A Study on the Multisulfur Complexes As the Functional Electronic Materials : 기능성 전자재료로서의 다황 화합물에 관한 연구

이하진 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

황을 포함하는 π-전자 주게 화합물로서 페로세닐, 페닐 그리고 티오펜을 포함하는 tetrathiafulvalene (TTF), bis(ethylenedithio)tetrathiafulvalene (ET) 그리고 bis(vinylenedithio)tetrathiafulvalene (VT) 유도체들을 알킬포스파이트를 용매로 사용하는 자체 또는 교차 짝지음 반응에 의해 합성하였으며, 그들의 전하-전달 염에 대한 전기적 특성을 관찰하였다. 이 화합물들의 라디칼 양이온과 전하-전달 염을 합성하였고 온도에 따른 산화형태와 전도도 경향을 살펴보았다. 또한 ET와 VT의 닮음궤도함수 (isolobal) 유사체인 니켈 디티올렌 착화합물, [NiL₂]^n- (L = 리간드 n = 0 또는 1)을 합성하여 X-선 결정구조를 분석하고 전기화학적 특성을 관찰하였다. 이 화합물들의 전구 물질들을 합성하기 위하여 소중합 형태의 디엔체인 1,3-dithiole-2,4,5-trithione, [C₃S_5]_n과 페로세닐, 페닐기를 포함하는 친디엔체를 사용한Diels-Alder 형태의 [2+4] 고리화 첨가반응 및 1,8-diketone의 Lawesson반응을 사용하였다. 1,1'-Diferrocenyl-VT (BFcVT)와 tetraferrocenyl-VT (TFcVT)의 순환 전압-전류 (CV) 측정 시 모두 하나의 가역 곡선을 관찰할 수 있었다. BFcVT의 라디칼 양이온 염 (BFcVT)·(I₃)의 전자상자성 공명분광법과 뫼스바우어 분석결과를 살펴보면 모든 온도 영역에서 VT 부분은 산화되어 라디칼 형태로 존재하지만, 두 개의 페로세닐기는 산화되어 있지 않다. 반면, (BFcVT)H·(BF₄)₄은 모든 온도영역에서 저스핀 철(II), 고스핀 철(II) 그리고 고스핀 철(III)을 포함하는 페로센/페로세늄 혼성계를 이루는 것으로 관찰되었고 온도가 상승함에 따라 고스핀 철(III)의 함량이 증가하였다. (BFcVT)·(I₃)와 (BFcVT)H·(BF₄)의 가압 형태의 전기전도도는 7×10^-3 Ω^-1 ㎝^-1로 관찰되었다. 티오펜을 포함하는 TTF 유도체들의 경우, TTF와 마찬가지로 두 개의 가역적인 산화 전위를 갖는다. 이들 중 하나의 화합물은 π-전자 받게 화합물인 F₄-TCNQ와 1 : 1 전하-전달 염을 이루어 실온에서 0.21 ~ 5.54 Ω^-1 ㎝^-1의 전도도를 보인다. 페로센을 포함하는 니켈-디티올렌 착화합물 [Ni(fcvdt)₂]^1-는 두 개의 페로센이 각각 위, 아래로 향하는 의자형을 이루고 있는 반면, [Ni(dfcvdt)₂]^1-는 네 개의 페로센이 모두 위를 향하고 있는 보트형을 이루고 있다. 페닐기를 포함하는 니켈화합물 (Ph₄P)[Ni(dphdt)₂]에서 Ni(S₂C₂S₂)₂ 부분은 평면 구조를 이루면서 c-축을 따라 쌓여있다. 니켈 착화합물들의 순환 전압-전류 측정에서는 니켈(II) 디티올렌 부분에서의 [NiL₂]^(2-/1-)과 [NiL₂]^(1-/0)의 산화과정에 해당되는 두 개의 가역적인 순환 과정을 관찰 할 수 있었다. 합성된 니켈 화합물들은 1012 nm ~ 1342 nm 영역에서 강한 근적외선의 흡수가 일어났다. 이 결과는 더 낮은 에너지에서 에너지를 흡수하는 infrared dye로서의 가능성을 보여준다. 페로센을 포함하는 2차 비선형 광학 발색단을 갖는 니켈-디티올렌 착화합물 (FcCH=CHPyMe)[NiL₂] (L = dmit, dddt, debt, tmtbt)을 (n-Bu₄N)[NiL₂] 과 FcCH=CHPyMe·I의 양이온 치환반응에 의하여 합성하였다. (FcCH=CHPyMe)[Ni(dmit)₂]의 결정구조에서 [Ni(dmit)₂] 부분과 양이온의 메틸피리디늄 부분이 피리디늄 고리의 중심 바로 위에 니켈 이온과 순차적으로 쌓여있다. 이 화합물은 실온에서 절연체이지만 H-형태의 전기화학 셀에서 합성된 부분 산화물인 (FcCH=CHPyMe)_x[Ni(dmit)₂] (0 < x < 1)은 30 K ~ 300 K의 온도 영역에서 반도체의 (Ea = 106 meV) 거동을 보인다. Sulfur-based π-electron donors such as tetrathiafulvalene (TTF), bis(ethylenedithio)tetrathiafulvalene (ET) and bis(vinylenedithio)tetrathiafulvalene (VT) derivatives containing ferrocenyl, phenyl and thiophene moieties have been successfully prepared by phosphite-based coupling reaction and investigated on the electrical properties of their charge-transfer salts. Nickel dithiolene complexes [NiL₂]^n- (L = ligands, n = 1 or 0) which are isolobal analogues to ET and VT have been synthesized and examined by X-ray crystallography and electrochemical properties. The facile syntheses of precursors of TTF derivatives and ligands were carried out via a Diels-Alder type [4+2] cycloaddition reaction of oligomeric diene (oligo(1,3-dithiole-2,4,5-trithione): [C₃S_5]_n) with the ferrocenyl- or phenyl-substituted dienophiles, and via Lawesson's reaction of 1,8-diketones. Cyclic voltammograms (CV) of 1,1'-diferrocenyl-VT (BFcVT) and tetraferrocenyl-VT (TFcVT) showed one reversible redox peak. According to the temperature-controlled EPR and Mossbauer measurements of (BFcVT)×(I₃), the VT moiety was revealed to be oxidized to a radical while the two ferrocenyl groups were not. On the other hand, a mixed ferrocene/ferrocenium system consisting of low-spin Fe(II), high-spin Fe(II) and high-spin Fe(III) was detected in compound (BFcVT)H×(BF₄)₄ by Mossbauer spectroscopy, in which the content of high-spin Fe(III) increased as temperature was increased. The electrical conductivities of the radical cationic salts ((BFcVT)H×(BF₄)₄ and (BFcVT)×(I₃)) were 7 × 10^-³ Ω^-¹㎝^-¹ in a pressed pellets. CVs of TTF derivatives fused with thiophene moiety showed two-reversible redox peaks similar to TTF. One of them formed an 1 : 1 charge-transfer salt with F₄-TCNQ which exhibited a four-probe electrical conductivity of 0.21 ~ 5.54 Ω^-¹㎝^-¹ at room temperature. In the ferrocenyl-substituted nickel complexes, [Ni(fcvdt)₂]¹- anion has a chair-like conformation with the two ferrocenyl groups folding up and down while the tetraferrocenyl-substituted [Ni(dfcvdt)₂]¹- anion has a boat-like conformation with four ferrocenyl groups folding up. In the molecular structure of tetraphenyl-substituted nickel complex, (Ph₄P)[Ni(dphdt)₂], Ni(S₂C₂S₂)₂ core is planar and stacking along the c-axis. The CVs of nickel bisdithiolene complexes showed two reversible redox peaks associated with the [NiL₂]^(2-/1-) and [NiL₂]^(1-/0). The complexes exhibited a strong near-IR absorption at low-energy region (1012 nm ~ 1342 nm). Nickel bisdithiolene complexes with a ferrocene-containing second order nonlinear optical chromophore as a cation, (FcCH=CHPyMe)[NiL₂] (L = dmit, dddt, debt and tmtbt) have been synthesized by the cation exchange reaction of (n-Bu₄N)[NiL₂] and FcCH=CHPyMe×I. In the crystal structure of (FcCH=CHPyMe)[Ni(dmit)₂], Ni(dmit)₂ unit and the methylpyridinium moiety of the cation are stacking alternatively with nickel ion being just above the center of pyridinium ring. This complex was revealed to be an insulator at room temperature, but (FcCH=CHPyMe)_x[Ni(dmit)₂] (0 < x < 1) grown in an H-type electrochemical cell showed a semiconductor behavior (Ea = 106 meV) over the temperature range measured (30 K ~ 300 K).

Protection of Helicobacter heilmannii Infection by Recombinant Helicobacter pylori Urease : 요소 분해 효소 (Rrecombinant Helicobacter pylori urease)를 백신으로 이용한 돼지 위장병균 (Helicobacter heilmannii) 감염방지 실험

조현주 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

돼지 위장병균인 Helicobacter heilmannii 는 배지 상의 배양이 이루어지지 않음으로 동물에서 동물로 감염시켜 배양되어 왔다. 본 실험에서 돼지 위장병균을 배양하기 위하여 돼지 위 점막과 유사한 상태를 만들고자, 고체 배지 위에 감염 조직을 접종한 후 반 고체배지를 덮는 샌드위치 방법을 고안하였다. 감염 조직을 접종한 샌드위치 배지를 10% 이산화탄소가 충진된 37℃ 배양기에서 7일간 배양한 후, Gram 염색을 하여 광학현미경하에서 돼지 위장병균(H. heilmannii)을 관찰하였다. Koch의 가설에 기초하여, 분리 배양된 돼지 위장병균이 재감염되어 병을 야기하는지 확인하기위해 실험용 쥐에 분리 배양된 돼지 위장병균을 재감염시켰을 때, 감염 일 주일후 위 조직으루부터 돼지 위장병균을 확인하였다. 돼지 위장병균이 감염된 조직으로부터 얻은 bacterial DNA와Heicobacter pylori의 urease A gene을 증폭하는 primer를 사용하여 PCR을 수행했을 때, 411 bp의 전형적인 DNA bend를 얻었다. 또한, urease PCR 산물의 염기서열을 H. pylori의 urease A와 비교했을 때, 돼지 위장 병균이 H. pylori 와 97.98%가 동일한 요소 분해 효소(urease)를 생산하는 것을 알게되었다. 따라서 H. pylori 의 요소 분해 효소를 돼지 위장병균의 백신으로 사용하기 위해 H. pylori 의 요소 분해 효소가 복제된 E. coli BL21/pHU1013으로부터 요소 분해 효소를 순수 분리하였다. 순수 분리를 위해 사용한 column으로는 DEAE 음 이온 분리 크로마토그래피 및 Sephacryl S-200과 Mono-Q이다. 분리된 요소 분해 효소는 176.3 배의 순수 분리도와 18.82%의 수득률을 지니며, 단백질 전기영동을통해 요소 분해 효소의 분자량은 약 97.5 kDa 임을 확인하였다. 분리된 요소 분해 효소는 돼지 위장병균의 감염을 억제하는 백신으로 사용될 때, 점막의 면역반응을 촉진하는 콜레라 독과 함께 실험용 쥐의 입안에 흘려줌으로 면역을 증진 시켰다. 면역 증진은 일 주일 간격으로 5회 실시하였고, 마지막 백신을 투여한 5일 후, 혈장과 변, 침에서 요소 분해 효소에 대한 특정한 면역체계가 잡혔는지 확인하였다. 면역 측정법에 의해 요소 분해 효소에 대한 혈장 안의 IgG와 혈장, 변, 침 각각의 IgA가 증가한 것을 확인한 후, 돼지 위장병균이 감염된 실험용 쥐의 위조직을 갈아 경구 투여함으로 감염시켰다. 감염 1주일 후, 실험용 쥐의 위조직에 돼지 위장병균 감염율을 요소 액체 배지(urea broth)을 이용하여 측정하였을때, H. pylori 의 요소 분해 효소로 면역을 증강 시킨 실험용 쥐의 위 조직을 넣어 반응한 요소 액체 배지(urea broth)에서 발색이 거의 없었다. 이는 H. pylori 의 요소 분해 효소가 돼지 위장병균의 감염율에 영향을 미침을 시사하고 있다. IIn this study, Helicobactger heilmannii was successfuly cultured using a sandwitch method, inoculating between media. Also, when the mice was challenged with cultured H. heilmannii, H. heilmannii infection of murine stomach was observed 1 week after challenge under a light microscope after Gram staining. When a PCR specific to urease A in Helicobacter pylori was performed using DNA isolated from H. heilmannii infected tissue, a 411 base pair fragment was amplified. DNA sequence of this PCR product coincided with the urease A of H. pylori. This result shows that H. heilmannii produces the same urease of H. pylori. Based on this, urease of H. pylori was purified from urease cloned E. coli BL21/pHU1013. Bacterial cells were grown in LB with ampicillin and NiCl2 and collected with centrifugation. Cells were broken in a French pressurized cell. The recombinant urease were purified with DEAE anion exchange column chromatography, Sephacryl S-200, and Mono-Q column chromatography. The recombinant urease was purified 176.3 fold with an yield of 18.82%, and the specific activity was 165.75 μmol/μg. To examine the immune response and the protective efficacy of immunization with recombinant H. pylori urease, CD-1(ICR) mice were orally immunized five times with 50 μg of the purified urease and cholera toxin (10 μg) at weekly intervals. After the final immunization, level of specific IgG in serum and IgA in serum, saliva, and feces were increased. When challenged with homogenate of H. heilmannii infected gstric tissue, mice immunized with urease in the presence of cholera toxin were protected against gastric infection.

Purification and Characterization of the Bi-functional Metalloprotease from Bacillus sp. JH108 : Bacillus sp. JH108이 생산하는 bi-functional metalloprotease의 정제 및 특성 분석

정현주 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

저온 미생물인 Bacillus sp. JH 108이 생산하는 extracellular protease 중 가장 분자량이 작은 metalloprotease를 ammonium sulfate fractionation, anion exchange chromatography, gel filtration chromatography, cation exchange chromatography의 과정을 통해 정제하고 그 특성을 밝혔다. 효소의 분자량은 약 36,000 Da이고, optimum pH와 온도는 각각 pH 8-9와 60℃ 였다. 합성 기질을 이용해 (aminoacyl p-nitroanilide) enzyme이 말단의 leucine을 가수분해하는 leucine aminopetidase와 polypeptides 중간 위치의 leucine을 가수분해하는 endopeptidase의 기능을 같이 가지고 있음을 알아내었다. Leucine aminopeptidase로서의 활성은 metal chelating 시약인 EDTA, 1,10-phenanthroline에 의해서 완전히 저해되었다. EDTA에 의해 활성을 잃은 효소는 Co++ 혹은 Zn++를 첨가해 줌으로써 다시 재활성화 되었다. 따라서 Leucine aminopeptidase로서의 이 효소는 Co++에 의해서 활성화되는 metalloprotease임을 알 수 있다. Leucine endopeptidase로서의 활성은 metal chelating 시약인 EDTA, 1,10-phenanthroline, EGTA에 의해 강하게 저해되었고, serine 잔기에 작용하는 저해제인 PMSF에 의해서는 완전히 저해되었다. EDTA에 의해서 저해된 효소는 Ca++, Co++, Mn++에 의해 재활성화 되었다. 따라서 endopeptidase로서 이 효소는 catalytic 활성에 serine 잔기가 중요한 역할을 하는 Ca++-activating metalloprotease일 것으로 생각되었다. 위의 두 가지 특성으로 보아, 분리된 enzyme은 leucine aminopeptidase와 leucine endopeptidase의 역할을 하는 bi-functional metalloprotease일 것이라고 결론지을 수 있다. An extracellular protease was purified from a psychrotrophic bacteria Bacillus sp. JH108 by ammonium sulfate fractionation of culture medium, DEAE Sephadex A-50 chromatography, Sephacryl S-100 chromatography and CM Sepharose CL-6B chromatography. The enzyme had a molecular weight of 36,000±500 as estimated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and gel filtration chromatography. The optimal pH ranged from 8 to 9 and optimal temperature was 60 degrees C. The enzyme exhibited a specificity for peptide bonds with leucine. This 36,000 Da metalloprotease exhibited both leucine aminopeptidase and endopeptidase activities. Endopeptidase activity was more reactive than aminopeptidase activity, but aminopeptidase activity was distinctly expressed. A Lineweaver -Burk plot of the data indicated that K_m value of aminopeptidase is 0.46 mM and V_max is 0.125 μmol of pNA released/min, and the Km value of endopeptidase is 0.315 mM and V_max is 0.222 μmol of pNA released/min. The aminopeptidase activity was fully inactivated by EDTA and 1,10-phenanthroline. The aminopeptidase activity was stimulated by Co^++. EDTA-inactivating enzyme could be reactivated by 1 mM Co++ and Zn^++. The enzyme contained Zn^++ (1.2 ±0.2 atoms per molecule of enzyme). Therefore, this aminopeptidase seems to be a metallo -protease dependent on Co^++ or Zn^++. The endopeptidase activity was inhibited by metal chelating agents such as EDTA, 1,10-phenanthroline and EGTA and general serine protease inhibitor, PMSF. The endopeptidase activity was stimulated Ca^++, Co^++, Mn^++, Mg^++ and Ni^++. Inhibition by EDTA was reversed by 1 mM Ca^++, thus indicating that the enzyme was calcium dependent metallo-endopeptidase which serine residue involved catalytic activity. Addition of Ca^++ increased the pH and heat stability of endopeptidase activity. These showed that endopeptidase required calcium ions for activity or stability or both. Bestatin showed a competitive inhibitor to both aminopeptidase activity and endopeptidase activity. The Ki value of aminopeptidase is 5.8 μM and endopeptidase is 6.7 μM. This suggests that this metalloprotease have a dual-function, both Co^++-activating aminopeptidase and Ca^++-activating endopeptidase.

Taxonomic Review of the Caenidae, Siphlonuridae, Ameletidae, and Isonychiidae (Insecta: Ephemeroptera) in Korea : 한국산 등딱지하루살이과, 옛하루살이과, 피라미하루살이과, 빗자루하루살이과 (곤충강: 하루살이목)의 분류학적 재검토

황정미 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

하루살이목 중 등딱지하루살이과, 옛하루살이과, 피라미하루살이과, 그리고 빗자루하루살이과는 담수 생태계에 있어서 주요한 수서곤충 분류군에 속하지만, 한국에서는 아직 많은 연구가 되어 있지 않다. 지금까지 상기 분류군중에서는 한국에서 Ameletus costalis (Matsumura), A. montanus Imanishi, Siphlonurus chankae Tshernova, Isonychia japonica (Ulmer) and I. ussurica Bajkova의 3속 5종만이 기록되어 있다. 본 연구에서는 1980년 이후 채집된 유충 및 성충 표본과 실험실 및 야외에서 얻은 표본을 이용하여 분류하였으며, 비교 표본으로는 극동러시아, 중국, 그리고 일본 표본을 이용하였다. 그 결과 신종 3종[Caenis moe n. sp., Caenis tuba n. sp., and Isonychia sp. A], 한국 미기록종 4종[Caenis nishinoae Malzacher, Brachycercus tubulatus Tshernova, Siphlronurus immanis Kluge, and S. palaearcticus Tshernova]을 포함한 5속 12종을 검토하였다. 각 종에 대하여 특징을 기재하였고, 유충의 전체 형태는 half-tone drawings, 유충과 성충의 검색형질은 line-drawings로 묘사하였고, 주사전자현미경(SEM)으로 검색형질을 촬영하였으며, 검색표를 작성하였다. The mayfly families Caenidae, Ameletidae, Siphlonuridae, and Isonychiidae (Insecta: Ephemeroptera) are important aquatic insect groups in freshwater ecosystems, but have not been well studied in Korea. Only five species and three genera in the families were recorded from Korea: Ameletus costalis (Matsumura), A. montanus Imanishi, Siphlonurus chankae Tshernova, Isonychia japonica (Ulmer) and I. ussurica Bajkova. In this thesis, I reviewed the families based on larval and adult materials (part of them reared) collected throughout Korea since 1980s. Reference materials from Russian Far East, China, and Japan were also examined. As result, 12 species and five genera in the families were recognized including three new species, Caenis moe n. sp., Caenis tuba n. sp., and Isonychia sp. A, and four new Korean records, Caenis nishinoae Malzacher, Brachycercus tubulatus Tshernova, Siphlronurus immanis Kluge, and S. palaearcticus Tshernova. For each species, full descriptions for known stages were provided with larval habitus by half-tone drawings, line-drawings of key characters, and SEM photographs.

Phylogenetic Analysis of Oriental Cymbidium : 동양란 심비디움의 유전 계통 분석

최선희 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

심비디움은 생육습성에 따라, 온대성 난과 아열대성 난으로 분류가 가능하다. 한국, 중국, 대만과 일본 등지에서 자생하는 동양란 심비디움 분류의 기초자료로 활용되는 계통분석에 목적을 두고 분자유전학적 실험을 수행하였다. 18개의 동양란 심비디움을 유전적으로 분석하고, 종간, 종내 수준에서 동정 가능성을 알아보기 위해 Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) 방법과 nuclear ribosomal DNA (rDNA) 염기서열 비교방법을 이용하였다. 동양란 심비디움의 rDNA가, 다른 모든 식물이 포함하고 있는 18S 와 ITS (ITS1, ITS2, 5.8S)부분의 염기서열을 결정하여, 이들의 유전적 유연관계 분석을 시도하였다. 22개의 primer를 이용한 RAPD 분석은 유전자 증폭된 DNA 다형화 밴드의 상이성으로 각 식물에 따른 특이한 결과가 관측되었다. RAPD를 이용한 동양란 심비디움의 유전적 계통분석에서, 열대성 심비디움인 Cymbidium aloifolium, Cymbidium insigne, Cymbidium lowianum은 다른 동양란들과 유연 관계가 멀었을 뿐만 아니라, 같은 그룹을 형성하지도 않았다. 잎의 형태가 타원의 피침형인 죽백란 계통도 다른 동양란들과는 집단화 되지 않았다. 또한, 일경일화성인 동양란과 일경다화성인 동양란은 집단으로 분류가 가능하였다. UPGMA분석을 통한 유사도는 0.701에서 0.847로 나타났으며, RAPD를 이용한 동양란 분류는 형태에 기초한 전통적인 계통도와 대체로 일치하였다. 동양란의 RAPD 결과는 다른 식물종이나, 종간의 유연 관계 분석 시 유용하게 적용되리라 사료된다. 핵내 리보솜을 생성하는 유전자인 rDNA의 염기서열은 유전적으로 잘 보존된 부분인 18S와 변이가 많은 ITS의 염기 서열 결정을 통해, 유연 관계를 추정하는 목적에 이용된다. 18S와 ITS rDNA 염기서열을 통한 동양란 심비디움의 유연 관계를 RAPD와 기존 분류방법으로 비교하였다. 21개 심비디움의 18S 와 ITS rDNA 부분은 PCR 방법을 이용 하여 증폭하고, 대장균 내로 형질 전환시켜 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열들은 다중 정렬방식에 의한 염기 서열들 간 비교를 하였고, 18S 부분의 유사도 백분율은 99.2%에서 100%로 종이 다른 심비디움들 간에도 유전적으로 변이가 거의 없음을 확인하였다. ITS 부분의 유사도 백분율은 Cymbidium alofolium과 용암소심 사이의 70.1%에서부터, Cymbidium insigne와 Cymbidium lowianum간의 99.9%에 이르기까지 염기서열의 변이가 RAPD나 18S rDNA 염기서열 분석에 비해 매우 가변성이 큰 수치를 나타냈다. ITS 부분의 염기의 길이도 다양한 양상이었는데, 이는 변이가 심한 ITS 염기의 삭제 및 삽입 기작에 의한 것이라 추정된다. ITS rDNA 의 염기서열을 이용한 심비디움의 유연 관계 분석은 RAPD나 기존의 분류기준의 관점으로 보면, 일치하지 않는 부분들이 존재하나, 이는 진화적으로 매우 고속으로 진행되는 ITS 부분의 염기서열 분석을 통해, 식물의 유전자 이동에 관한 정보를 획득할 수 있으리라 사료된다. Classification of Oriental cymbidiums native to Korea, China, Taiwan, and Japan was reexamined by molecular analyses. Totally twenty one cymbidiums including eighteen Oriental cymbidiums were analyzed to identify in the interspecific and intraspecific levels by using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and nuclear ribosomal DNA (rDNA). Nucleotide sequences of the orchids rDNA including 18S and internal transcribed region (ITS1, ITS2, and 5.8S) were determined and analyzed in order to address their genetic relationship. Cymbidium can be divided into two sections based upon growth form. One is temperate type spread in Asian temperate zone, and the other is subtropical type. In RAPD analysis twenty two primers distinguished all species and cultivars by comparing differences in DNA banding patterns. The unweighted pair group method with arithmetic average (UPGMA) analysis method was used to construct a similarity matrix, and the value ranged from 0.701 to 0.847. Phylogenetic tree analysis of twenty one cymbidiums using RAPD technique identified specific groupings. Group comprised of subtropical cymbidiums (C. aloifoilum, C. insigne and C. lowianum) was distinct from other clusters. C. lancifolium and C. aspidistrifolium having peculiar phenotype clustered separately from plain Oriental cymbidiums. Morphological characters were fully congruent with the well-supported groups identified in the RAPD analysis, and the phylogenetic tree arose from RAPD resulted in similar taxonomy compared to that of traditional classification. RAPD markers, because of their greater variability, seems to provide a useful alternative to isozyme marker for assessing diversity in rare species and for determining relationships among the species. Phylogenetic tree analysis using nuclear rDNA nucleotide sequence data of twenty one cymbidiums were investigated to obtain genetic information, and compare genetic relationship to those of RAPD and traditional classification. Nuclear rDNA came from 18S and ITS region of twenty one species and cultivars of genus Cymbidium were amplified by the polymerase chain reaction and their nucleotide sequences were determined. Determined nucleotide sequences were compared to analyze their relationship by pair-wise multiple alignment. Percent similarity of 18S rDNA of twenty one cymbidiums ranged from 99.2 between C. ensifolium and C. aloifolium to 100 among C. gyokuchin `Cholgolsosim', C. gyokuchin `Kwanumsosim', C. kanran (native to China), and C. kanran (native to Taiwan). The percent of divergence ranged from zero among C. gyokuchin `Cholgolsosim', C. gyokuchin `Kwanumsosim', C. kanran (native to China), C. kanran (native to Taiwan), and C. goeringii (native to Ulung Island) to 0.9 between C. aloifolium and C. ensifolium. Four restriction endonucleases were used in cut of the amplified conserved sequence of 18S rDNA in twenty one cymbidiums. Because the RFLP analysis in 18S rDNA detected high conservation, phylogenetically informative character was not remarkable. In ITS region analysis, the length of the ITS1, ITS2 and 5.8S regions varied from 189 bp to 236 bp and from 224 bp to 260bp, and from 144 bp to 166 bp, respectively. Sequence similarity at these sites ranged from 70.1% between C. lowianum and C. gyokuchin `Yongamsosim' to 99.9% between C. insigne and C. lowianum. In conclusion, ITS rDNA was very heterogenous region among all cymbidiums, but 18S was conserved. In other words, it was informative to detect genetic background. The data acquired from the results of RAPD and rDNA analyses can be applied for rapid, accurate and inexpensive identification and patent protection for other orchids genus as well as cymbidiums.

Gene cloning and immunological activity of Korean mistletoe lectin : 한국산 겨우살이 렉틴의 유전자 클론닝과 면역활성

김효선 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

Mistletoe extracts are widely used for adjuvant tumor therapy. One of the major active components in mistletoe extracts is mistletoe lectins. The lectin, heterodimeric glycoprotein linked by disulfide bond is classified as type Ⅱ ribosomal inactivating protein(RIP) due to the rRNA-cleaving enzyme activity of the A-subunit. The genes coding European mistletoe lectin and other type Ⅱ RIPs have been revealed as a single intron- free gene. Based on this fact, the genes of Korean mistletoe lectin (Viscum album L. var. coloratum., VCA) were cloned by PCR strategy and the nucleotides coding the prepro-protein were sequenced. The homology of deduced prepro-protein sequences between Korean mistletoe lectin and European mistletoe lectin were compared. A-chain and B-chain have homology of 73% and 75% respectively, overall homology of full chain shows a high value. However, when compared with the values known between same species, the homology is significantly low. Nevertheless, the homology in the regions known as active sites is relatively strong. Mistletoe lectin has been known as a potent immunomodulator in mistletoe extract. Especially, the effect of mistletoe lectin on non-specific immune response has been reported in many studies. In this study, immunological effects of Korean mistletoe lectin were also investigated. The cytotoxicity mediated by PBMC (peripheral blood mononuclear cells) was examined, the release of interferon-γ (IFN-γ) and interleukin-12 (IL-12)which are proinflamatory cytokines and secreted on natural killer (NK) cell activation were investigated to observe the mechanism of cytotoxicity mediated by PBMC. The effect of Korean mistletoe lectin on cytotoxicity mediated by PBMC showed moderate enhancement, the secretion of IFN-γ and gene expression of IL-12 were identified. These results suggest the cytotoxicity of PBMC to molt4 (target cells) was caused by the cytokine-induced NK cell activation in non-specific immune responses. All together, lectin in Korean mistletoe extract may be beneficial as a potent immunomodulator in tumor therapy.

Systematics and Ecology of the genus Hydropsyche (Insecta: Trichoptera: Hydropsychidae) in Korea : 한국산 줄날도래속 (곤충강: 날도래목: 줄날도래과)의 분류 및 생태

허준미 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

거름섭식작용을 하는 수서곤충인 줄날도래속은 우리나라의 하천에 풍부하게 서식하는 수서곤충으로서 그들은 우리나라 하천에 널리 분포하고 있으나 주로 오염된 도시 근교하천에서 볼 수 있다. 줄날도래류는 생태학적으로나 환경학적으로 매우 중요하지만, 그들의 유충과 성충 관계 그리고 생태에 관한 연구는 아직 미비한 실정이다. 본 논문에서는 우리나라에 대표적인 3종의 줄날도래류인 동양줄날도래(Hydropsyche KUe: H. orientalis), 줄날도래(Hydropsyche KUa: H. kozhantschikovi), 흰점줄날도래(Hydropsyche KUc: H. valvata)의 유충과 성충 관계를 사육실험과 종합적인 표본관찰에 의해 밝혔다. 각 종의 미성숙 단계와 성충 단계를 기재하였고, 검색형질은 line-drawing과 주사전자현미경으로 촬영하였다. 동양줄날도래와 줄날도래의 개체군에 대하여 온도에 관련된 생활사, 즉 개체군 변동, 유충 성장 및 우화양상을 경기도 가평천과 왕숙천에서 1998년 3월부터 1999년 6월까지 조사하였다. The net-spinning caddisfly genus Hydropsyche is one of the most abundant aquatic insect groups in streams in Korea. They inhibit in a wide range of stream habitats but most abundant in moderately polluted rural streams. Despite of their ecological and environmental importances, their larval-adult relationships and ecology have not been well studied. In this thesis, larval-adult relationships of three common hydropsychid caddisflies, H. orientalis (= Hydropsyche KUe), H. kozhantschikovi (= Hydropsyche KUa), and H. valvata (= Hydropsyche KUc) were clarified by rearing experiments as well as by comprehensive materials examinations. Their immature and adult stages were described, illustrated, and photographed with SEM. For the populations of H. orientalis and H. kozhantschikovi, temperature- related life histories, including population dynamics, larval development, and emergence pattern, were investigated from the Kapyong creek and the Wangsuk creek, respectively, in Kyonggi-do from March 1998 to June 1999.

Molecular Cloning of an axon guidance protein, Netrin-1 cDNA obtained from Embryonic Chicken Brain and Skeletal Muscle Tissues : 계배 뇌와 근육 조직에서 신경축색돌기 유도단백질 Netrin-1의 cDNA 클로닝

김희옥 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

신경계에서 발생단계 축색돌기의 이동은 목적세포에서 분비되는 확산성 화학반응 인자들에 의해 유도된다. in vitro에서 척수의 배쪽 midline에 있는 floor plate 세포들이 척수의 횡연합신경 축색돌기의 outgrowth를 촉진하고 이끄는 확산성 인자들을 분비하는 것으로 알려져 있다. Netrin은 척수의 floor plate cells로부터 분비되는 확산성 인자로서 axon guidance에 있어서 중심적인 역할을 하는 것으로 보여지고 있다. 실제로 netrin-1 mRNA는 척수로부터 caudal diencephalon에 이르는 축을 따라 발현되며 netrin-1은 floor plate가 존재하는 모든 axial levels에서 ventrally directed circumferential migrations에 대하여 global guidance cue로써의 기능을 하는 것으로 사료되었다. 일반적으로 신경세포의 성장방향은 그 신경에 의해 자극되는 목표세포에서 합성·분비되는 어떤 물질에 의해서 특이적으로 유도되어 목표세포와 시냅스를 이룬다. 골격근과 연결되어 자극하는 척수 운동신경세포의 경우에도 skeletal muscle에서 분비되는 어떤 물질에 의해 세포성장기점과의 응착력을 증가시켜서 유도되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 skeletal muscle에서 분비되는 이 물질이 과연 global guidance cue로 알려진 netrin과 동일 또는 유사한 물질인지 아니면 또 다른 새로운 물질인지 알아보고자 발생 10일째 계배의 skeletal muscle 조직에 대하여 chicken brain의 netrin-1 riboprobe를 제조하여 northern blot을 시행한 결과 계배 skeletal muscle조직에서도 netrin-1이 발현됨을 확인하였다. 또한 muscle조직에서 얻어진 total RNA로부터 RT-PCR을 시행하고 이를 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. DNA 염기서열분석결과 2가지 mutations를 제외하고는 netrin-1과 거의 유사한 물질임을 밝혔으며 이 mutations는 129번째 아미노산에서 첫 번째 염기가 G→T transversion을 일으켜, Gly을 Trp으로 대치시키는 missense mutation과 298번째 아미노산의 세 번째 염기가 C→T transition을 일으키지만 아미노산이 대치되지는 않는 silent mutation 이었다. 이러한 결과들은 spinal cord의 motor neuron이 skeletal muscle을 향해 성장하여 연결되는데 있어 netrin-1이 관여함을 제시하는 증거로 사료된다. Axonal guidance during development of the nervous system is highly regulated and mediated by diffusible chemotropic factors secreted by target cells. Floor plate cells in the ventral midline of the spinal cord secrete diffusible factors that promote the outgrowth of spinal commissural axons and attract these axons in vitro. Netrin is a diffusible factor secreted from floor plate cells of spinal cord and has been shown to play critical roles in axon guidance and cell migration during development. Indeed mRNA for netrin-1 was expressed at all axial levels from the spinal cord to the caudal diencephalon of chicken and mouse embryos. It was suggested that netrin-1 might function as a global guidance cue for ventrally directed circumferential migrations at all axial levels where the floor plate was found. During embryogenesis the motor neurons of the developing spinal cord are known to be guided to developing muscles by certain substances produced and released by developing skeletal muscles. To investigate whether the substances released from the skeletal muscles during embryonic development are netrin-like substances known as a global guidance cue or whole new substances, the expression of mRNA of netrin-1 in skeletal muscle of embryonic 10 day chicken was examined by Northern blot analysis. The result showed that netrin-1 mRNA was expressed in skeletal muscle as well as in brain of E10 chicken. RT-PCR was performed to clone and to sequence the gene transcript expressed in skeletal muscle. The result showed that the homology exist between brain and skeletal muscle of netrin-1 cDNA except two mutations. One mutation was a missense mutation of G→T transversion at the first nucleotide of codon 129 (GGG→TGG), substituting Gly for Trp, and the other was a silent mutation of C→T transition at the third nucleotide of codon 298 (GGC→GGT). These results suggest that netrin was also expressed in the skeletal muscle of the developing embryo and may be involved in some way to guide the spinal motor neurons.

Physicochemical Properties of Glycinin Purified from Glycine Max Var, Huanggumkong and Effects of Malcylation on Functional Properties of Glycinin : 황금콩 종으로부터 분리한 Glycinin의 이화학적 특성과 말레일화가 Glycinin의 기능적 특성에 미치는 영향에 관한 연

김세란 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

대두 단백질의 고부가가치를 위해 콩의 주요 저장 단백질인 glycinin을 순수 분리하여 이화학적 특성과 말레일화에 따른 기능적 특성에 미치는 영향을 살펴보았다. 또한 최근 여러 가지 다양한 생리 기능성을 가진 것으로 알려진 대두 단백질의 분해 산물인 펩타이드를 제조하는 데 필요한 기초 자료를 얻고자 단백 분해 효소에 의한 분해 패턴에 관하여 조사하였다. 황금콩 단백질로부터 분리한 glycinin의 라이신 잔기를 maleic anhydride를 이용하여 65%, 95%로 말레일화 시켰다. 말레일화에 의한 glycinin의 구조적 변화를 UV흡광법을 이용하여 측정한 결과, 타이로신 잔기는 자연상태의 단백질에 비해 95% 말레일화 glycinin에 있어서 표면에 노출되는 정도가 뚜렷하게 증가하여 용매에 대한 접근이 용이하게 되었다. 타이로신과 같은 소수성 아미노산인 트립토판 역시 말레일화에 따른 단백질의 구조 변형에 의해 점차 단백질의 소수성 내부로부터 친수성 표면으로 이동하였음을 알 수 있었다. 단백질의 기능적 특성에 특히 중요한 물리화학적 성질 중 하나인 유연성은 유연성과 역관계에 있는 엔탈피를 DSC를 이용하여 측정한 결과 자연상태의 단백질에 있어서는 3.4 cal/g단백질에서 65% 말레일화 이상의 단백질의 경우에는 0 cal/g으로 유연성이 급속히 증가함을 알 수 있었다. 또한 pH 2와 11.5 에서의 DSC 결과에서 부분적 변성을 나타내주는 T0 값의 감소가 관찰되었는데, NaCl의 첨가로 열에 대한 안정성이 증가되는 것으로 나타났으며, NaCl의 농도가 증가할수록 그 효과도 증가하였다. Circular dichroism의 결과 말레일화에 의해 단백질의 β-sheet가 감소하고 unordered structure가 증가하여 유연성이 증가하였는데 이는 DSC 결과와도 일치하는 것임을 알 수 있었다. 특히 염기성 조건 (pH 11.5)에서의 CD spectrum은 약간의 random coil의 증가를 보여주었고 가열 온도가 높아질수록 β-sheet로 전환되어 CD band가 215nm 근처로 이동하였다. 또한 가열 온도가 90℃로 높아졌을 때 α-helix 구조가 증가하여 DSC의 결과와 마찬가지로 NaCl의 첨가가 glycinin의 열에 대한 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. 말레일화에 의해 단백질의 pH에 따른 혼탁도는 산성쪽으로 이동하였으며 혼탁 정도는 자연상태의 glycinin에 비해 현저히 감소하였다. 혼탁도가 나타나는 pH의 이동과 감소는 말레일화에 의해서 ε- 아미노기에 대한 전하가 +1에서 0으로 되었기 때문이며, 단백질간의 응집의 주된 힘이 수소결합에서 소수성 결합으로 바뀌었기 때문이다. NaCl은 자연상태의 glycinin의 혼탁도를 낮추었으나 화학적 변성이 일어난 glycinin에 있어서는 그 영향이 현저하게 감소하였다. 말레일화 단백질은 열에 대하여 안정성을 나타내었으나 자연상태의 단백질은 80℃에서 3분간 가열처리에 의해 급속히 혼탁 되었는데 이는 말레일화에 의해 glycinin의 음전하가 상대적으로 증가하여 단백질간의 반발력이 증대되었기 때문에 나타나는 현상이다. 단위 단백질의 프로테아제에 의한 펩타이드 분해 패턴의 연구에서 whole protein을 API로 가수분해 시켰을 때는 분해물의 분획 가능한 펩타이드가 7개 검출되었으며, trypsin으로 가수분해 시켰을 경우에는 9개 인 것으로 나타났다. 부분 정제된 conglycinin을 API 또는 trypsin으로 가수분해 시켰을 때의 분해 패턴은 펩타이드 10개 정도로 나타났으며, 정제된 glycinin을 API로 가수분해하였을 경우의 분획 가능한 펩타이드는 18개 정도로 나타났다. 특히 trypsin 처리의 경우 lysine을 포함해 arginine까지 절단하여 peak는 API보다 더욱 세분화되었으며, 분획 가능한 peak의 수는 20개 정도인 것으로 나타났다. 이상에서 살펴 본 바와 같이 말레일화에 의해 glycinin의 구조는 급속히 변성되었으며, 특히 65% 이상에서는 그 변화의 폭이 크게 나타났다. 말레일화가 일어난 단백질의 기능적 특성 중 혼탁도의 향상은 전하의 이동과 단백질의 구조적 변성, 특히 표면 소수성과 유연성의 변화에서 기인함이 밝혀졌고 펩타이드 분해패턴에 관한 연구에서는 API 또는 trypsin으로 glycinin의 완전 가수분해가 가능한 것으로 나타났다. To apply the soy protein for making high value added products, the physicochemical properties of soy protein and the methods to improve the functionalities were studied. In addition, to investigate the hydrolysis pattern of soy proteins known as nutraceutical activities, the various peptides were also hydrolyzed. Glycinin(11S) was modified by maleic anhydride to the degree of 65%, and 95%. Maleylation of ε-amino group of lysine residues changed the conformation of glycinin, the extent of which was affected by the degree of modification. The direct uv spectrum of native glycinin at wide pH range showed conformational changes in extreme acidic and basic conditions. Accessibility of tyrosine and tryptophan residues, which were shown to increase as modification percent increased, were detected using uv absorption spectra. The DSC result of native glycinin indicated that glycinin had high thermal stability. Enthalpy as obtained from differential scanning calorimetry, dropped from 3.4 cal/g native protein to 0 cal/g protein when lysine residues were maleylated above 65%, implicating complete denaturation. At extreme acidic or alkaline condition, transit temperature decreased as a result of partial denaturation. Adding of NaCl raised the T0 value, it can be seen that thermal denaturation of 11S soy protein was affected by sodium chloride. Circular dichroism spectra of native and maleylated glycinin showed decrease in the ordered structure and increased in unordered structure upon maleylation. At pH 11.5, the CD spectra exhibited a little blue shift to 206nm. Upon heating the CD band shifted back 215nm indicating some of the unordered structure had been converted to β-sheet. By adding of sodium chloride, there was remarkable increase in α-helix content. Effect of the maleylation on turbidity of protein was investigated using samples of 0%, 65%, and 95% maleylation. Turbidity of maleylated glycinin decreased and isoelectric point shifted to acidic region. Sodium chloride was found to hardly affect turbidity of maleylated glycinin in contrast to native one. Sodium chloride depressed turbidity of native protein while that of 95% modified samples was scarcely changed. Heat stability of glycinin was found to increase by maleylation. High performance liquid chromatography(HPLC) patterns of purified glycinin showed that retention times of main peaks between with β-mercaptoethanol and without β-mercaptoethanol were almost the same, but those between with salt and without salt were changed a little. Change of the retention time by elution buffer containing NaCl suggested that conformation of glycinin was changed. The peptide fraction could be isolated from digested whole protein by API or trypsin. The partially purified conglycinin was hydrolyzed by API or trypsin were 10 and 10, respectively. The number of peptide fraction from the glycinin digested by API or trypsin were 18 and 20, respectively.

Expression and characterization of recombinant human ATⅢ in chinese hamster ovary cell using novel vector system : CHO cell에서 새로운 벡터 시스템을 이용한 재조합 ATⅢ의 발현과 특성

오선모 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

Antithrombin Ⅲ (ATⅢ)는 간에서 생성되는 단백질로 thrombin을 비롯한 혈액응고에 관련된 보조인자들을 억제하는 기능을 가지고 있다. 이들은 432개의 아미노산으로 구성되어 있으며 이 중 4개의 asparagine에는 N-glycosylation이 형성되어 ATⅢ 단백질이 활성화된 형태를 갖는데 중요한 역할을 한다. 활성화된 형태의 ATⅢ 단백질을 얻기 위해 인간의 혈장에 존재하는 ATⅢ와 유사한 glycosylation을 형성하는 Chinese hamster ovary 세포주에서dehydrofolatereductase (DHFR)-methotraxate(MTX) 를 이용한 유전자증폭 시스템을 사용하여 재조합 ATⅢ 단백질을 생산하였다. 더 나아가 재조합 단백질 생산의 효율을 더욱 높이기 위하여 matrix attatchment region element를 삽입한 새로운 pMSG 벡터를 이용하여 유전자를 도입하였다. 처음 으로 선발된 pMSG-ATⅢ 클론들의 생산량은 대조군인 pSV-ATⅢ의 클론들의 생산량보다 10배 높았다. 여러 클론 중 가장 높은 발현량을 보이는 클론을 선발하기 위해 MTX의 농도를 점진적으로 높여주면서 각각의 클론의 ATⅢ 단백질량을 측정한 결과 18번 클론이 선택되었다. 유전자 증폭의 최종 단계에서 18번 클론의 발현량은 10 μg/ml/106 이었고 이 때 유전자의 copy 수는 100 copy 였다. 여기에 sodium butyrate를 배지에 첨가한 결과 생산량은 더욱 증가하였다. 이온교환수지, 헤파린친화성수지를 이용한 세 단계의 정제 과정을 통해 18번 클론의 배양상층액으로부터 재조합 ATⅢ 단백질을 정제하였으며 정제된 ATⅢ 단백질은 95% 이상의 동질성을 보였다. 최종적으로 N-terminal sequencing과 glycosidase 효소 분해의 결과를 통해 본 시스템에서 생산된 ATⅢ 단백질이 인간의 혈장에 존재하는 ATⅢ 단백질과 유사한, 활성화된 형태의 단백질임을 확인하였다. Antithrombin Ⅲ (ATⅢ) is single-chain plasma glycoprotein synthesized in the liver which inhibits thrombin and other serine proteases including factor IXa, Xa, XIa, and XIIa involved in blood coagulation. This reaction is accelerated up to several thousand fold by heparin. The ATⅢ is protein of 432 residues and four N-linked carbohydrate moieties comprising 9% of the molecule by weight. The N-glycosylation of ATⅢ plays important role to make active form. Chinese hamster ovary (CHO) cells has been used commonly to produce therapeutically useful recombinant proteins including ATⅢ by gene amplification system using dehydrofolate reductase (DHFR) and methotraxate (MTX). The expression of recombinant human ATⅢ (rh-ATⅢ) is investigated in this report to archive active proteins in high level by using recently developed pMSG vector system. The yield of pMSG-ATⅢ clones was tenfold higher than that of pSV-ATⅢ clones in initial screening. Individual clones were selected for amplification by increasing concentration of MTX. The pMSG-ATⅢ-18 clone was picked up by having the highest expression level and by maintaining the proper growth properties. The production rate of rh-ATⅢ from this clone was 10 μg/ml/106 cells and the copy number of the introduced ATⅢ was about 100 copies per cell. Furthermore, in order to increase yield of rh-ATⅢ from pMSG-ATⅢ-18 clone, sodium butyrate was treated in culture medium and the final yield was increased significantly. From culture supernatant of pMSG-ATⅢ-18 clone, rh-ATⅢ proteins were purified through three round of purification steps using ion exchange and heparin-affinity chromatography. The rh-ATⅢ was purified highly into over 95% homogeneity and that contained full biological function. The purified rh-ATⅢ was also verified by N-terminal sequencing and various glycosidase digestions and compared to human plasma derived ATⅢ.