사염화탄소로 유발된 흰쥐의 급성간손상에 대한 비타민 E의 효과

홍순호 建國大學校 農畜大學院 2000 국내석사

간세포는 다양한 원인에 의해 손상을 받으면 세포 상호작용에 의해 각종 사이토카인 및 산소 유리기 등이 생성되면서 세포외기질이 손상을 받게 되고, 이로 인해 세포외기질이 이상증식이 유발되면 간섬유증으로 진행하게 된다. 단기적인 사염화탄소 투여시 급성 간손상을 일으켜 일시적인 간조직의 섬유화를 유발시킬 수 있고, 산화성 스트레스가 간섬유화의 중요한 요인으로 생각되고 있지만, 그 기전에 대해서는 확실하게 밝혀진 것이 없다. 간성상세포와 변환성장인자(TGF-β_(1))가 간섬유화를 유발시키는 중요한 요인으로 생각되므로 본 연구에서는 사염화탄소에 의한 급성 간손상시 간성상세포 골격표지자인 desmin과 세포증식에 관여하는 PCNA 항체를 이용하여 간성상세포의 활성도와 증식능을 관찰하였다. 또한 변환성장인자의 발현을 시간대에 따라 관찰하고, 비타민 E의 투여에 따른 변화를 비교 검토하여 항상화제인 비타민 E의 효과에 대해 알아보고자 면역조직화학적 방법을 시행하였다. 본 연구에서 도출된 결과는 다음과 같다. 1. 사염화탄소 투여에 따른 간성상세포의 활성도와 증식능의 변화는 사염화탄소를 투여한 Ⅰ군에서 사염화탄소 투여전과 비교시 시간이 지남에 따라 desmin과 PCNA발현이 증가되므로 간성상세포는 교원질을 생성하여 간섬유화를 일으킬 수 있는 세포라는 것을 확인할 수 있었다. 2. 사염화탄소를 투여한 Ⅰ군에서 사염화탄소 투여전과 비교시 시간이 경과함에 따라 변환성장인자의 발현이 증가되었다. 변환성장인자는 간섬유화를 유도하는 사이토카인 중의 하나로 이것의 증가는 간성상세포를 자극하여 섬유화를 유발시키는 중요한 역할을 하는 인자라는 것을 알 수 있었다. 3. 비타민 E 투여에 따른 간성상세포의 활성도와 증식능의 변화는 비타민을 투여한 Ⅱ군과 비타민 E를 투여하지 않은 Ⅰ군에서 32시간대에 desmin과 PCNA의 발현이 증가되었으나, Ⅰ군에 비해 Ⅱ군에서 desmin 과 PCNA의 발현이 유의하게 감소되었다. 또한 비타민 E투여에 따른 변환성장인자의 변화는 두 군 모두 32시간대에 발현이 증가되었으나, Ⅰ군에 비해 Ⅱ군에서 변환성장인자의 발현이 유의하게 감소되었다. 이는 항산화제인 비타민 E가 간성상세포와 변환성장인자의 활성을 억제시키는 것을 확인하였다. 이상의 결과에서 사염화탄소에 의한 급성간송상시 간성상세포와 변환성장인자는 간섬유화로 진행하는데 중요한 역할을 하며, 산화성 스트레스에 의한 간손상시 항상화제인 비타민 E는 급성 간부전의 치료 및 만성 간손상에 의한 간섬유화의 예방에 효과적일 것으로 사료된다. After the liver is damaged from an insult, various cytokines and free oxygen radicals are released from that damage the extracellular matrix which in turn induces abnormal hyperplasia of the extracellular maxtrix leading to hepatic fibrosis. Short term administration of CCl_(4) induces acute hepatotoxicity and may cause transient hepatic fibrosis. Although oxygen stress is thought to be an important mediator of this process the exact mechanism is not yet known. Hepatic stellate cell and TGFβ_(1) are demonstrated to be important agents in the formation of hepatic fibrosis. Thus, this study aimed to determine the changes in the hepatic stellate cell after induction of acute hepatoxicity with CCl_(4). desmin, a skeletal marker of hepatic stellate cell, and PCNA antibody that is related to cellular growth were used to determine the activity and growth potentionial of hepatic stellate cell. TGF-β_(1) expression was observed in relation to time and vitamin E administration. The effect of vitamin E, an anti-oxygen agent, was determined by immunohisto chemistry. The results are as follows: 1. Desmin and PCNA expressions were increased after CCl_(4) treatment. This result demonstrated that stellate cell could induce hepatic fibrosis through the production of collagen. 2. TGF-β_(1) activity was increased with time after CCl_(4) administration. This result showed that TGF-β_(1) was an important factor in the development of hepatic fibrosis. 3. Although desmin, PCNA, and TGF-β_(1) expressions were all increased at 32 hours in both the vitamin E administered and control groups, the levels were all significantly lower in the vitamin E administered group. These data demonstrated that vitamin E inhibits stellate cell and TGF-β_(1) activity. Taken together, These results suggest that stellate cell and TGF-β_(1) are important mediators of hepatic fibrosis after acute hepatotoxicity from CCl_(4). Vitamin E may be effective for the treatment of acute hepatic damage from oxygen stress and prevention of hepatic fibrosis from chronic hepatic damage.

鍼刺戟이 Dimethylnitrosoamine(DMNA)으로 誘發된 흰쥐의 急性肝損傷에 미치는 影響

정인기 慶熙大學校 1990 국내석사

경주지역에서 식물제제에 의한 급성 간손상 환자의 임상적 고찰

천우정 동국대학교 대학원 2001 국내석사

Purpose : Since introduction of vaccination of hepatitis B, the prevalence of acute viral liver injury is decreasing. But, because of indiscreet use of herbal medicine and health food arose from widespread of oriental medicine and commercial therapy and development of alternative medicine, drug induced liver injury is on an increasing trend. Nevertheless, report for the prevalence and clinical manifestation of acute liver injury is trivial and there is no consensus of diagnostic method and causality assessment. Therefore, cause and clinical features of acute liver injury and the prevalence and pattern of acute liver injury caused by herbal medicine and health foods was analyzed. Moreover, Council for International Organization of Medical Science(CI0MS) scale and Maria and Victorino(M&V) scale, clinlcal scales for causality assessment in hepatotoxicity were compared. Methods : 78patients in whom there was definite evidence of taking medicine and there was one more increase of over 2N(upper limit of the normal range) in ALT or total bilirubin(TB) or ALP were selected excluding viral, autoimmune, unknown origin among 150patients of admission due to acute liver injury, from April 1997 to March 2001. Each case was investigated retrospectively about taken medicine, age, sex, clinical symptom, clinical course, the pattern of liver injury, recovery period after drug stop, history of alcohol, other hepatobiliary disease, pregnancy, recent hypotension, rechallenge, concomitant drug, HBsAg, anti-HBc IgM, anti-HCV Ab, HCV RT PCR, anti-HAV IgM, AST, ALT, TB, ALP. Also, herbal medicine and western medicine groups were compared and consistency with CIOMS scale and M&V scale were investigated. Results : For four years, among 150cases of admission due to acute liver injury, drug-induced liver injury were 78cases(52.0%), viral liver injury were 65cases(43.3%). In patients of drug-induced liver injury, there was no significant difference between the groups of herbal medicine and western medicine in age and sex. In taken medicine, western medicine were 39cases(50.0%), herbal medicine and health foods were too 39cases(50.0%). Among those cases, herbal medication were 23cases(58.9%), occurred the highest prevalence, pellet were 5cases(12.8%), In-jin-ssuk were 3cases(7.7%), deer extract were 3cases(7.7%), kitosan were 2cases(5%), pumpkin extract, carp, plant roots was 1case(2.5%). In herbal medicine group, jaundice was the most, 19cases and western medicine group, asymptomatic abnormalities of liver test were the most, 27cases. In the pattern of liver injury, hepatocellular liver injury were 48case(61.5%), occurred the highest prevalence, mixed type were 18cases(23.0%) and cholestatic liver injury were 12case(15.3%) and there was no significant difference between two group(p > 0.1). In CIOMS scale, "probable" were 65cases(83.3%), "possible" were 13cases(16.7%). Nevertheless, in M&V scale, "probable" were 30cases(38.4%), "unlikely" were 41cases(52.6%) and "excluded" was also 7cases(9.0%). Between two clinical scale, best correlation were only 2cases(2.6%), as a result, kappa statistics could not be computed. Therefore, their agreement was very low. Conclusion : We ascertained that the prevalence of drug induced liver injury is on an increasing trend in Gyeongju area and acute liver injury caused by herbal medicine and health foods had very high incidence, therefore, we should attend to indiscreet use of herbal medicine and health foods and should give a warning to our society. Moreover, we thought that nationwide large scaled prevalence study was needed. In causality assessment, CIOMS scale was not consistent with M&V scales and better diagnostic method than M&V scale, more over in western medicine group. But, our country that had high prevalence of liver injury caused by herbal medicine and health food need a new clinical scale for causality assessment in hepatotoxicity.

原絡 및 迎隨補瀉를 이용한 刺鍼이 DMNA로 誘發된 急性肝損傷白鼠에 미치는 效果

손관영 慶熙大學校 1991 국내석사

Protective effect of polydeoxyribonucleotide against CCl4-induced acute liver injury in mice

이승환 경희대학교 대학원 2017 국내박사

Polydeoxyribonucleotide (PDRN; Placentex®)는 연어의 정자에서 추출 된 조직재생 활성화 물질로서 피부재생 신호전달체인 이데노신 A2A 수용체를 자극하여 혈관내피세포증식인자의 분비를 유도하고 염증성 사이토카인 (inflammatory cytokine)의 생성을 억제시켜 상처의 회복을 돕는다. 간은 생화학적 활성과 관련하여 체내에 가장 중요한 기관으로, 내인성 및 외인성 물질의 대사 및 해독, 독소의 여과, 담즙생산 및 분비, 단백질합성, 영양분의 항상성 유지 등 다양한 기능을 수행하는 장기이다. 그러나 간은 해독효소들을 이용하여 외부에서 유입된 다양한 물질을 대사하는 과정에서 독성물질이나 대사적 활성화를 통해 독성을 발현하는 물질에 표적이 되기 때문에 기능장애에 원인이 된다. 급성 간 손상은 다양한 원인으로 인해 갑자기 짧은 시간 내 간세포의 손상을 발생시키는 것으로써 높은 사망률을 나타내는 임상적 질환 중 하나이다. 본 연구에서는 사염화탄소 (carbon tetrachloride; CCl4)로 유발시킨 급성 간 손상 생쥐에서 PDRN의 염증성 사이토카인의 발현과 간 활성효소 변화에 따른 치료적 효과에 대해 실험하였다. 실험동물은 6주령 된 수컷 ICR 생쥐 40마리를 사용하였으며, 집단은 대조군, 급성 간 손상 유발 군, 급성 간 손상 유발 후 2Polydeoxyribonucleotide (PDRN; Placentex®)는 연어의 정자에서 추출 된 조직재생 활성화 물질로서 피부재생 신호전달체인 이데노신 A2A 수용체를 자극하여 혈관내피세포증식인자의 분비를 유도하고 염증성 사이토카인 (inflammatory cytokine)의 생성을 억제시켜 상처의 회복을 돕는다. 간은 생화학적 활성과 관련하여 체내에 가장 중요한 기관으로, 내인성 및 외인성 물질의 대사 및 해독, 독소의 여과, 담즙생산 및 분비, 단백질합성, 영양분의 항상성 유지 등 다양한 기능을 수행하는 장기이다. 그러나 간은 해독효소들을 이용하여 외부에서 유입된 다양한 물질을 대사하는 과정에서 독성물질이나 대사적 활성화를 통해 독성을 발현하는 물질에 표적이 되기 때문에 기능장애에 원인이 된다. 급성 간 손상은 다양한 원인으로 인해 갑자기 짧은 시간 내 간세포의 손상을 발생시키는 것으로써 높은 사망률을 나타내는 임상적 질환 중 하나이다. 본 연구에서는 사염화탄소 (carbon tetrachloride; CCl4)로 유발시킨 급성 간 손상 생쥐에서 PDRN의 염증성 사이토카인의 발현과 간 활성효소 변화에 따른 치료적 효과에 대해 실험하였다. 실험동물은 6주령 된 수컷 ICR 생쥐 40마리를 사용하였으며, 집단은 대조군, 급성 간 손상 유발 군, 급성 간 손상 유발 후 2mg/kg PDRN 투여군, 급성 간 손상 유발 후 4 mg/kg PDRN 투여군, 급성 간 손상 유발 후 8 mg/kg PDRN 투여군 등 총 5군으로 분류하였다. 급성 간 손상의 유발은 10 mg/kg 농도의 사염화탄소를 200 μl씩 복강에 2일에 1번씩 총 4회 투여하여 유발시켰으며, PDRN 약물투여는 첫 번째 사염화탄소 투여 후 다음날부터 총 7일간 각각의 농도로 200 μl씩 복강투여 하였다. 7일간의 약물투여 종료 후 심장천자방법을 이용하여 혈액을 채취하여 원심분리 후 혈청의 AST와 ALT 농도를 확인하였다. 이후 간 조직에서는 조직학적 평가를 위해 Hematoxylin & eosin 염색을 실시하였고, 웨스턴 블롯 방법을 통해 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-1beta (IL-1β), interferon gamma (IFN-γ)와 같은 염증성 사이토카인과 아데노신 A2A 수용체의 발현을 확인하였다. 연구결과, 사염화탄소의 투여는 간 활성효소인 AST와 ALT를 증가시키는 것으로 나타났으며, 조직학적 평가결과, 간세포의 체적 증가 및 간 세포질 내 염증세포의 침윤이 나타나 사염화탄소의 투여에 의하여 간 조직의 퇴행성 변화가 나타났다. 또한 사염화탄소 투여에 따른 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현이 의미 있게 증가하였다. 그러나 PDRN의 투여는 아데노신 A2A 수용체의 과발현 (overexpression)을 유도하였고, 이러한 변화에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현이 억제되는 것으로 나타났다. 또한 급성 간 손상 유발에 따른 AST와 ALT의 증가를 억제시켰으며, 조직학적 관찰 결과 간 조직의 퇴화가 억제되었다. 본 연구를 통하여 PDRN의 투여는 급성 간 손상으로 유도된 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고 AST와 ALT의 증가를 억제하여, 손상된 간 조직의 회복을 촉진하는 것으로 나타났다. 향후 급성 간 손상 시 PDRN의 효과와 세포사멸과의 관련에 대한 연구와 허혈성 간 손상에 대한 PDRN의 효과에 대한 연구가 필요하다.

사염화탄소로 급성 간손상이 유발된 흰쥐에서 혈청 및 간조직의 Transforming Growth Factor-β_(1)의 변화와 비타민 E의 효과

이정일 연세대학교 대학원 2000 국내석사

사염화탄소(CCl_(4))의 단기 투여로 급성 간손상 및 일시적인 type I collagen의 증가를 유발시킬 수 있고 이것은 간섬유화의 초기 단계를 연구하는데 이용되고 있으나 그 기전에 대해서는 아직 확실하게 알려져 있지 않다. CCl_(4)의 산화제(pro-oxidant)로서의 기능이 중요할 것으로 생각되고, CCl_(4) 투여후 발현이 증가되는 간섬유화 인자인 transforming growth factor-β_(1) (TGF-β_(1))도 핵심적인 역할을 할 것으로 생각되나, 급성 산화성 스트레스와 TGF-β_(1)과의 관계는 아직 확실하게 정립되어 있지 않다. 또한 CCl_(4)를 이용한 급성 간손상 모델에서 어느 시기에 간손상이 유발되고 TGF-β_(1)이 발현되는 지 시간에 따른 변화도 아직 확실하게 알려져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 CCl_(4)의 일회 투여로 급성 간손상을 유발하여 간손상 정도를 나타내는 혈청 alanine aminotransferase (ALT) 농도 및 혈청과 간조직에서의 TGF-β_(1)의 시간에 따른 변화를 관찰하고, 항산화제인 비타민 E를 투여하여 이에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 몸무게 100 g 정도의 Sprague-Dawley 수컷 흰쥐 60마리를 30마리씩 두군으로 나누어 1군은 CCl_(4)만을 복강내에 투여하였고, 2군은 CCl_(4)를 복강내에 투여하고, CCl_(4) 투여 2일전부터 희생시킬 때까지 매일 비타민 E를 복강내에 투여하였다. CCl_(4) 투여전과 투여후 8, 16, 32, 48 및 60시간에 두 군에서 각각 5마리씩의 횐쥐를 희생하여 혈청 ALT 농도, 혈청 TGF-β_(1) 농도 및 간조직에서의 TGF-β_(1)의 발현을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 혈청 ALT (IU/L)치는 1군에서 CCl_(4) 투여전과 투여후 8, 16, 32, 48, 및 60시간에 각각 74±20.7, 170±54.3, 258±83.5, 1178±381.3, 274±174.0, 92±74.0 이었고, 2군에서는 각각 64±21.9, 152±58.9, 156±62.3, 576±141.5, 70±35.4, 62±55.4 이었다. 두 군 모두에서 CCl_(4) 투여후 32시간에 혈청 ALT치가 가장 의미있게 증가되었고(p<0.05), 이 시기에 1군에 비해 2군에서 혈청 ALT치가 유의하게 낮았다(p<0.05). 2. 혈청 TGF-β_(1) (Pg/ml)치는 1군에서 CCl_(4) 투여전 및 투여후 8, 16, 32, 48, 60시간에 각각 1664.37±135.55, 1654.21±144.20, 1924.18±52.23, 1763.05±82.33, 1677.52±111.77, 1711.50±189.53 이었고, 2군에서는 각각 1548.84±205.82, 1731.64±164.34, 1511.74±248.77, 1078.64±176.68, 1102.10±368.02, 1532.63±298.95 이었다. 1군에서는 CCl_(4) 투여후 16시간에 가장 높은 혈청 TGF-β_(1)치를 나타냈고 이후에는 감소하는 추세였으며, 2군에서는 CCl_(4) 투여후 8시간에 가장 높았으나 두 군 모두 CCl_(4) 투여전에 비해 통계학적으로 유의하지 않았다. 3. 면역조직화학적 검사상 TGF-β_(1)에 양성을 보인 세포(TGF-β_(1) Positive Cells/400 hpf (high power field))는 1군에서 CCl_(4) 투여전 및 투여후 8, 16, 32, 48, 60시간에 각각 0.00±0.00, 1.97±0.99, 2.51±0.74, 11.71±0.64, 5.27±0.43, 2.43±0.17 이었고, 2군에서는 각각 0.00±0.00, 1.43±0.42, 1.76±0.59, 2.26±0.44, 0.88±0.54, 0.88±0.37 이었다. 1군에서는 CCl_(4) 투여전에 비하여 투여후 32, 48시간에 TGF-β_(1) 양성인 세포가 유의하게 증가하였으며, 2군에서는 CCl_(4) 투여전에 비하여 투여후 32시간에 TGF-β_(1) 양성인 세포가 유의하게 증가하였다(p<0.05). 두 군 모두에서 CCl_(4) 투여후 32시간에 TGF-β_(1)의 발현이 가장 높게 나타났으며(p<0.05), 이 시기에 1군에 비해 2군에서 TGF-β_(1) 양성인 세포가 유의하게 적었다(p<0.05). 이상의 결과에서 CCl_(4)에 의한 급성 간손상에서 간손상 정도를 나타내는 혈청 ALT치는 CCl_(4) 투여후 서서히 증가되었다가 CCl_(4) 투여후 32시간에 가장 높게 나타났고 이 후에는 감소되었으며, 간섬유화 인자인 TGF-β_(1)의 간조직에서의 발현도 이와 비슷한 양성으로 증감되었다. 또한 비타민 E 투여에 의해 혈청 ALT치와 간조직에서의 TGF-β_(1) 발현이 모두 유의하게 억제되었다. 이는 CCl_(4)에 의한 급성 간손상에서 산화성 스트레스와 TGF-β_(1)의 발현사이에 양의 상관관계가 있음을 간접적으로 시사하고 또한 비타민 E 투여에 따른 간손상의 감소와 간조직에서의 TGF-β_(1) 발현의 억제가 비타민 E에 의한 간섬유화 억제에 가능한 작용기전일 수 있음을 추정하게 한다. Short-term administration of carbon tetrachloride (CCl_(4)) leads to liver necrosis and transient increase of type I collagen expression. The precise pathogenesis of this CCl_(4) induced liver damage is yet to be investigated although pro-oxidant effect of CCl_(4) is thought to play an important role. Furthermore, precise temporal patterns of serum alanine aminotransferase (ALT), the enzymatic indicator of liver necrosis, and transforming growth factor-β_(1) (TGF- β_(1)) expression have not been investigated in acute liver injury. Evaluation of relationship between oxidative stress induced by acute CCl_(4) administration and TGF- β_(1), and investigation of temporal patterns of serum ALT and TGF- β_(1) expression may attribute to clarify the pathogenesis of CCl_(4) induced liver injury and thus the mechanism of liver fibrosis. Therefore, to investigate TGF-β_(1) expression in rats with acute CCl_(4) injury and effect of vitamin E (vit. E) on TGF- β_(1) expression, 60 male Sprague-Dawley rats had a single intraperitoneal injection of CCl_(4), of which 30 rats had daily intraperitoneal injection of vit. E, starting from 2 days before CCl_(4) injection until the time of their sacrifice. The group of rats with CCl_(4) injection only was designated as group 1, and the group of rats with vit. E supplementation was designated as group 2. Five rats from each group were sacrificed before and 8, 16, 32, 48, 60 hr after CCl_(4) injection, respectively, and their serum alanine aminotransferase (ALT) concentration, serum TGF-β_(1) concentration, and hepatic expression of TGF-β_(1) were examined. The results were as follows. 1. Serum ALT level was highest at 32 hr after CCl_(4) injection in both groups. However, at this time, serum ALT level of group 2 was significantly lower than that of group 1. 2. Serum TGF-β_(1) level did not show any statistically significant changes after CCl_(4) injection in both groups. 3. TGF-β_(1) expression in the liver was highest at 32 hr after CCl_(4) injection in both groups. At this time, tissue expression of TGF-β_(1) of group 2 was significantly suppressed compared to that of group 1. These results support that in the rats with CCl_(4) induced acute liver injury, oxidative stress causes acute liver injury in parallel with increased TGF- β_(1) expression in the liver. Therefore, oxidative stress seems to play a role in the pathogenesis of hepatic fibrosis by increasing TGF-β-1 expression in the liver. And vitamin E maybe effective in preventing acute liver injury and hepatic fibrosis.

사염화탄소에 의해 유발된 마우스의 급성 간 손상에 대한 헤마토코커스 추출물의 효과

김태균 을지의과대학교 대학원 2006 국내박사

간 질환의 주요한 손상 기전으로 산소 유리기가 중요한 역할을 하고 있을 것으로 생각되며 이에 대한 치료법으로 항 산화제의 사용이 관심을 불러일으키고 있다. Haematococcus는 해조류의 일종으로 아스타산친이라는 강력한 항산화제를 산화 반응에 대한 방어 기제로 생성한다. 본 실험에서는 이 아스타산친의 간 질환에 대한 보호 기능을 알아보기 위해서 Haematococcus 추출물과 또 다른 항산화제인 비타민 E, 실리마린을 비교하고 이들을 치료하지 않는 대조군과 비교하였다. 마우스에서 사염화탄소로 급성 간 손상을 유발하고 위의 약제들을 주입하였으며 간, 폐와 혈액을 채취하여 간 기능과 간과 폐의 MDA 수치 그리고 간의 조직 병리 소견을 관찰하였다. 간 기능에서 실험 군은 대조 군에 비해 간 기능 개선 양상을 보이지 못했으나 ALT의 경우 아스타산친 군에서 증가가 완만한 양상을 보였다. 간 손상 이후 간, 폐 내의 MDA는 모두 증가하였다. 간 내 MDA 수치는 항 산화제를 사용한 모든 그룹에서 대조 군에 비하여 철저히 감소하지는 않았으나 폐 내 MDA 수치는 뚜렷하게 감소하였다. 폐 내 MDA 수치에서 실험 군 간의 차이는 발견할 수 없었다. 병리 조직 검사상 모두에서 괴사가 관찰되었으나 실험 군 특히 아스타산친 군에서 괴사의 양이 다소 감소하는 양상을 보였다. 이상의 결과에서 사염화탄소에 대한 간 손상에서 아스타산친을 포함 어떤 항 산화제도 대조 군보다 손상이 회복된 양상을 뚜렷하게 보이지 못했으나 전신적으로 폐 등의 손상에 대한 보호 기능이 보이고 아스타산친 군의 경우 조직 병리학적 소견상 손상의 정도가 약한 것으로 관찰되는바 아스타산친 같은 항 산화제가 급성 간 손상에 대한 보호 기능이 있을 가능성이 높다는 점을 시사한다고 보겠다. (Introduction) Liver fibrosis is one of the biggest problems in human disease. Since now proper treatment for this disease is insufficient and ineffective. Liver fibrosis is induced from recurrent liver damage including viral infections, drugs and alcohol and on the way of injury oxidative stress induced by oxygen free radical seems to be the main pathway to fibrosis. So antioxidant treatment for liver injury can be the protection from process of liver fibrosis and many trial have been done. However, good candidates for drug for liver fibrosis is not yet discovered. (Materials & Methods) We have experimented the effect of Astaxanthin which is the derivatives of Carotenoid and potent antioxidant itself to the acute liver damage induced by tetrachloride on the mice. We have compared it with the non-treatment control group and other antioxidant groups (silymarin group, Vitamin E group). (Results) There are no statistically significant differences in liver function test among groups. In AST and ALT, relatively low levels are showed in pure astaxanthin group, but no significance. In MDA levels, liver shows no differences among groups even in control group. However, in lung MDA, all the antioxidant groups show lower levels than those of control group. In pathologic findings, astaxanthin groups show relatively less invasion of necrosis. (Conclusions) Protective effect for the acute liver injury of Haematococcus extracts is not confirmed. Also other antioxidant groups could not show the hepatoprotective effect. However Astaxanthin groups show the possibility to have hepatoprotective effect concerning to results of ALT levels and pathologic findings.

사염화탄소에 의한 흰쥐의 급성 간손상에서 간성상세포 사멸의 경과와 특성

김경철 연세대학교 대학원 2000 국내박사

간섬유화(hepatic fibrosis)는 세포외기질의 증가로 특징지워지며, 세포외기질은 활성화된 간성상세포(hepatic stellate cell) 에서 주로 생성된다. 따라서 활성화된 간성상세포는 간섬유화 유발에서 핵심적인 역할을 한다. 간섬유화는 간손상에 대한 조직의 복구과정이며 간경변증과는 달리 가역적인 단계로 실질조직 복구가 완결되면 진행을 멈추거나 소실된다고 알려져 있다. 그러나 이러한 가역적 간섬유화에서 활성화 및 증식되었던 간성상세포가 세포외기질을 생성하는 역할을 마친 후 어떤 운명에 처하는지 또는 어떤 기전으로 제거되는지는 정확히 밟혀지지 않았다. 세포 또는 조직의 항상성을 유지하는 기전 중 세포증식에 대한 보완적 기전으로 세포사멸(apoptosis)이 알려지고 있다. 따라서 급성 간손상 후에도 간섬유화가 멈추거나 소실되는 과정에는 간성상세포 증식과 사멸간 균형의 변화가 관여할 수 있다는 가정을 세울 수 있다. 이에 본 연구에서는 사염화탄소 투여로 유발된 급성 간손상/간섬유화의 생체 모델에서 간성상세포의 증식과 사멸의 관계에 대하여 분석하고자 하였다. 흰쥐에 사염화탄소를 1회 투여하여 급성 간손상 및 가역적인 간섬유화를 유발하고, 그 과정에서 간성상 세포의 증식 및 사멸의 정도와 사멸에 관련된 인자들의 발현을 관찰하였다. 사염화탄소 투여후 일정한 시간(16시간, 32시간, 48시간, 64시간, 80시간, 4일, 7일)에 흰쥐를 희생시킨 후 간조직에서 desmin 염색과 TUNEL검사를 시행하여 간성상세포 수의 변화와 사멸을 측정하였다. 한편 일부 간조직으로부터 간성상세포를 분리한 후 [^(3)H] thymidine uptake 검사로 간성상세포의 증식을 측정하였고, annexin-V-FITC 결합을 유세포분석하여 간성상세포 사멸을 측정하였으며, Western blot으로 간성상세포에서 사멸관련인자(Fas, p53, p21, bcl-2 및 bax)의 발현을 측정하였다. 그 측정치를 사염화탄소를 투여하지 않은 대조군과 비교한 결과는 다음과 같다. 1. 간성상세포의 증식도를 반영하는 [^(3)H]thymidine uptake의 정도는 사염화탄소 투여후 증가하여 32시간에서 가장 높았으며 (p<0.01), 이후 시간에 따라 점차 감소하였다. 2. 유세포분석으로 관찰한 annexin-V-FITC 결합은 사염화탄소 투여 후 16시간부터 유의하게 증가하여 64시간에서 가장 높았으며 (p<0.01), 이후 시간에 따라 점차 감소하였다. 3. 조직에서 desmin 양성인 간성상세포 수(400배 10부위의 합)는 사염화탄소 투여후 증가하여 48시간에서 가장 높았으며 (p<0.01), 이후 시간에 따라 점차 감소하였다. Desmin 양성이면서 TUNEL양성인 간성상세포 수는 사염화탄소 투여 후 32시간부터 유의하게 증가하여 64시간에서 가장 높았으며 (p <0.01), 이후 시간에 따라 점차 감소하였다. 4. 조직에서 TUNEL 양성 간성상세포 수와 분리한 간성상세포의 annexin-V-FITC 양성인 세포의 백분율간 유의한 상관관계가 있었다 (r=0.606, p<0.01). 5. 분리한 간성상세포의 Westernblot 결과 Fas는 사염화탄소 투여 후 48시간부터 발현되기 시작하여 4일까지 발현되었고, p53는 32시간에서 발현되었으며, p^21은 32시간부터 4일까지 지속적으로 발현되었다. Bcl-2는 16시간부터 발현되기 시작하여 80시간까지 발현되었으며 bax는 64시간부터 4일까지 발현되었다. 이상의 결과를 종합하면 사염화탄소에 의한 급성 간손상/간섬유화 과정에서 간손상초기에 간성상세포의 증식이 활발히 일어나면서 간성상세포의 수가 증가되고, 이후 간성상세포 사멸이 일어나면서 간성상세포의 수가 감소함을 알 수 있었으며, 사멸 관련인자들이 간손상 이후 시간에 따라 다양하게 간성상세포에서 발현되어 사멸에 관여함을 알 수 있었다. 따라서 간성상세포 사멸은 생체 내에서 활성화된 간성상세포의 수를 조절하는 역할을 하며, 급성 간손상 후의 가역적 간섬유화는 활성화된 간성상세포의 세포사멸 기전에 의해 조절되기 때문이라고 생각한다. Hepatic fibrosis is characterized by an increase in extracellular matrix. Activated hepatic stellate cells (HSC) are central to the process of fibrosis as the major source of matrix. Hepatic fibrosis, a common response to liver injury from many causes, is a reversible process, when the insult is acute self-limiting. But the fate of the expanded population of the activated HSC and the mode of their elimination during the resolution of liver injury are uncertain, up to now. We hypothesized that apoptosis, which plays an opposite and complementary role to cellular proliferation in the maintenance of tissue homeostasis, could be one potential fate of the activated HSC during the resolution of liver injury. Therefore we studied serial changes (before and up to 7 day after CCl_(4) injection) of HSC apoptosis over proliferation in an in vivo model of carbon tetrachloride (CCl_(4)) induced acute liver injury. We studied apoptosis of HSC in liver tissue by desmin/TUNEL dual immuno-stain. Isolated HSCs were studied for apoptosis by flow-cytometric analysis of annexinV-FITC binding, for proliferation by [^(3)H]thymidine uptake, and for apoptotic mediators (Fas, p53, p21, bcl-2, bax) by Western blot. The results were as follows. 1. The [^(3)H]thymidine uptake (proliferation) of isolated HSC increased after CCl_(4) injection, showing maximal increase at 32hr (p<0.01) and decreased gradually thereafter. 2. The annexin-V-FITC binding (apoptosis) of isolated HSC increased after CCl_(4) injection, showing maximal increase at 64hr (p<0.01) and decreased gradually thereafter. 3. The number of desmin positive cells (sum of 10 HPF, × 400) in liver tissue increased after CCl_(40 injection, showing maximal increase at 48hr (p<0.01) and decreased gradually thereafter. The number of desmin and TUNEL positive cells increased after CCl_(4) injection, showing maximal increase at 64hr (p<0.01) and decreased gradually thereafter. 4. The number of TUNEL positive HSCs in liver tissue correlated significantly with annexin-V-FITC binding of isolated HSCs (r=0.606, p<0.01). 5. From Western blot of isolated HSCs, Fas expression was detected from 48hr to 4 day, p53 at 32hr, p21 from 32hr to 4 day, bcl-2 from 16hr to 80hr and bax from 64hr to 4 day, after CCl_(4) injection. From these results, it is identified that acute liver injury was first accompanied by proliferation of HSCs and followed by apoptosis of HSCs with the reduction in the total number of HSCs during the resolution of injury. Expression of Fas, p53, p21, bcl-2, bax was identified in vivo in activated HSCs undergoing apoptosis. It is concluded that apoptosis of HSC played a role in the regulation of the numbers of activated HSCs and may represent an important mechanism to the resolution of fibrosis in the acute liver injury model.

急性 肝損傷에 對한 丹蔘의 保護作用

박이규 우석대학교 1991 국내석사

急性 肝損傷에 대한 丹蔘엑스의 保護作用을 實驗한 結果는 다음과 같다. 1. 急性毒性은 3.000㎎/㎏ 以上이었다. 2. CCl₄, TAA 및 D-GalN으로 誘發된 急性 肝損傷 Rat에서 S-GOT 및 S-GPT 値를 有意性있게 減少시켰다. 3. CCl₄, TAA 및 D-GalN으로 誘發된 急性 肝損傷 Mouse에서 Hexobrbital의 睡眠時間을 유의성 있게 短縮시켰다. 4. CCl₄에 의한 急性 肝損傷 Rat에서 Sulfobromophthalein(BSP)의 體內 半減期를 유의성 있게 短縮시켰다. 5. CCl₄, TAA 및 D-GalN에 의한 肝에 Fatty change, Necrosis 및 Fibrosis의 組織學的 變化가 나타났으나 丹蔘엑스 투여로 이들의 病變이 현저하게 줄어들었다. 以上의 生化學的, 藥物動態學的 및 病理組織學的 實驗 結果 丹蔘엑스는 肝 保護作用이 강력하며, 앞으로 肝治療劑로의 개발 가능성이 있다고 사료된다.

급성 산화적 간손상에 미치는 월국환의 효과

이채중 동국대학교 대학원 2002 국내박사

Objectives : In traditional medicine, Wolgukwhan(WGW) has been used for the treatment of digestive system disease, such as indigestion, brash, ructation, nausea and vomiting. This study was purposed to investigate the effects of WGW on oxidative liver cell injury. Methods : The levels of lipid peroxide(LPO) were determined by TBA method in the linoleic acid autoxidation system. The scavenging effect of WGW on α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl radical(DPPH·) was determined according to the method of Hatano. In the Fenton system(ferrous ion reaction with hydrogen peroxide), the levels of hydroxyl radical induced LPO in rat liver homogenate were determined according to the method of TBA. Inhibitory effect of WGW on superoxide generation was measured by xanthine-xanthine oxidase system. Cultured normal rat liver cell(Ac2F) were prepared and incubated with or without WGW(at 2% volume in culture medium). After 18hr, cells placed in DMEM medium without serum, and then incubated with 1mM tert-butyl hydroperoxide(t-BHP) for 2hr. Viable cells were detected by MTT assay. In vivo assay, we administerated acetaminophen(500mg/kg, i.p.) to starved mice 24hrs after pretreatment of WGW for 6days. In the liver homogenates, lipid peroxide and glutathione(GSH) levels were measured. In addition, activities of hepatic enzyme, such as catalase, glutathione peroxidase(GPX), glutathione S-transferase(GST) were measured in the hepatic mitochondrial and cytosolic fractions. Results : In the linoleic acid autoxidation system, WGW extract significantly inhibited the time course of the lipid peroxidation. WGW showed about 67% scavenging effect on DPPH radical. And WGW inhibited the lipid peroxide formation in rat liver homogenate induced by hydroxyl radical derived from Fenton system. And WGW exhibited dose-dependent inhibitory effect on superoxide generation from xanthine-xanthine oxidase system. Cell killing was significantly enhanced by addition of t-BHP compared to those of untreated group. WGW pretreated cell resisted the toxic effects of t-BHP. In vivo administeration of WGW showed effective inhibition of acetaminophen induced lipid peroxidation and elevations of glutathione level. The acetaminophen treatment resulted in a decrease of catalase, GPX and GST activities. By contrast, WGW pretreatment increased compare to those of untreated groups. Conclusions : These results suggested that WGW might protect against lipid peroxidation by free radicals, destruction of hepatic cell membranes.