였다. 3. 세포능동사망현상은 비각화 낭종상피에서는 관찰되지 않았고, 각화 낭종상피의 부분적으로 탈락되는 상피세포에서 양성반응이 관찰되었다. 4. 다방성이고 얇은 상피층을 갖는 치성 각화낭종(odontogenic keratocyst)에서는 낭종상피 전반에 걸쳐 transglutaminase C의 발현이 증가되어 있으나, 세포 증식인자의 발현은 구강점막 상피세포와 비교하여 대부분 낮게 관찰되었다. 5.특히 염증성 증식을 보이는 낭종상피에서는 세포 증식인자가 전 세포층에서 미만성으로 발현되었다. 결론적으로 치성낭종 상피세포는 정상 구강 점막상피에서보다 세포 증식인자의 발현이 저조한 것으로 나타났으며, 낭종상피의 분화 활성도는 낭종 내부의 염증세포 침윤이나 간엽조직에서 발생되는 자극에 의하여 크게 영향을 받을 것으로 추론되었다. The epithelium of odontogenic cysts seems to be in a specific status of cellular proliferation and cytodifferentiation. With the discovery of various genes which might play essential roles in the specific stages of cellular proliferation and differentiation, the cellular conditions of odontogenic cyst epithelium should be reevaluated. This study aimed to estimate the degree of proliferating, differentiating and apoptotic activities of odontogenic cyst epithelium using antisera of PCNA, Ki-67, Rb protein, c-erbB-2 oncoprotein, transglutaminase C, heat shock protein 70 and ApopTag method in 19 cases of odontogenic cysts. Cellular changes of the cyst epithelium were measured by intensity of each immunohistochemical staining, and they were discussed with the influence of inflammatory cell infiltration into the cyst epithelium. Results were as follows: 1. In the immunohistochemical staining with primary antibodies against PCNA, Ki-67, Rb protein, c-erbB-2 protein and MPM-2, almost all cases of odontogenic cysts showed a diffuse weak positive reaction. 2. Expression of transglutaminase C in the non-keratinizing odontogenic cysts was weakly positive, but a strongly positive transglutaminase C expression was shown in the keratinizing layer of keratinizing odontogenic cysts. And heat shock protein 70 showed a strongly positive reaction in all of odontogenic cysts. 3. Occasionally, a few apoptotic body was observed in the superficial keratin layer. 4. In the odontogenic keratocysts, which are multilocular with a thin epithelial lining, proliferating factors were weakly positive, whereas transglutaminase C immunostaining was increased. 5. In the hyperplastic cyst epithelium due to inflammatory reaction, proliferating factors were diffusely positive in all epithelial layers, whereas proliferating and differentiating factors were almost negative in severe inflammatory condition showing degenerating lining epithelium. From the above results, we presumed that the endogenous proliferating activity of the cyst epithelium was lower than that of normal oral mucosa epithelium, and also supposed that the cyst epithelium could be reactivated for the further proliferation by the exogenous factors of inflammatory reaction and any chemicophysical irritations.

In vitro 3차원 인체 결막 조직 모델 개발

이채영 동아대학교 대학원 2021 국내석사

동물 윤리적 측면에서뿐 아니라 인체 생리와의 낮은 연관성으로 인해 동물실험을 대체할 수 있는 시험법에 대한 요구가 증가하고 있다. 인체세포를 이용한 3차원 세포배양모델은 인체 내 환경을 더 잘 모사할 수 있어 세포생물학 연구와 약물 검사를 위한 동물대체시험법으로 제시되고 있다. 결막은 안과계 약물의 주요 투여 경로로 이용되기 때문에 신약 개발 과정에서약물 전달체계와 안정성 검사에 응용할 수 있으며 인체 생리 환경을 잘 모사하는 in vitro 인공 인체 결막 조직 모델 개발에 대한 요구가 증가하고 있다. 본 연구는 polyvinyl alcohol(PVA)와 poly-ε-caprolactone(PCL) 나노섬유 지지체를 이용하여 인체 결막 상피세포와 섬유모세포를 공동배양하여 3차원 인공 인체 결막 조직을 재건하고자 하였다. 인체 결막 상피세포 및 섬유모세포는 백내장 수술로 제거된 잉여의 인체 결막조직에서부터 초대배양하여 사용하였다. PVA 지지체 위에 배양한 인체 결막 상피세포는 PCL 지지체의 nano 측이나 micro 측에 배양한 세포보다 더 빨리 confluence에 도달하였다. PVA 지지체 위에 배양하여 confluence에 도달한 인체 결막 상피세포는 7일 이상 장기간 배양 시 부착되었던 세포가 탈락하였으나, PCL 지지체의 micro 측에 인체 결막 섬유모세포를 1주일 미리 배양한 다음 PVA 지지체 위에 결막 상피세포를공동배양한 경우는 14일이 지나도 confluence 상태가 계속 유지되었다. PVA 지지체 위에 배양한 인체 결막 상피세포가 PCL 지지체의 nano 측이나 micro 측에 배양한 세포보다 스트레스 섬ii유 형성은 감소하였고, ZO-1 단백이 세포 가장자리에 분포하였다. 인체 결막 섬유모세포가 배양된 PCL 지지체 위에 PVA 지지체를 이용하여 결막 상피세포를 공동배양한 경우 다른 공동 배양방식에 비해 상피세포가 기저막 세포외기질 성분과 부착하는데 관여하는 integrin β1과 vinculin이 세포 기저부에 많이 발현, 분포하고 있었으며, 기저막의 주 성분인 laminin이 세포 밑 바닥에 분포하는 양상을 보였다. 이상의 결과를 종합하면 인체 결막 섬유모세포를 PCL 지지체에 배양하여 인체 결막 유사 기질 환경을 조성한 다음, 그 위에 PVA 지지체를 이용하여 인체 결막 상피세포를 공동배양하는 방식이 장기간 세포배양이 가능한 3차원 인체 결막조직 모델을 작하는데 가장 적합하였다. PVA와 PCL 나노섬유 지지체와 인체 결막세포를 이용하여 제작한 3차원 인체 결막조직 모델은 안과 영역의 신약 개발 시 동물시험을 대체하여 약물 전달체계, 효능 및 안정성 검사에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. The needs for alternatives to animal models in drug testing are increasing due to not only ethical issues but also low relevance to human physiology. Three-dimensional (3D) culture models based on human derived cells can closely mimic in vivo tissues, and thus have become essential research tools in cell biology as well as drug discovery and testing. As the conjunctiva serves as a route for administration of ophthalmic drugs, there is an increasing demand for more physiologically mimetic in vitro conjunctival models to assess drug delivery and safety of new ocular medicines. However, 3D human conjunctiva models using human conjunctival cells and nanofiber scaffolds have not yet been developed. Present study has established an in vitro human conjunctival model using 3D co-cultures of human primary conjunctival epithelial cells and fibroblasts using polyvinylalcohol(PVA) and poly-ε-caprolactone(PCL) micro/nanofibrous scaffolds. The primary cultures of human conjunctival epithelial cells and fibroblasts were established from surplus tissue from surgical resection in cataract patients. Conjunctival cells cultured on PVA scaffolds reached confluence earlier than those cultured on both surfaces of PCL scaffolds in which conjunctival fibroblasts had been grown for 7 days. However, conjunctival epithelial cells cultured on PVA scaffolds alone were detached from the scaffolds after 7 days of culture while those cells co-cultured on fibroblast-grown PCL scaffolds were not detached and maintained confluence until 14 days. Conjunctival epithelial cells co-cultured on both surfaces of PCL scaffolds exhibited more abundant thick stress fibers and less localization of ZO-1 at the interfaces of neighboring cells. However, conjunctival epithelial cells co-cultured on PVA scaffolds displayed more distinct localization patterns of ZO-1 at the junctional region of the cell periphery as well as less stress fiber formation. In addition, with this co-culture method, fibroblasts produced extracellular matrix components more abundantly while epithelial cells expressed more integrin β1 and laminin and distributed them towards the cell basal membrane. Taken together, co-cultures of both human conjunctival epithelial cells on PVA scaffolds and conjunctival fibroblasts in PCL scaffolds might provide a useful 3D human conjunctiva tissue model for the long-term full-thickness culture to study ocular drug toxicity and delivery.

망막색소상피세포에서 protease-activated receptor(PAR)의 역할

이석준 연세대학교 대학원 2009 국내박사

Protease-activated receptor(PAR)는 초기에 thrombin 수용체로 알려졌으며 G-단백 결합 수용체(G-protein coupled receptor;GPCR)로서 독특한 활성 메커니즘을 가지는데 세포외의 protease에 의해서 N-말단 부분이 잘리게 되면 같은 수용체의 세포외 2번째 고리에 붙어서 신호전달이 활성화 된다.망막색소상피세포(retinalpigmentepithelialcell,RPE cell)는 혈액으로부터 포도당,레티놀,지방산과 같은 영양분을 광수용체로 운반해주며,다양한 성장인자를 분비하여 맥락막모세혈관내피 및 광수용체의 형태적 안정화에 관여한다.PAR는 지혈 및 세포 이동(migration),염증반응 및 통증에 관여하고 암세포의 성장과 전이에도 밀접히 관련되어 있다고 보고되었다.그러나 망막색소상피세포에서 PAR의 발현양상이나그 조절에 관한 연구는 아직 미흡하다.따라서 본 연구에서는 첫 번째로 망막색소상피세포에서 PAR의 발현 특성을 살펴보고,두 번째로 PAR의 망막색소상피세포에서의 신호전달 과정을 알아보고자 하였다.마지막으로 PAR의 활성과 염증성사이토카인(inflammatory cytokine)과의 관계를 알아보고자 하였다.이를 위하여형광 염료를 이용한 세포 내 Ca2+ 측정,실시간 역전사 연쇄중합반응,flexstation분석법과 같은 실험 방법을 이용하였으며,본 연구의 주요 실험결과는 다음과 같다.비선택적 PAR 효현제인 thrombin,trypsin에 의해 농도 의존적으로 세포 내Ca2+ 농도가 증가하였다(EC50=3.4±0.08 nM,EC50=25.4±0.13 nM).또한 선택적PAR 효현제인 TFLLR-NH2(PAR-1)과 SLIGRL-NH2(PAR-2)에 의해서도 세포 내Ca2+ 농도가 증가하였으며 이러한 증가는 세포 외액의 Ca2+과는 무관하게 내부에서 조절됨을 알 수 있었다.PAR 효현제 처리 시 증가된 Ca2+은 PLC 억제제인U73122(2 μM)의 전처치에 의해서 대부분 억제되는 것을 확인하였고,비활성 형태의 유사체인 U73343(2 μM)을 3분간 전처치 하였을 때는 변화가 나타나지 않았다.또한 IP3(inositol1,4,5-trisphosphate)수용체 봉쇄제인 2-APB (50 μM)의 전처치에 의해서 PAR 효현제에 의한 세포 내 Ca2+ 증가가 억제되는 것을 확인할수 있었으며,망막색소상피세포에서 IP3 수용체 아형 1~3이 모두 발현되어 있는것을 확인하였다.망막색소상피세포에는 PAR의 아형 1~4가 모두 발현되어 있으며 PAR-1,3이 주로 많이 발현되어 있는 것을 실시간 역전사 연쇄중합반응으로확인하였다.망막색소상피세포를 PAR 효현제로 24시간 처리 시 염증성 사이토카인인 TNFa(tumor necrosis factor-a)와 IL-6(interleukin-6)의 발현량이 증가하는것을 알 수 있었다.이상의 결과들로부터 망막색소상피세포에서 PAR 활성에 따른 세포 내 Ca2+ 조절은 PLC-IP3를 통해 이루어지고,PAR 활성화와 염증성 사이토카인의 증가가 연관되어 있음을 알 수 있었다.이는 망막색소상피에서 염증반응의 조절기전을 연구하는데 중요한 기초 자료가 될 것으로 생각한다.

구강백반증에서 상피와 섬유모세포의 이형접합성소실 분석

권정화 연세대학교 대학원 2008 국내석사

구강편평세포는 여러 단계의 발생 순서를 거치는 다단계 종양화과정(multistep carcinogenesis)에 의해 악성암종으로 진행하며 유전자 변이에 의해 상피이형성단계를 거쳐 악성으로 진행한다. 구강백반증이 악성암종으로 진행하는 빈도는 상피이형성의 여부에 따라 0∼43%로 나타나는데, 이렇게 정상 구강편평세포가 암세포로 변환하는 과정에서 종양유전자, 종양억제유전자, DNA 수복 유전자 등 여러 유전자에 대한 지속적인 변이의 축적이 나타난다. 최근에는 암종의 발생에 있어서 암세포뿐만 아니라 섬유모세포도 암의 진행 및 침윤과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.본 연구에서는 구강백반증 조직을 대상으로 상피와 섬유모세포 각각의 유전자 변이를 관찰함으로써 구강편평세포암종의 초기 발생단계에서 상피세포뿐 아니라 섬유모세포의 역할을 이해하고자 하였다. 레이저 포획 미세절제법(Laser Capture Microdissection)을 이용하여 상피세포와 섬유모세포 의 이형접합성소실(loss of heterozygosity, LOH)과 현미부수체 불안정성(microsatellite Instability, MSI)을 분석하였다. 실험 결과는 다음과 같다.1. 16명 환자의 구강백반증 조직에서 16예 모두 상피와 섬유모세포의 LOH가 나타났다. MSI는 16예 중 7예의 상피에서, 그리고 16예 중 8예의 섬유모세포에서 관찰되었다. 이 중 4예는 상피, 섬유모세포 모두에서 MSI가 나타난 것으로 관찰되었다.2. 26종의 표지자 중 4개의 표지자(D6S255, D8S264, D9S162, D21S1922)가 탐지하는 염색체 부위에서는 모든 환자의 상피와 섬유모세포에서 LOH /MSI가 관찰되지 않았으며 나머지 22종의 표지자에서는 모두 LOH/MSI를 관찰할 수 있었다.3. 환자별 상피, 섬유모세포 전체 LOH 결과를 표지자별로 비교하여 보면 염색체 21q11.1~21.1(D21S1911, 62.5%)에서 가장 많은 빈도의 LOH가 발견되었고 이어서 3p14~25(D3S1293, 56.25%), 11q22.3(D11S1778, 43.75%)과 9p21~22(D9S168, 43.75%), 17p12~14(D17S786, 37.5%) 등의 순으로 관찰되었다. 상피에서의 LOH가 가장 많이 나타난 위치는 염색체 8p21~23과 11q22.3이었고(4/16, 25%) 섬유모세포에서는 21q11.1~21.1에서 가장 많은 LOH가 발견되었으며(6/16, 37.5%), 상피와 섬유모세포에서 동시에 LOH가 나타난 빈도가 가장 많았던 위치는 염색체 3p14~25와 9p21~22이었다(4/16, 25%).4. 환자별 상피, 섬유모세포 전체의 MSI 결과를 유전자 위치별로 비교하여 보면 17p12~14(D17S786)와 11q22.3(D11S1778) 부위에서 18.75%(3/16)로 가장 많은 MSI가 발견되었고, 5q22.2(D5S421)와 10q22~23(D10S219), 10q25~26(D10S221)에서 12.5%(2/16)의 MSI가 관찰되었다. 이어서 5q21~23(D5S644)과 21q11.1~21.1(D21S120) 부위는 6.25%(1/16)의 MSI가 나타났으며 나머지 부위에서는 MSI가 관찰되지 않았다. 상피에서 MSI는 염색체 5q22.2와 5q21~23, 10q22~23, 11q22.3 위치에서 같은 빈도로 발견되었고(1/16, 6.25%) 나머지 예의 상피에서는 MSI가 관찰되지 않았다. 섬유모세포에서는 염색체 17p12~14에서 가장 많은 MSI가 관찰되었으며(3/16, 18.75%), 상피와 섬유모세포에서 동시에 MSI가 나타난 염색체 위치는 11q22.3뿐이었다(1/16, 6.25%). 특정 유전자에서 LOH/MSI가 발견되는 구강백반증 조직의 상피/기질 위치의 차이는 통계학적으로 유의성이 없었다(p>0.05).5. 상피 이형성은 16예의 구강백반증 조직 중 4예에서 관찰되었으며, 상피이형성이 있는 예에서의 LOH가 상피이형성이 없는 예에 비해 높게 나타난 유전자 위치는 6q25~27, 3p14~25, 11p14이었다. 이 중 염색체 6q25~27 부위는 통계학적으로 유의하였으며(p=0.05) 나머지 유전자 위치는 상피이형성 유무에 따른 LOH 빈도가 통계학적으로 유의한 차이가 없었다.이상의 연구 결과에서 구강백반증 조직의 상피뿐만 아니라 섬유모세포에서 또한 LOH/MSI가 나타남을 확인하였다. LOH는 구강백반증 전체의 조직에서 나타났으며 MSI는 특정한 일부 조직에서만 발견이 되었다. 이러한 결과로 보아 구강편평세포암종의 초기단계인 구강백반증에서도 상피세포의 유전자 변이와 더불어 섬유모세포의 유전자 변이도 동반됨을 알 수 있었다. 향후 이를 근거로 암 발생 초기 단계에 상피-섬유모세포 상호작용에 대한 규명이 필요할 것으로 사료된다. Oral squamous cell carcinoma(OSCC) occurs through a multistep process in which accumulated genetic alterations leads to malignant transformation. Oral leukoplakia is a common premalignant lesion in oral mucosa and the incidence of cancer progression from oral leukoplakia has been reported to be 0~43%. The genetic alterations of oncogenes, tumor suppressor genes and DNA repair genes occurs during carcinogenesis. Recently, it has been demonstrated that stromal fibroblasts could play a certain role in cancer development. In order to evaluate the role of epithelial cells and fibroblasts in the early stage of carcinogenesis, we analyzed the alterations of genetic heterogeneity in epithelial cells and fibroblasts of oral leukoplakia samples. Using Laser Capture Microdissection(LCM) system, microsatellite instability(MSI) and loss of heterozygosity(LOH) were analysed from the DNA of paired epithelial cells and fibroblasts from 16 leukoplakia samples.The results were as follows:1. All cases among 16 cases of oral leukoplakia have shown LOH in both epithelial cells and fibroblasts. 7 of 16 cases have MSI in epithelial cells and 8 of 16 cases have shown MSI in fibroblasts. 4 cases out of 16 oral leukoplakia have shown MSI in both epithelial cells and fibroblasts.2. LOH and MSI have not been detected from 4 markers(D6S255, D8S264, D9S162, D21S1922) out of 26 MSI markers. All the other 22 MSI markers have shown LOH or MSI.3. The incidence rate of LOH in oral leukoplakia have shown by descending order : 21q11.1~21.1(D21S1911, 62.5%), 3p14~25(D3S1293, 56.25%), 11q22.3(D11S1778, 43.75%), 9p21~22(D9S168, 43.75%), 17p12~14(D17S786, 37.5%). LOH at 8p21~23, 11q22.3(4/16, 25%) and at 21q11.1~21.1(6/16, 37.5%) has been detected most frequently in epithelial cells and fibroblasts, respectively. In addition, LOH at 3p14~25, 9p21~22(4/16, 25%) has been most frequently detected in both epithelial cells and fibroblasts.4. The incidence rate of MSI in oral leukoplakia have shown by descending order : 17p12~14(D17S786, 18.75%), 11q22.3(D11S1778, 18.75%), 5q22.2(D5S421, 12.5%), 10q22~23(D10S219, 12.5%), 10q25~26 (D10S221, 12.5%), 5q21~23(D5S644, 6.25%), 21q11.1~21.1(D21S120, 6.25%). MSI at 5q22.2, 5q21~23, 10q22~23, 11q22.3(1/16, 6.25%) in epithelial cells and MSI at 17p12~14(3/16, 18.75%) in fibroblasts has been observed with the highest incidence. In addition, MSI has been detected only at 11q22.3(1/16, 6.25%) in both epithelial cells and fibroblasts. Statistical significance has not been observed between the incidence of LOH/MSI and the cell types in oral leukoplakia tissues(p>0.05).5. Dysplasia has been detected in 4 cases out of 16 cases of oral leukoplakia. MSI markers with the higher incidence rate of LOH in the cases with epithelial dysplasia as compared to those without dysplasia are markers for 6q25~27, 3p14~25, 11p14. But, only the marker for 6q25~27 has shown statistical significance (p=0.05) while others has not(p>0.05).We have analyzed the incidence rate of LOH and MSI in epithelial cells and fibroblasts in 16 cases of oral leukoplakia. LOH in both epithelial cells and fibroblasts of all cases of leukoplakia while MSI has been observed in some cases. Taken together, this study showed that leukoplakia has genetic alterations in fibroblasts as well as in epithelial cells, suggesting that interaction between epithelial cells and fibroblasts might be involved in the early step of carcinogenesis.

사람 태아 망막색소상피세포에서 FasL와 TRAIL의 발현과 이들에 의한 림프구의 세포자살

김종욱 연세대학교 대학원 2002 국내박사

Tumor necrosis factor (TNF) superfamily에 속하는 Fas ligand (FasL)는 침윤된 T-림프구의 세포자살을 유도함으로써 전안부의 면역관용에 기여하는 것으로 알려져 있으나 T-림프구의 세포자살 유도에 관한 기전은 명확하지 않다. TNF superfamily중 TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)는 여러 종류의 세포에서 세포자살을 유도하며 임신 중의 자궁에서 FasL와 함께 림프구의 증식을 억제한다. 본 연구에서는 사람 태아 망막색소상피세포에서 사이토카인에 의한 FasL와 TRAIL의 발현과 이들 분자에 의한 T-림프구의 세포자살 유도를 규명하고자 하였다. 사람 태아 망막색소상피세포를 분리, 순수배양하고, FasL와 TRAIL의 발현을 역전사중합효소연쇄반응과 Western blotting으로 확인하였다. 사람 태아 망막색소상피세포에서 발현되는 FasL와 TRAIL에 의한 T-림프구의 세포자살 유도를 측정하기 위해 MOLT-4 세포와 PEER 세포를 사람 태아 망막색소상피세포와 함께 배양한 후에 이들 세포의 세포자살을 Annexin-V 염색으로 확인하였다. 사람 태아 망막색소상피세포는 FasL와 TRAIL의 mRNA를 지속적으로 발현하고 있었으며, interferon-γ (IFN-γ) 또는 TNF-α 자극 후에는 그 발현이 증가하였다. Western blotting의 결과를 통하여 TRAIL 단백질이 사람 태아 망막색소상피세포에서 지속적으로 발현되고 있을 뿐 아니라 IFN-γ 자극 후에 발현이 증가됨을 확인하였다. FasL에 의한 세포자살이 일어난다고 알려진 MOLT-4 세포를 사람 태아 망막색소상피세포와 함께 배양한 경우 세포자살의 정도는 대조군에 비해 큰 차이가 없었지만, TRAIL에 의한 세포자살이 일어난다고 알려진 PEER 세포를 사람 태아 망막색소상피세포와 함께 배양한 후에는 PEER 세포의 세포자살이 의미있게 증가하였다. 이상의 결과를 통하여 본 연구자는 사람 태아 망막색소상피세포는 FasL와 TRAIL을 지속적으로 발현하고 있으며, 사람 태아 망막색소상피세포에 의한 T-림프구의 세포자살 유도과정은 FasL 보다는 TRAIL에 의한 경로로 이루어지고 있을 가능성을 제시한다. Fas ligand (FasL), one of the apoptosis inducing members of the TNF (tumor necrosis factor) superfamily, and is believed to be a major contributor to ocular immune privilege. However, to date, the involvement of FasL on human fetal retinal pigment epithelial cell (HFRPE)―induced T cell apoptosis is not well defined. Recently, the TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) was identified as a member of the TNF superfamily, and found to induce apoptosis in a variety of cells. Moreover, FasL and TRAIL are known to cooperate in the mediation of lymphocyte apoptosis in the feto-maternal interface. In this study, we investigated FasL and TRAIL expression in HFRPE and investigated how HFRPE induces lymphocyte apoptosis. Pure HFRPE cells were isolated and cultured, and the expressions of FasL and TRAIL were examined using RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) and Western blotting. The role of FasL and TRAIL in HFRPE induced lymphocyte apoptosis were assessed. MOLT-4 or PEER cell line was cocultured with HFRPE and the apoptosis fraction was assessed by flow cytometry after Annexin V staining. Analysis by RT-PCR demonstrated that mRNAs encoding FasL and TRAIL were expressed constitutively on HFRPE, and that their expressions were increased when these cells were treated with IFN-γ (interferon-γ) or TNF-α. Western blotting demonstrated that TRAIL protein was expressed in HFRPE and that its expression was enhanced after IFN-γ treatment. After coculture with MOLT-4 or PEER cell lines, we detected many apoptotic fractions in the PEER cell line by flow cytometry, but not in the MOLT-4 cell line. Furthermore, the PEER cell line apoptosis increased when HFRPE was pretreated with IFN-γ. We conclude that FasL and TRAIL molecules are constitutively expressed on HFRPE, and that TRAIL-mediated apoptosis is more effective than FasL-mediated apoptosis in HFRPE.

인체의 중이와 비강상피세포에서 수분과 전해질 이동의 조절 기전 차이 : 상피 나트륨 통로와 낭성섬유증 막전도 조절자의 발현과 전기생리학적 기능

이주형 가천의과학대학교 대학원 2007 국내박사

서론 및 목적: 기도상피세포 내의 상피 나트륨 통로(epithelial sodium channel; ENaC)는 섬모주위액의 흡수와 능동적인 Na^(+) 이동의 주요 통로로 작용한다. 기도상피세포에서 Cl^(-)의 이동은 주로 낭성섬유증 막전도 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; CFTR)를 통해 이루어진다. 본 연구의 목적은 중이와 비강상피세포에서 수분의 흡수 및 분비조절에 관여하는 인자인 ENaC와 CFTR의 발현을 확인하고 전기생리적인 기능의 차이를 알아보기 위함이다. 재료 및 방법: 중이와 비강상피세포의 일차배양 세포주를 연구에 이용하였다. ENaC와 CFTR의 전기생리학적 기능 평가를 위해 중이와 비강상피의 배양 세포주에 amiloride(ENaC 길항제)와 forskolin(CFTR 활성제)을 처리한 후 단락전류를 측정하여 비교 분석하였다. ENaC와 CFTR의 발현을 평가하기 위하여 Western blotting 방법으로 분석하였다. ENaC와 CFTR의 수분흡수 기능을 평가하기 위하여 상피세포 표면에 수분을 추가한 다음 광학적 분석을 하였다. 결과: 중이상피세포에서 amiloride 처리 후의 단락전류는 비강상피 세포에서보다 증가되었고 forskolin 처리 후의 단락전류는 비강상피 세포에서보다 감소되었다. 중이상피세포에서 ENaC의 모든 소단위는 비강상피세포에서보다 강하게 발현되었고 CFTR은 약하게 발현되었다. 수분흡수율 변화에 대한 amiloride의 영향은 비강상피세포에서보다 중이상피세포에서 더 강했고 forskolin에 의해서는 비강상피세포에서 보다 중이상피세포에서 더 약하게 영향을 받았다. 결론: 중이상피의 수분과 전해질 조절은 주로 ENaC에서 이루어졌으며 CFTR의 역할은 ENaC에 비해 미약하였다. 전해질 이동 통로의 기능을 더 명확하게 규명하기 위하여 앞으로 동물의 생체 내 실험 및 또 다른 전해질 이동 통로에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다. Introduction and objectives: The epithelial sodium channel(ENaC) is essential for periciliary fluid absorption and active Na^(+) transport. Chloride transport in the epithelium of the airway occurs through the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR). The objects of this study were to evaluate the protein expression of ENaC and CFTR and to compare the electrophysiologic activity of ENaC and CFTR in normal human middle ear epithelial(NHMEE) cells with those in normal human nasal epithelial(NHNE) cells. Materials and methods: Primary cultures of NHMEE and NHNE cells were prepared. The samples of epithelial culture were voltage clamped and short-circuit current was measured after treatment of amiloride(ENaC inhibitor) and forskolin(CFTR activator). Western blotting was performed to evaluate the expression of ENaC and CFTR proteins. The absorption rate was measured by optical analysis after applying fluid to the luminal surface of cells in order to evaluate the role of ENaC and CFTR in fluid absorption. Result: The mean amplitude of the ISC by amiloride, which reflects the activity of the ENaC is much larger in the NHMEE cells than in the NHNE cells. The forskolin-induced short-circuit current was significantly smaller in the NHMEE cells than in the NHNE cells. ENaC was detected in the NHMEE cells and its expressions were stronger than those in the NHNE cells. CFTR was also detected in the NHMEE, however its expression was weaker in the NHMEE cells than in the NHNE cells. The NHMEE cells showed higher amiloride-dependent fluid clearance than NHNE cells. In contrast, forskolin-dependent fluid clearance was much lower in the NHMEE cells than in the NHNE cells. Conclusion: We have demonstrated that the regulation of fluid and electrolyte transport in NHMEE was mainly performed through the ENaC. The role of CFTR was limited compared to that of ENaC. This study is limited because of in vitro data. It is necessary to study in vivo data and other ion channels.

구강점막 각화상피세포의 피부 재상피화 유도

김현실 연세대학교 대학원 2006 국내박사

The aim of this study was to investigate the wound healing effect of primary cultured oral mucosal keratinocytes and to assess their roles in skin wounds. Primary cultured and suspended oral mucosal keratinocytes, labeled with BromodeoxyUridine(BrdU), were scattered onto 1.5㎝×1.5㎝ sized full thickness skin defects of the adult female nude mice in the graft group(N=15), and no grafts were placed in the control group(N=15). They were sacrificed at 3 days, 1 week and 2 weeks after treatment. Histological examination of each wound was performed to review the healing progress by measuring the length from the wound margin to the regenerating epithelial front. The fate of keratinocytes was assessed by double immunohistochemical staining with anti-BrdU and anti-cytokeratin AE1/3 in the graft groups. The wound was completely covered with regenerating epithelia in 2 weeks in the graft group, but was partially covered with regenerating epithelia in the control group. The immunohistochemical studies revealed that most of regenerating epithelial cells was induced from marginal epithelium of the margin, not from the scattered keratinocytes. Expression of interleukin-1α(IL-1α), interleukin-6(IL-6), keratinocyte growth factor(KGF) were determined for both graft and control groups by western blot analysis respectively, which demonstrated that oral mucosal keratinocyte underwent a staged response to wounding by production of pro-inflammatory cytokines(IL-1α, IL-6) and growth factors(KGF). To verify the effect of the cytokine, human recombinant IL-1α(rh IL-1α) was treated instead of oral mucosal keratinocyte transplantation. The IL-1α treatment group showed faster re-epithelialization than control groups. We could successfully confirm that the graft of primary cultured oral mucosal keratinocytes promotes the regeneration of skin defects. The mechanism of wound healing by primary cultured oral mucosal keratinocytes is considered to be induced by the acceleration of cytokine expression required for re-epithelialization. 서론: 배양 세포를 이용하여 조직의 기능적 재생을 얻으려면, 적절한 세포의 선택과 충분한 배양 기간을 거쳐 재건된 조직을 결손부위로 이동시킬 운반체가 필요한데, 자가 구강점막 각화상피세포를 배양하여 부유 형태로 이식하는 방법은 배양에 필요한 시간을 줄이고, 특별한 운반체 없이 간편하게 임상에 적용할 수 있는 장점이 있다.본 연구의 목적은 일차 배양하여 부유시킨 구강점막 각화상피세포의 창상 치유의 기전에 대한 in vivo 연구를 통해, 배양하여 이식된 세포가 창상 결손부에서 생착하여 치유가 이루어지는 것인지, 아니면 이식된 세포에 의해 정상 상피세포가 수혜부의 가장자리로부터 이주하도록 유도(induction)되는 것인지를 규명하고, 또한 배양세포의 이식을 통한 창상 치유 과정에서 싸이토카인과의 연관성을 알아보고자 하였다.연구 방법: 실험 동물로는 8주된 20±2g의 암컷 누드마우스를 사용하였다. 구강점막 각화상피세포 이식의 실험에는 이식을 시행하지 않은 대조군과 구강점막 각화상피세포를 이식한 이식군에 각각 15마리가 사용되었고, recombinant human IL-1α(rh IL-1α) 처리 실험에는 5일 대조군과 5일 rh IL-1α 실험군에 각각 3마리가 사용되었다. 구강점막 각화상피세포는 건강한 성인의 제 3 대구치 발치 시 염증이 없는 부위의 치은을 채취하여 일차 배양하였다. 세포 생존능 분석과 세포 주기 분석을 통해 BrdU의 표지 간격을 정하고 이식 전에 배지에 첨가하여 구강점막 각화상피세포에 BrdU를 표지하였다. 누드마우스의 등에 1.5㎝×1.5㎝ 크기의 피부 전층 결손부를 형성한 후 수축 방지를 위해 봉합하여 고정하였다. 배양 세포는 1×106cells/40㎕가 되게 부유하여 이식하였다. 각각의 군은 술 후 3일, 1주, 2주째에 희생시켜 결손부위에 대한 조직 생검을 실시하였다. 광학 현미경 하에서 조직학적 변화를 관찰하고 영상분석기를 이용하여 재생된 상피층의 길이를 조사하였다. 이식군에 대해서는 anti-BrdU와 anti-cytokeratin(CK) AE1/3를 이용하여 이중 면역조직화학적 평가를 시행하였다. 3일, 1주, 2주의 이식군과 대조군의 생검된 조직으로 keratinocyte growth factor(KGF), interleukin-6(IL-6), interleukin 1α(IL-1α)에 대해서 western blot 분석을 시행하였고, 싸이토카인의 효과를 검증하기 위해서 구강점막 각화상피세포 대신 rh IL-1α를 처리하여 조직학적 관찰 및 재생된 상피층의 길이를 측정하고 대조군과 비교하였다.결과: 1. 조직학적 소견 및 영상분석기를 이용한 재생된 상피층의 길이를 측정한 결과, 대조군보다 이식군에서 통계적으로 유의한 빠른 재상피화를 보였다 (p<0.05). 이식군은 2주째에 창상부위의 완전한 재생을 보였으며 재생된 조직은 정상 피부 조직과 유사한 소견을 보였다.2. 이식군에 대한 이중 면역조직화학 검사 결과, anti-BrdU에 양성인 세포는 3일 이식군에서 창상변연부의 이행부위에는 존재하지 않고 창상변연부와 동떨어진 중심부에서 관찰되었고, 1주 및 2주 이식군에서는 관찰되지 않았다.3. Western blot 분석 결과, 이식군은 대조군에 비해 KGF, IL-6, IL-1α의 발현이 증가되었고, 시기적으로 각각 다른 단계에서 발현을 보였다.4. rh IL-1α 실험군은 대조군에 비해 빠른 재상피화를 보였다.결론: 이러한 결과로 배양된 구강점막 각화상피세포의 이식에 의한 피부 재상피화의 증진은 이식된 세포의 생착에 의한 것이 아니라, 이식된 세포에 의해 정상 상피세포가 수혜부의 가장자리로부터 이주하도록 유도(induction)되는 것이며, 이러한 창상 치유의 촉진에는 배양된 각화상피세포와 수혜부 결합조직에서 분비되는 것으로 추정되는 싸이토카인이 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

STI571 (Gleevec^(�))이 수정체 상피세포의 증식에 미치는 영향

변귀두 인하대학교 대학원 2003 국내박사

人胎兒 綱膜 發育에 關한 電子顯微鏡的 硏究:色素上皮細胞와 光受用細胞를 中心으로

박제천 전남대학교 대학원 1991 국내박사

網膜은 色素上皮層과 神經上皮層으로 구분되고 발생 초기에 色素上皮細胞와 神經上皮細胞는 原始眼胞腔을 사이를 두고 분리되어 있으나 발육과정에서 상접하게되면서 세포분열, 이동 및 분화등 매우 복잡한 과정을 밟은 것으로 알려져있다. 최근 각종 동물을 대상으로 色素顆粒의 형성, 光受容細胞에서 纖毛의 기원, 色素上皮細胞와 神經上皮細胞와의 連接에 관한 硏究等이 시행되어 왔다. 人胎兒 網膜은 胎生期에 발육이 완성되나 하등동물에서는 출생후에도 계속 발육됨이 보고되었다. 따라서 태생초기부터 말기까지의 人胎兒 網膜에서 色素上皮層과 光受容細胞의 분화 발육과정을 電子顯徵鏡으로 관찰하여 그 결과를 얻었다. 20mm(胎齡 7週)때 網膜의 色業上皮細胞는 僞重層園柱上皮로써 色素顆粒과 멜라닌前驅小體, 유리리보솜, 粗面內形質網과 잘 발달된 골지複合體를 함유하고 있었다. 神經上皮層에는 여러 층의 神經母細胞들이 배열되어 었었고 다량의 유리리보솜과 소수의 絲粒體, 粗面內形質網 및 골지複合體를 함유하고 있었다. 原始眼胞腔은 이 시기에 출현하여 50mm(胎齡 11週)때 소실되었다. 30mm(胎齡 9週)때 色素上皮細胞는 인접 上皮細胞와 閉鎖小帶 및 附着小帶를 형성하였고 神經母細胞들 사이에도 附着小帶가 있어 外境界膜이 출현하였다. 神經母細胞는 50-150mm의 발생과정에서 활발한 분열상을 보였다. 50mm(胎齡 11週)때 色素上皮細胞는 단층으로 배열되고 세포외측은 세포막의 복잡한 안주름을 형성하였으며 附着班에 의하여 결합되고 있었다. 顆粒은 여러 단계의 色素顆粒을 형성하고 있었으며 色素上皮細胞의 내부에서 긴 돌기를 神經上皮細胞측으로 내고 있었다. 神經上皮細胞는 光受容細胞로 분화.발육하였고 內節, 核部및 底部로 구별되어 관찰되었다. 100mm(胎齡 15週)때 光受容細胞의 內節은 장경이 증대되고 다수의 絲粒體를 함유하고 있었다. 150mm(胎齡 18週)때 杆狀體細胞와 錐狀體細胞들이 관찰되었고 이들 세포의 內節은 外境界膜을 넘어서 色素上皮細胞와 附着小帶 및 閉鎖小帶를 이루고 있었다. Mu¨ller細胞는 이들 光受容細胞들 사이로 그 돌기를 내고 있었다. 150mm-260mm(胎齡 18-30週)까지 光受容細胞는 二極細胞와 여러가지형의 連接을 이루고 있었다. 光受容細胞의 外節은 260mm(胎齡 30週)때에 처음으로 관찰되었다. 內節의 타원체는 밝게 보이는 다수의 絲粒體를 함유하고 있었고 검게 보이는 소수의 絲粒體를 가지고 있었다. Morphological development of the outer retina was studied by electron microscope in human fetuses ranging from 20 mm to 260 mm crown-rump length (40days to 30 weeks of gestational age). At 20 - 30 mm fetuses, the pigment epithelium was composed of a pseudostratified columnar epithelium. The pigment epithelial cells crontained premelanosomes, dense melanin ganules, mitochondria, free rebosome, rough endoplasmic reticulum, and Golgi complex. Intercellular juncitons consisting of a zonula occludens and zonula adherans between pigment epithelium, and between neuroblasts, and between pigment epithelium and neuroblasts were observed. The outer neuroblasts were formed by multilayers of elongated cells containing oval nuclei and, in the cytoplasm, free ribosomes, mitochondria, and Golgi complex. Cell division was occured in proliferative layer of the central retina until 150 mm. In 50 mm fetus, the pigment epithelium was changed from a pseudostratified cotumnar epithelium to a single layer of cuboidal cells. Lateral surfaces of the pigment cells showed intendigitations. The developing photoreceptor cells with inner segments were observed at 100 mm fetus. Inner segments possessed ellipsoid with dark and light minochondria. Cilia projected outwards from photoreceptor cells and invaginated the immetianely adjacent pigment epithelium. At 150 mm fetus, differentiating rods, cones and Muller cells processes were observed. The developing ribbon synases and synaptic contacts between the base of cone and thee bipolar cell dendrites were noted at 150 mm fetus. By 260 mm fetus precursors of outer segment were first identified.