Plasma-induced Graft Polymerization of Acrylic Acid and Plasma Polymerization of Allylamine on Polymeric Surfaces for Biomaterial Applications

Sung-Woon Myung Graduate School, Chungnam National University 2007 국내박사

In this thesis, plasma surface modification and functionalization were conducted with different plasma techniques. In a vacuum system, oxygen plasma treatment was used to introduce large amount of carboxyl groups on the surface of PU (polyurethane) films through plasma-induced graft polymerization and plasma polymerization was applied to synthesize plasma polymer thin film with highly retaining amine groups. And atmospheric pressure plasma was used to modify the PU foam for preparing ion exchanger and media based on the synthesized PU-g-PAAc. For the basic study, polyurethane films were modified with the vacuum oxygen plasma and then plasma-induced graft polymerization was applied to introduce carboxylic groups on the surface of PU. The optimum plasma discharge conditions of 100 W, 250 mtorr, and 30 sec were decided for the maximum concentration (2 nmo1/㎠) of reactive peroxides on the surface of PU film. Successful synthesis of PU-g-PAAc was identified using water contact angle, ATR-FTIR, ESCA, and optical microscopy. The feasibility of introducing biocompatible functional groups, which are commonly used in biomaterials, onto the surface of other materials was demonstrated in this study. Such a technique can have potential in many other applications. Plasma-induced grafting method was also applied to polyurethane foam which has a good mechanical property. The surface of PU foam(10 pore per inch) was modified through atmospheric pressure plasma treatment and subsequent grafting of AAc(acrylic acid). Atmospheric pressure plasma, which is a continuous and economic process, was utilized in this experiment. Through this study, it was found that the optimum plasma treatment conditions were the RF-power of 100 W and the treatment time of 100 sec. The immobilization of Lysozyme was successfully confirmed through the electrophoresis analysis of proteins, which were recovered by the PU-g-PAAc foam from egg white. And it was also found that the PU-g-PAAc showed 2.7 and 3.0 fold higher microbial immobilization than unmodified one, respectively. The PU-g-PAAc foam has a potential for applying to high throughput ion exchange and microbe media. Plasma polymerization of allylamine in both inductively coupled plasma and inner electrode plasma using RF power with continuous wave (CW) and pulsed wave was conducted in order to make organic thin film with amine functional group retained. The characterization of plasma-polymerized-allylamine (PPAa) thin film was performed mainly to provide the fundamental understanding of systematical effect about plasma processing conditions. The characteristics of PPAa highly depend on the type of the reactor and input power. For the view point of the surface introduction of high amine functionality, the following conclusions were summarized. RF continuous wave with less than 30 W power in ICP reactor resulted in PPAa thin film retaining more amine groups due to less fragment of monomer reducing a high degree of ionization. RF continuous wave plasma with inner electrode was effective for introducing the high retention amine group. In this RF continuous wave power, the N/C ratio indicated 25 - 27 % indicated that the amine percent of surface were 4.37 - 7.10 % in the 30 - 80 W power range studied. In RF pulsed wave power, the plasma-polymerized-allylamine thin film showed relatively low N/C ratio of 17.06 - 18.50 % at 300 - 400 W with duty cycle 0.1, but resulted in the relatively high amine percent of 4.86 - 6.41 %. This means that the surface amine percent of PPAa at RF pulsed pow□□ could be retained more efficiently than that of PPAa at RF continuous wave power. If the properties of plasma polymer were discovered further more, we can apply the plasma polymer to a proper application by developing the process system. A dissertation submitted to the committee of Graduate School, Chungnam National University in a partial fulfillment of the requirements for the degree Doctor of Philosophy conferred in February 2007. 본 논문에서는 저온 플라즈마의 표면 처리 및 관능기 도입 기술을 적용하여 고분자 소재를 기반으로 하는 생체소재의 개발을 목적으로 하였다. 진공 산소 플라즈마를 이용하여 폴리우레탄(이하 PU) 필름 표면을 개질하고, 플라즈마 중합을 실시하여 플라즈마 중합 알릴아민 박막을 제조하였다. 그리고 대기압 플라즈마로 PU 폼을 처리하여 이온 교환체와 미생물 담체를 제조하였다. 우선 PU 필름을 진공 산소 플라즈마로 처리하여 플라즈마 유도 그라트팅 중합법을 확립하였다. PU 필름 표면에 진공 산소 플라즈마로 활성화한 후 형성된 퍼옥사이드는 DPPH 법으로 정량하였고, 최대 표면 퍼옥사이드 농도를 측정하여 최적 플라즈마 처리 조건을 결정하였다. 최적 플라즈마 처리 조건은 RF 전압이 100 W이고 압력은 250 mtorr, 처리 시간은 30 초로 결정되었고, 이 때의 최대 퍼옥사이량은 2 nmol/㎠이다. 카로복실기의 성공적인 도입은 물접촉각, ATR-FTIR, ESCA, 광학현미경으로 확인하였다. 확립된 플라즈마 유도 그라프팅법은 다른 여러 생체의용소재 개발 등에 응용 및 적용될 수 있다. 망상형 PU 폼(10 pores per inch)에 앞서의 플라즈마 유도 그라트팅 중합법을 적용하였다. 보다 효율적인 대기압 플라즈마로 망상형 PU 폼의 표면을 활성화하였고, 무게 변화를 측정하여 계산된 최대 AAc의 그라프팅율(이하 GD)을 조사한 결과, 최적 대기압 플라즈마 처리조건은 RF 전압 100 W와, 처리 시간 100 초였다. 달갈 흰자에 함유된 단백질 및 효소들을 합성한 PU-g-PAAc로 회수하고, 전기 영동으로 Lysozyme과 단백질에 대한 PU-g-PAAc의 고정화능을 조사하였다. PU-g-PAAc 의 GD가 증가함에 따라 정전기적 상호작용이 증가하여 Lysozyme과 단백질의 고정화량도 향상됨으로써 이온 교환체에 적용 가능성을 확인하였다. 또한 미생물 고정화능도 향상되어 미생물 담체로 이용 가능함을 알 수 있었다. 플라즈마 중합 알릴아민 박막을 제조하기 위해서 유도결합형 플라즈마와 내부 전극 형태의 플라즈마 장비를 사용하여 RF 연속전압과 펄스 전압 하에서 표면 관능화 기법인 플라즈마 중합을 수행하였다. 효과적으로 표면에 아민기를 도입하기 위한 주요 플라즈마 중합 변수로는 RF 전압을 사용하였고, 다른 조건은 일정하게 두었다. 플라즈마 중합 알릴아민 박막의 특성화를 통하여 플라즈마 공정조건이 박막 특성에 주는 영향을 좀 더 자세히 알 수 있었다. 특히 플라즈마 중합 알릴아민 박막 특성은 반응기 형태에 따라 달라지고, 전압 특성에 크게 의존하는 것을 알 수 있었다. 알릴아민 플라즈마 중합 시 표면 아민기 퍼센트의 효율적인 도입 측면에서 플라즈마 반응기와 RF 전압에 따른 표면 아민 퍼센트에 대해서 다음과 같은 결론을 내렸다. 유도결합형 플라즈마에서는 30 W이하의 낮은 전압에서 아민기의 손실을 줄일 수 있었다. 내부 전극 형태의 플라즈마 반응기에서 중합된 플라즈마 중합 알릴아민 박막의 특성은 비슷한 RF 연속전압의 유도결합형 플라즈마에서 보다 25 - 27%의 높은 표면 N/C비를 보여주어 알릴아민 분쇄를 줄일 수 있었으며, 이 때의 표면 아민기 퍼센트는 4.37 - 7.10 %로 계산되었다. 그러나 RF 펄스전압을 인가하였을 때의 플라즈마 중합 알릴아민 박막은 17.05-18.5 %의 낮은 표면 N/C 비에도 4.86 - 6.41 %의 높은 아민기 퍼센트를 나타내어 보다 효과적으로 낮은 RF 펄스전압에서 아민기를 도입할 수 있었다. 플라즈마 중합 고분자의 특성을 잘 이해하면 적절한 플라즈마 시스템을 개발하여 플라즈마 고분자의 응용성을 향상시킬 수가 있다. 그러나 앞으로 PPAa와 같은 친수성 플라즈마 고분자는 수용액이나 용매 속에서 안정성이 떨어지므로 이를 개선하기 위한 연구가 필요하다.

STUDY ON FREEZING OF BOAR SEMEN AND IN VITRO FERTILIZATION OF PORCINE OOCYTE : 돼지의 동결정액과 체외수정에 관한 연구

YI, YOUNG-JOO Graduate School Chungnam National University 2004 국내박사

This study were conducted to investigate the effects of diluent components, freezing rate, thawing time and thawing temperature on acrosome morphology and motility of frozen-thawed boar sperm. Also, this study was carried out to obtain informations about the effects of cysteamine addition on pig oocyte maturation and the effects of sperm concentrations, sperm washing treatments and culture media for in vitro fertilization and culture of in vitro matured pig oocytes. Results of these studies were as follows; 1. Effects of diluent components on acrosome morphology and motility These experiments were carried out to investigate the effects of N-acetyl-D-glucosamine, and to obtain additional informations about the effects of Orvus ES Paste (OEP), egg yolk, glycerol concentration, glycerol equilibration time and comparison of incubation time between LEY and LEN diluent in the freezing of boar sperm in the maxi-straw. 1) The highest post-thaw NAR acrosome and motility were obtained with 0.025 or 0.05% N-acetyl-D- glucosamine concentration in the first diluent. However, there were no differences among the diluents with or without N-acetyl-D-glucosamine at the second dilution. 2) When the 0.05% N-acetyl-D-glucosamine was supplemented in the first diluent, the optimum final OEP content was 0.5%. 3) The optimum content of egg yolk in the diluent with 0.05% N-acetyl-D-glucosamine concentration was 20% and egg yolk was the main cryoprotective agent. 4) The optimum final glycerol concentration in the diluent with 0.05% N-acetyl-D-glucosamine was 2% and the optimum glycerol equilibration time was 3 h. 5) There were no differences between LEN and LEY diluents on post-thaw sperm motility according to incubation time. The LEN diluent was higher NAR acrosome than the LEY diluent at 0.5 h incubation. However, there were no differences between the LEN and LEY diluents on post-thaw NAR acrosome at 2, 3 and 4 h incubations. 2. Effects of freezing rate, thawing time and thawing temperature on acrosome morphology and motility Aluminum rack distances from liquid nitrogen surface for sperm freezing were 5, 11 and 17 cm. Submersion times were 30, 35, 40, 50 and 55 sec at 52℃. Thawing temperatures were 4, 22, 37, 45, 52, 72 and 84℃ and thawing times were 12 min 31 sec, 1 min 52 sec, 1 min 3 sec, 40 sec, 35 sec, 30 sec and 15 sec, respectively. 1) The straws frozen from 5.0 cm (20℃/min) to 17.0 cm (1℃/min) above the liquid nitrogen surface did not show any significant differences on post-thaw sperm motility. However, the straws frozen above 5.0 cm from the liquid nitrogen surface were higher NAR acrosome than those frozen above 17.0 cm. 2) The post-thaw percentages of motile sperm and acrosomes with a normal apical ridge (NAR) at the initial microscopic examination were significantly higher (P<0.05) in the 5 ml straws submerged for 40 or 45 sec in 52℃ water bath than in any other duration of submersion. The mean sample temperatures of straws after 40 or 45 sec submersion were 20.7 or 26.4℃. 3) The 5 ml straws were thawed to be reached at 19- 20℃ sample temperature at different combinations of temperatures and times except at 4℃ thawing temperatures. The sample temperatures of 5 ml straw during thawing were very important on post-thaw sperm motility and NAR acrosome. 3. Effects of cysteamine addition on maturation, IVF and culture of pig oocytes These experiments were carried out to investigate the effects of cysteamine addition during in vitro maturation in mTCM-199. Oocytes were matured for the first 22 h in mTCM-199 media supplemented with or without 150 μM cysteamine. They then were matured for an additional 22 h in those without hormones supplemented with or without 150 μM cysteamine. 1) When cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in the mTCM-199 media supplemented with cysteamine, the rates of GVBD and maturation (metaphase Ⅱ) were enhanced in comparison to the media without the addition of cysteamine. 2) When COCs were matured in the mTCM-199 media supplemented with cysteamine, the rates of sperm penetration and male pronucleus formation after in vitro fertilization were enhanced in comparison to the media without the addition of cysteamine. 3) When COCs were matured in the mTCM-199 medium supplemented with cysteamine, the rates of cleavage and blastocyst formation were enhanced in comparison to the media without the addition of cysteamine. 4. Effects of sperm concentrations, sperm washing treatments and culture media on in vitro fertilization and developmental ability of pig oocytes These experiments were carried out to investigate the effects of sperm concentrations, sperm washing treatments and culture media on in vitro fertilization and developmental ability of in vitro matured pig oocytes. Sperm concentrations were 0.2×10^(7), 2×10^(7), 20×10^(7) and 200×10^(7)/ml, respectively. Oocytes were inseminated with untreated (unwashed and nonpreincubated) or treated sperm (washed two times in BTS, mTLP-PVA and mTBM solution, respectively and nonpreincubated) with 2×10^(7)/ml sperm concentration. Culture media were NCSU-23, HEPES buffered (25 mM) NCSU-23, PZM-3 and PZM-4, respectively. 1) Increasing the sperm concentration from 0.2×10^(7) to 2×10^(7)/ml significantly increased the penetration rate. Also, increasing the sperm concentration from 20×10^(7) to 200×10^(7)/ml increased the penetration rate from 62.1 to 69.9%, respectively, with no differences between these two concentrations. A similar pattern was observed for polyspermic penetration and male pronucleus formation. The mean number of sperm per oocyte significantly increased from 20×10^(7)/ml sperm concentration. 2) The rates of cleaved oocytes at 0.2×10^(7)/ml sperm concentration was significantly lower than those at 2×10^(7), 20×10^(7) and 200×10^(7)/ml sperm concentrations. A similar pattern was observed for blastocyst formation. 3) Sperm motility reduced dramatically during culture in each treatment (about 42.9-50.0% at the start of culture to 15.0-29.3% at 6 h of culture). Oocyte inseminated with sperm washed by the mTLP-PVA and mTBM washing media showed 51.7 and 53.9% sperm penetration, 2.5 and 4.1% polyspermy, and 43.3 and 43.9% male pronuclear formation, respectively. Sperm penetration and male pronuclear formation were higher in the BTS, mTLP-PVA and mTBM washing treatments than the unwashed treatment (P<0.05). 4) The percentage of cleaved oocytes was higher in the BTS, mTLP-PVA and mTBM washing treatments than the unwashed treatment, and the percentage of blastocysts from cleaved oocytes was higher in the mTLP-PVA washing treatment than the unwashed, BTS washing and mTBM washing treatments. 5) The percentage of blastocyst formation and the cell numbers per blastocyst were significantly higher in the HEPES buffered NCSU-23 culture medium than in the NCSU-23, PZM-3 and PZM-4 culture medium. In conclusion, the LEN diluent containing 0.05% N-acetyl-D-glucosamine in the first diluent for boar sperm freezing had a beneficial effect on acrosome morphology and motility. The temperature of water bath from 22 to 84℃ was not important for post-thaw sperm survival in the LEN diluent of 5 ml straw but the sample temperature of the thawed semen was very important. When the oocytes were matured for the first 22 h in mTCM-199 media supplemented with 150 μM cysteamine, the rates of metaphase Ⅱ, sperm penetration, male pronucleus and blastocyst formation were higher compared with the media without addition of cysteamine. The sperm concentration of 2×10^(7)/ml and the washing of frozen-thawed sperm with mTLP-PVA medium before in vitro fertilization of oocytes in mTBM medium were very important to improve the blastocyst formation of oocytes. Also, HEPES buffered NCSU-23 medium has been the most successful for the culture of pig embryos. 본 연구는 희석액의 조성, 동결속도, 융해시간과 융해온도가 동결-융해 정자의 첨체형태와 운동성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 또한, 본 연구는 돼지 난포란의 체외성숙 배양배지에 cysteamine 첨가가 체외성숙, 체외수정 및 배양에 미치는 영향, 그리고 체외성숙된 돼지 난포란에 있어서 주입정자농도, 정자처리방법 그리고 배양배지가 체외수정 및 배양에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 본 연구의 결과들을 요약하면 다음과 같다. 1. 희석액 조성이 정자의 첨체형태와 운동성에 미치는 영향 N-acetyl-D-glucosamine, 계면활성제 (Orvus ES Paste: OEP), 난황, 글리세롤 농도, 그리고 글리세롤 평형시간이 돼지의 스트로 동결정액 제조시 정자에 미치는 영향을 구명하기 위하여 수행하였다. 그리고 LEN 희석액과 LEY 희석액을 이용한 동결정액에 있어서 융해 후 보존시간이 정자의 첨체형태와 운동성에 미치는 영향을 조사하였다. 1) 1차 희석액에 0.025 또는 0.05% N-acetyl-D- glucosamine 처리시 동결-융해 후 최고의 정상 첨체비율과 운동성을 보였다. 그러나 2차 희석액에 N-acetyl -D-glucosamine을 처리한 것과 처리하지 않은 것 사이에는 유의적인 차이가 없었다. 2) 1차 희석액에 0.05% N-acetyl-D-glucosamine을 첨가하였을 경우 최적의 OEP 최종농도는 0.5%이었다. 3) 0.05% N-acetyl-D-glucosamine을 처리한 희석액에 있어서 최적의 난황 함량은 20%였으며, 난황이 주요 동해방지제임이 증명되었다. 4) N-acetyl-D-glucosamine을 0.05% 첨가한 희석액에서 최적의 glycerol 최종농도는 2%였으며, glycerol 평형시간은 3시간이었다. 5) LEN 희석액과 LEY 희석액을 이용한 동결정액에 있어서 융해 후 보존시간이 정자의 정상첨체율과 운동성에 미치는 영향에 있어서 보존시간에 따른 융해 후 운동성은 LEN 희석액과 LEY 희석액간의 유의적인 차이는 없었다. 그리고 0.5시간 보존하였을 때 LEN 희석액의 정상첨체율이 LEY 희석액의 정상첨체율보다 높게 나타났다. 그러나, 2, 3 그리고 4시간 보존에서는 LEN과 LEY 희석액간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 2. 동결속도, 융해시간 그리고 융해온도가 정자의 첨체형태와 운동성에 미치는 영향 융해온도는 각각 4, 22, 37, 45, 52, 62, 72 그리고 84℃였고, 각각 융해온도에 따른 융해시간은 12분 31초, 1분 52초, 1분 3초, 43초, 40초, 35초, 30초 그리고 15초였다. 1) 액체질소 상단 5.0 cm (20℃/min) 부터 17.0 cm (1℃/min) 사이에서 동결한 스트로에 있어서 융해 후 정자의 운동성은 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 그러나 액체질소 상단 5 cm에서 동결한 스트로는 상단 17 cm에서 동결한 스트로보다 더 높은 정자의 정상첨체율을 보였다. 2) 52℃에서 40 또는 45초간 융해하였을 때 정자의 운동성과 정상첨체율이 가장 높았다. 융해된 정액의 온도는 각각 20.7℃와 26.4℃이었다. 3) 4℃ 융해온도를 제외하고 융해온도가 19-20℃가 되도록 융해한 결과, 융해된 정액의 온도는 융해 후 정자의 운동성과 정상첨체율에 중요한 영향을 미쳤다. 3. 돼지 난포란의 체외성숙시 cysteamine 첨가가 체외성숙, 체외수정 및 배양에 미치는 영향 돼지 난포란의 체외성숙시 cysteamine 첨가가 미치는 영향을 조사하기 위하여 mTCM-199 성숙배지에 처음 성숙 22시간동안 150 μM cysteamine을 첨가하거나 첨가하지 않고 성숙시켰다. 그리고 성숙 22시간 후 호르몬이 첨가되지 않은 mTCM-199 성숙배지에 150 μM cysteamine을 첨가하거나 첨가하지 않고 성숙을 계속하였다. 1) Cysteamine이 첨가된 성숙배지에서 성숙시킨 난포란이 cysteamine이 첨가되지 않은 성숙배지에서 성숙시킨 난포란보다 GVBD와 metaphase Ⅱ 생성율이 높았다. 2) Cysteamine이 첨가된 성숙배지에서 성숙시킨 난포란이 cysteamine이 첨가되지 않은 성숙배지에서 성숙시킨 난포란보다 체외수정 결과 정자침투율과 웅성전핵형성율이 높았다. 3) Cysteamine이 첨가된 성숙배지에서 성숙시킨 난포란이 cysteamine이 첨가되지 않은 성숙배지에서 성숙시킨 난포란보다 난할율과 배반포 발생율이 높았다. 4. 체외성숙된 돼지 난포란의 체외수정과 배발달에 미치는 주입정자농도, 정자처리방법 그리고 배양배지의 영향 체외성숙된 돼지 난포란의 체외수정과 배발달에 미치는 주입정자농도, 정자처리방법 그리고 배양배지의 영향을 조사하기 위하여 0.2×10^(7), 2×10^(7), 20×10^(7) 그리고 200×10^(7)/ml의 정자농도로 체외수정 하였다. 난모세포의 수정은 처리하지 않은 정자와 BTS, mTLP-PVA 그리고 mTBM으로 처리한 정자이었다. 배양배지는 NCSU-23, HEPES buffered NCSU- 23, PZM-3 그리고 PZM-4를 이용하여 배양하였다. 1) 0.2×10^(7)/ml에서 2×10^(7)/ml로 주입정자농도가 증가함에 따라 정자침투율도 유의적으로 증가하였다. 또한, 20×10^(7)그리고 200×10^(7)/ml로 주입정자농도가 증가함에 따라 정자침투율이 각각 62.1과 69.9%로 증가하였다. 그러나 두 농도간의 유의적인 차이는 없었다. 비슷한 현상이 다정자 침입과 웅성전핵형성율에서도 나타났다. 난포란당 평균 침입정자수는 20×10^(7)/ml부터 유의적으로 증가하였다. 2) 난할율은 0.2×10^(7)/ml의 주입정자농도가 2×10^(7), 20×10^(7) 그리고 200×10^(7)/ml 보다 유의적으로 더 낮았다. 배반포 형성율에서도 비슷한 경향이 나타났다. 3) 각각 처리된 정자는 배양시간이 경과함에 따라 운동성이 급격하게 감소하였다 (배양개시시 정자의 운동성은 42.9-50.0%이었으며 배양종료시인 6시간 후 정자의 운동성은 15.0-29.3%이었다). mTLP-PVA와 mTBM으로 처리한 정자를 이용하여 체외수정시킨 난포란에서 각각 정자침투율 51.7과 53.9%, 다정자침입율 2.5와 4.1% 그리고 웅성전핵형성율 43.3과 43.9%를 보였다. 정자침투율과 웅성전핵형성율은 BTS, mTLP-PVA 그리고 mTBM으로 처리한 정자가 처리하지 않은 정자보다 높았다. 4) 난할율은 BTS, mTLP-PVA 그리고 mTBM으로 처리한 정자가 처리하지 않은 정자를 이용하였을 때보다 높았다. 그리고 분할된 수정란으로부터의 배반포 발생율은 mTLP-PVA로 처리된 정자로 수정하였을 때 다른 정자 처리를 이용한 것보다 가장 높았다. 5) 배반포 발생율과 배반포당 세포수는 HEPES buffered NCSU-23에서 배양되었을 때가 NCSU-23, PZM-3 그리고 PZM-4에서 배양되었을 때보다 높았다. 결론적으로, 돼지 동결정액에 있어서 1차 희석액에 0.05% N-acetyl-D-glucosamine이 첨가된 LEN 희석액은 정자의 첨체형태와 운동성에 유익한 효과를 나타내었다. 5 ml 스트로 동결정액의 융해에 있어서 22℃에서 84℃까지의 융해온도는 융해 후 정자의 생존능력에 중요하지 않지만 융해직 후 정액의 온도는 중요하였다. 돼지 난포란의 성숙배양에 있어서 처음 성숙배양 22시간 동안 mTCM-199 배지에 호르몬과 150 μM cysteamine을 첨가하였을 때 metaphase Ⅱ 생성율, 정자침입율, 웅성전핵형성율 그리고 배반포 형성율을 향상시켰다. 정자주입농도가 2×10^(7)/ml로 주입하였을 때 난할율과 배반포 형성율이 가장 좋았다. 동결-융해된 정자를 mTLP-PVA로 처리하여 체외수정 시켰을 때 정자침입율, 웅성전핵형성율 그리고 배반포 형성율이 가장 좋았다. 또한 돼지 수정란의 배양에 있어서 HEPES buffered NCSU-23에서 배양하였을 때 가장 좋은 결과를 보였다.

Immunogenicity of Nucleocapsid Proteins of PEDV and TGEV Surface-Displayed on Lactobacillus casei : 락토바실러스 표면에 발현된 PEDV와 TGEV 핵캡시드 단백질의 항원성

유리운 Graduate School Chungnam National University 2004 국내박사

돼지 코로나바이러스인 porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)와 transmmisible gastroenteritis virus(TGEV)는 특히 새끼돼지에 심각한 위장내 질병을 일으킨다. PEDV와 TGEV 감염여부를 확인할 수 있는 유일한 징후는 묽은 설사이다. 로타바이러스 감염과 함께 PED와 TGE는 돼지의 위장에 영향을 미치는 3대 바이러스성 질병으로 특히 이로 인해 새끼 돼지의 50-100%가 죽게 되며 돼지 산업의 경제적 손실을 말할 것도 없다. PEDV와 TGEV 감염에 대한 특이항체 진단시스템을 개발하기 위해 우리는 재조합된 각각의 핵캡시드(N) 단백질을 ELISA 항원으로 사용하였다. 먼저 우리는 PEDV와 TGEV의 N 유전자 발현벡터인 pQE30에 클로닝하여 대장균 XL1-Blue에서 융합 단백질을 발현시켰다. 이 발현방법은 PEDV와 TGEV의 N 부분(각각 48.62kDa, 42.13kDa)을 과량발현시켰다. 두번째로, 단백중합체의 카르복실말단에 6개의 히스티딘을 붙이고 니켈-나이트릴로트리아세트산 금속 친화성 크로마토그래피를 이용하여 PEDV와 TGEV의 재조합 N 단백질을 정제하였다. 세번째로, 정제된 N 단백질을 토끼에 주사하여 PEDV와 TGEV에 대한 복합항원 항체를 생산하고 ELISA를 이용하여 PEDV와 TGEV 감염여부를 진단하는데 사용하였다. PEDV-ELISA(0.18)과 TGEV-ELISA(0.144)에 대한 음성 컷오프값은 PEDV와 TGEV 음성혈청을 사용하여 결정하였고, 음성 컷오프값 이상의 흡광도를 가지는 임상샘플들을 양성, 음성 컷오프값 이내에 있는 것들은 음성으로 결정하였다. 결론적으로는 대장균에서 나온 재조합 N 단백질은 PEDV와 TGEV 감염의 빠르고 신뢰할만한 진단에 적합한 항원이다. 대부분 감염되는 바이러스성, 세균성 질병들은 병원균이 점막표면에 침투한다. 따라서 강력한 예장기능이 있는 점막 면역반응 유도백신 개발이 중요하다. 그러나 점막에서부터 혈류까지 병원균이 퍼진다면 강력한 조직 면역반응 또한 필요하다. 따라서 이상적인 백신은 점막표면에 국부적 면역반응을 일으키고 림프조직에서 백신특이적인 면역반응도 일으켜야 한다. 설사를 일으키는 바이러스의 경우 경구와 후두부로 백신을 접종하여 국부 및 전신 면역반응을 일으키는 것이 효율적이다. 점막에 침투하는 다양한 병원체를 경구투여하는 것이 국부 및 전신 면역반응을 유도하기에 효율적이나, 위장내부는 산성을 나타내며 분해효소들을 가지고 있어 면역반응을 높이려면 고농도로 주입하여야 한다. 반면 후두부 접종은 더 적은 양으로도 효율적인 면역반응이 가능하며 산성에 대한 문제도 피할 수 있다. 따라서 우리는 폴리감마 글루탐산 합성효소 복합체에서 표면발현 모티프인 pgsA를 도입하여 PEDV와 TGEV의 N 단백질을 락토바실러스 표면에 발현시켰다. 우리는 N 단백질 발현을 위해 셔틀벡터인 pHCE1LB를 제작하였다. pHCE1LB-pgsA-PEDN과 pHCE1LB-pgsA-TGEN로 락토바실러스를 형질 전환시키고 락토바실러스 표면에 N 단백질을 발현시켜서 전체 세포를 이용한 ELISA로 검출하였다. 또한 이 항원들이 세균표면에 발현될 때 더 좋은 면역원이 되는지 알아보기 위해 마우스와 돼지모델로 PEDV와 TGEV N 항원의 면역원성을 알아보았다. 재조합 PEDN이나 TN 락토바실러스를 주입한 마우스들은 면역글로블린 G 수치가 높았으며, 경구투여와 후두부 투여로 생긴 면역반응에 큰 차이는 없었다. 죽어있는 항원은 살아있는 항원보다 늦게 항체를 생성하였다. 임신한 암퇘지에 락토바실러스에서 만든 재조합 PEDN과 TN을 경구투여하였더니 면역글로블린 A 수치는 현저히 높았다. 재조합 락토바실러스를 주입한 암퇘지의 초유를 먹은 새끼돼지의 면역글로블린 G 수치는 약간 증가하였다. 그러나 락토바실러스에서 재조합한 PEDN을 접종한 새끼돼지의 면역글로블린 G 수치는 현저히 증가하였다. 따라서 pgsA 단백질은 외부항원을 면역계에 전달할 수 있으며 재조합된 락틱산 세균을 경구와 후두부로 투여하여 외부 항원에 대해 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한 이러한 종에서 발현된 N 항원의 면역원성은 백신개발에 중요한 사실을 나타낸다. Swine coronaviruses porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and transmissible gastroenteritis virus (TGEV) cause severe gastrointestinal diseases, especially in neonatal pigs. The only observable clinical signs of PED and TGE are watery diarrhea. Together with rotavirus infection, they form the three major viral diseases affecting to gastrointestinal tract in pigs, especially piglets resulting in 50-100% mortality, not to mention economic loss to the swine industry. To develop specific antibody detection systems for PEDV and TGEV infections, we adopted recombinant nucleocapsid (N) protein of each virus as the ELISA antigen. First, we cloned the N gene of PEDV and TGEV into expression vector pQE30 and expressed fusion proteins in Escherichia coli XL1-Blue. This expression method overproduced the N domains of PEDV and TGEV. Second, using the 6×histidine-tag at the carboxyl-terminal of polypeptides, the recombinant N protein of PEDV and TGEV (48kDa and 42kDa, respectively) was purified by nickel-nitrilotriacetic acid metal affinity chromatography. Third, purified N proteins were injected to rabbits to generate polyclonal antibodies against PEDV and TGEV. An Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on these purified recombinant N proteins was evaluated for diagnosis of PEDV and TGEV infections. The negative cut-off values for PEDV-ELISA (0.18) and TGEV-ELISA (0.144) were determined using PEDV and TGEV negative sera. Clinical samples with absorbance above the negative cut-off values were considered positive while those that were within the negative cut-off values were considered negative. In conclusion, our findings suggest E. coli-derived recombinant N proteins would be suitable diagnostic antigens for quick and reliable screening of PEDV and TGEV infections. Most infectious viral and bacterial diseases involve colonization or invasion of the mucosal surfaces by the pathogen. Hence it is important to develop vaccines that induce strong protective mucosal immune responses. However, if the organism is able to disseminate from the mucosa into the bloodstream, a strong systemic responses is also required to engender. Thus, an ideal vaccine should generate both local immune responses at mucosal surfaces and generalized vaccine-specific immunity in the systemic lymphoid organs. For diarrhea viruses, eliciting local and systemic immunity are effective via administration of vaccine through oral and intranasal routes. Oral immunization with viable organisms, which can colonize the mucosa, is effective in inducing local and systemic immune responses. However, because of the acidic pH and the presence of degradation enzymes in the gastrointestinal tract, high concentrations are often required to elicit high levels of immunity. On the other hand, intranasal immunization requires less immunogen for effective vaccination and avoids the problems of low pH. For this purpose, we also expressed the N proteins of PEDV and TGEV on the surface of Lactobacillus casei using the surface-display motif pgsA, which was adopted from the poly-γ-glutamic acid synthetase complex. We constructed a shuttle vector pHCE1LB for expression of N proteins. The clones of pHCE1LB: pgsA: PN and pHCE1LB pgsA: TN were transformed into Lactobacillus casei and expressed the N proteins on the surface of Lactobacillus casei detected by whole-cell ELISA. In order to determine whether an antigen is a better immunogen when exported to the bacterial surface, the immunogenicity of N antigens of PEDV and TGEV were studied through mouse and swine models. Mice immunized with recombinant PN or TN Lactobacillus casei developed high titers of IgG. There are no significant different in the immune response between oral and intranasal administration. The killed antigens produced antibodies later than that of the live antigens. Pregnant sows were orally administrated with recombinant PN or TN Lactobacillus casei, IgA titers were significantly high. However, IgG titers of the piglets sucking the colostrum secreted from sow previously inoculated recombinant Lactobacillus casei were slightly increased. However, piglets were inoculated PN recombinant Lactobacillus casei, their IgG titers increased significantly. In conclusion, the pgsA protein is capable of presenting foreign epitopes to the immune system and can induce a specific immune response against foreign epitopes via oral and intranasal administration of recombinant lactic acid bacteria. Also, the immunogenicity of N antigens expressed by such strain may present significant opportunities for vaccine development.

천연물 라이브러리로부터 탐색된 체불락산에 의한 콜라겐 유도성 관절염의 억제 : Suppression of collagen-induced arthritis by Chebulagic acid screened from a natural product library

李相翊 Graduate School Chungnam National University 2005 국내박사

Objective. As the activation of T cells is central to the development of autoimmune diseases, a natural product library was screened to identify compounds that suppress T cell activity. Chebulagic acid (CHE) from the immature seeds of Terminalia chebula was identified as a potent immune suppressant. The effectiveness of CHE against the onset and progression of collagen-induced arthritis (CIA) was examined in mice, and the mode of action of CHE was studied at the molecular and cellular levels. Methods. Arthritis was induced in DBA/1J mice by subcutaneous immunization with type Ⅱ collagen on days 0 and 21. CHE was administered intraperitoneally for 3 weeks, either prophylactically (before disease onset; 10 or 20 mg/kg) or therapeutically (after disease onset; 20 mg/kg). Clinical scores, serum antibody levels, and cytokines were measured, and flow cytometric analysis and real-time reverse transcription-polymerase chain reactions (RT-PCR) were performed to evaluate the knee joints of mice with CIA. The effects of CHE on the mRNA expression patterns in PMA/ionomycin-activated Jurkat cells and on the in vitro cytokine production in anti-CD3/anti-CD28-stimulated murine splenic CD4+ T cells were examined. Results. A microarray analysis and RT-PCR of PMA/ionomycin-activated Jurkat cells with CHE treatment showed that transforming growth factor-beta (TGF-β) plays an important role in CHE-mediated immune suppression. TGF-β production was also increased, while interleukin (IL)-10, IL-2, and IFNγ production was significantly diminished in anti-CD3/anti-CD28-stimulated murine splenic CD4+ T cells. In both prophylactic and therapeutic dosing models of CIA, all clinical scores, serum total and anti-collagen IgG, IL-10, and IL-6 levels were reduced, while serum TGF-β levels were elevated markedly. The number of granulocytes was reduced, but the proportion of CD4+CD25+ T cells was greater in the knee joints of CHE-treated CIA mice. Expression of Foxp3 and TGF-β mRNA was also augmented significantly in the knee joints of CHE-treated CIA mice in the therapeutic dosing model. Conclusion. CHE significantly suppressed the onset and progression of collagen-induced arthritis in mice, and the immune suppression via the induction of TGF-β and CD4+CD25+ T cells may represent a new strategy for the development of therapies for rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases. 실험 목적: T-세포의 활성화는 자가면역질환의 발생에 있어 대단히 중요한 요인으로 작용하므로, 본 연구에서는 한약재로 구성된 천연물 라이브러리로부터 T-세포 활성을 억제하는 물질을 탐색하였다. 탐색 결과 Terminalia chebula 의 미성숙과실(한약명: 서장청과)로부터 분리한 체불락산(CHE; chebulagic acid)에서 강력한 면역억제활성을 확인할 수 있었다. CHE의 유효성확인을 위해 생쥐의 자가면역질환 모델인 콜라겐-유도성 관절염(CIA; collagen-induced arthritis)의 발생과 진전에 미치는 효과를 실험하였으며, CHE의 작용기작에 대해서도 분자 및 세포 수준에서 연구하였다. 실험 방법: 관절염 유도를 위하여 DBA/1J 생쥐에 실험시작일과 21일에 제2형 콜라겐을 피하주사하였다. CHE는 3주간 복강주사를 통하여 투여되었으며, 각각 예방효과(관절염 발병전, 투여량: 10 또는 20 mg/kg)와 치료효과(관절염 발병후, 20 mg/kg)를 관찰하였다. 실험 생쥐의 발병된 관절염의 임상관찰지수, 생쥐 혈청내 항체 및 사이토카인(cytokines)이 측정되었으며, 유식세포분석법(flow cytometry) 및 실시간 역전사-중합효소연속반응(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)을 통하여 관절염 생쥐의 무릎관절을 세포 및 유전자 수준에서 평가하였다. CHE가 PMA/ionomycin에 의해 활성화된 Jurkat 세포주의 유전자 발현패턴에 미치는 영향을 마이크로어레이(microarray) 방법에 의하여 측정 및 분석하였으며, 시험관외에서 항-CD3/항-CD28 항체에 의하여 활성화된 생쥐 CD4+ T-세포의 사이토카인 생산에 CHE가 미치는 영향도 확인하였다. 실험 결과: 마이크로어레이 방법에 의한 분석 결과, 활성화된 Jurkat 세포주를 CHE로 처리시 TGF-β가 CHE에 의한 면역억제에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다. 항-CD3/항-CD28 항체에 의하여 활성화된 생쥐 CD4+ T-세포에서도 CHE 처리에 의하여 IL-10, IL-2, IFNγ 등이 상당한 수준으로 감소하였으며 반면에 TGF-β는 증가하는 양상을 나타내었다. 콜라겐-유도성 관절염 유발 동물의 예방적 또는 치료적 투여 모델에서, CHE는 관절염의 임상관찰지수, 혈청내 총 IgG 및 항-콜라겐 IgG의 양, 혈청내 IL-10과 IL-6 수준 등을 모두 감소시켰으나, 반면에 혈청내 TGF-β의 수준은 대단히 증가시켰다. CHE로 처리한 관절염 생쥐의 무릎관절의 분석 결과, 염증을 유발하는 과립세포(Granulocytes)의 숫자는 감소하였으나, CD4+CD25+ T-세포의 구성비는 대조군에 비하여 유의성있게 증가하였다. 그리고, 치료적 투여 모델에 있어서 CHE로 처리한 관절염 생쥐의 무릎관절에서는 Foxp3 및 TGF-β 유전자의 발현이 상당한 수준으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 결론: 본 실험결과 CHE는 생쥐의 콜라겐-유도성 관절염의 발생과 진전을 유의성있게 억제하였다. 이러한 TGF-β와 CD4+CD25+ T-세포의 유도를 통한 면역억제 방법은 류마티스 관절염 및 기타 난치성 면역질환의 치료에 있어 새로운 개발전략으로 자리잡을 수 있을 것으로 사료된다.

A MAXIMUM LIKELIHOOD ESTIMATION SCHEME FOR TOA AND ITS APPLICATION TO INDOOR POSITIONING USING WLAN

Vu, Kien Trung Graduate School Chungnam National University 2005 국내석사

A wireless local area network (LAN) is a flexible data communications system implemented as an extension to (or as an alternative for) a wired LAN. Using radio frequency (RF) technology, wireless LANs transmit and receive data over the air, minimizing the need for wired connections. Thus, wireless LANs combine data connectivity with user mobility. Wireless LANs have gained strong popularity in a number of vertical markets, including the health-care, retail, manufacturing, warehousing, and academia. These industries have profited from the productivity gains of using hand-held terminals and notebook computers to transmit real-time information to centralized hosts for processing. Today wireless LANs are becoming more widely recognized as a general-purpose connectivity alternative for a broad range of business customers. The existing geolocation systems such as the Global Positioning System (GPS) and wireless enhanced 911 service system (E-911) also address the issue of location finding, but these technologies are not designed for indoor applications, and they can not provide accurate location information in indoor environments. Several radio network-based systems, which accurately measure the Angle of Arrival (AOA) or the Time Difference of Arrival (TDOA) or Time of Arrival (TOA) of Radio Signal Strength (RSS) or Wireless Radio Transmissions have been developed and tested with good results. Time measurement systems depend on network overlays of additional radio transmissions, which require expensive atomic clocks and special location measurement hardware integrated into the cell site Base Stations. Due to high implementation costs, these solutions are limited to test implementations. Much of the TOA infrastructure must be built up-front in order to deliver location services to wireless subscribers. Wireless operators have been reluctant to implement such costly technology. This thesis is concerned with accurate location finding techniques and systems for applications in indoor environments, where the traditional geolocation systems (GPS and E-911) can not operate properly to provide accurate location estimation. In this thesis, we intend to conduct an in-depth study of the location finding techniques and systems, especially the Time of Arrival (TOA) estimation techniques, in order to provide a fundamental understanding of various issues related to indoor geolocation, and to provide a basic foundation for the design and performance evaluation of indoor geolocation systems.

Inhibitory constituents against NFAT transcription factor from medicinal plants : 의약식물로부터 NFAT transcription factor 억제 활성 물질

원, 디엔 닷 Graduate School Chungnam National University 2003 국내박사

뇨뇨통 (Liquidambar formosana), 까마귀밥여름나무 (Ribes fasciculatum)와 벌개미취 (Gymnaster koraiensis)에서 23 물질을 단리하였다. 물리화학의 적성질과 분광 데이터로 threo-1-(4-hydroxyphenyl)-2-[4-(E)-propenylphenoxy]-propan-1-ol (8), 5,4'-dihydroxy-7-methoxyflavone-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-O-β-D-glucopyranoside](15) 및 threo-10S-9(Z),16-heptadecadiene-4,6-diyne-2,3,8-triol (22)의 3종의 신물질을 발련하였다. 분리된 물질들을 NFAT transcription factor 억제 효과를 고사하였다. 뇨뇨통의 화합물 중에서 3α-acetoxy-25-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid (3)은 노픈 저해를 보였다. 벌개미취의 MeOH extract 및 CH_(2)Cl_(2) fraction는 노픈 저해 효과를 나타내었으며 종의 화합물을 분리하였다. Polyacetylenes 화합물 2(E),9(Z),16-heptadecatriene-4,6-diyne-8-ol (19), 2,3-epoxy-9(Z),16-heptadecadiene-4,6-diyne-8-ol (20), heptadeca-2(E),9(Z),16-triene-4,6-diyne-1,8-diol (21), threo-10(S)-9(Z),16-heptadecadiene-4,6-diyne-2,3,8-triol (22)은 각각 IC_(50) 값이 4.95, 1.44, 10.6, 7.24 μM 이었다. 뇨뇨통의 triterpenoids에 structure-activity relationship를 조사한 결과 C-25의 oxy methylene과 C-3 acetoxy group는 NFAT 억제 활성을 증강시켰다. 벌개미취에서 threo-configuration 화합물을 erythro-물질보다 높은 저해 활성을 나타내었다. Twenty-three compounds were isolated: four from Liquidambar formosana, eleven from Ribes fascicularum and eight from Gymnaster koraiensis. Their structures were elucidated by physico-chemical properties and spectral data, thereby three new compounds were identified to be threo-1-(4-hydroxyphenyl)-2-[4-(E)-propenylphenoxy]-propan-1-ol (8), 5,4'-dihydroxy-7-methoxyflavone-3-O-[α-L-rhamnospyranosyl(1→3)-O-α-L-rhamnospyranosyl(1→6)-O-β-D-glucopyranoside](15) and threo-10S-9(Z),16-heptadecadiene-4,6-diyne-2,3,8-triol (22). The compounds were estimated on inhibitory activity against NFAT transcription, thus the potent activity was found in 3α-acetoxy-25-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid (3) (IC_(50) = 4.63 ± 0.22 μM), 2(E),9(Z),16-heptadecatriene-4,6-diyne-8-ol (19) (IC_(50) = 4.95 ± 0.24), 2,3-epoxy-9(Z),16-heptadecadiene-4,6-diyne-8-ol (20) (IC_(50) = 1.44 ± 0.59), heptadeca-2(E),9(Z),16-triene-4,6-diyne-1,8-diol (21) (IC_(50) = 10.6 ± 0.46), three-10(S)-9(Z),16-heptadecadiene-4,6-diyne-2,3,8-triol (22) (IC_(50) = 7.24 ± 0.42). The structure-activity relationship was examined for the triterpenoids isolated from L. formosana, which indicated that the oxy methylene group at C-25 and the acetoxy group at C-3 increased NFAT trascription activity.

A Study on the Optical Properties of In(Ga)As and Ga(Al)N Quantum Structures : In(Ga)As와 Ga(Al)N 양자구조들의 광학적 특성 연구

이창명 Graduate School Chungnam National University 2004 국내박사

본 학위논문에서는 In(Ga)As 와 Ga(Al)N 양자구조들의 광학적 특성에 관한 연구를 수행하였다. 각각의 주제에 따른 주요 결과들을 요약하면 다음과 같다. (1) InGaAs/GaAs 양자점에서의 광학적 전이와 운반자의 완화 Heterogeneous droplet방법에 의해 성장된 InGaAs양자점에서 AlGaAs-cladding 층의 유무에 따른 운반자들의 동역학을 PL과 time-resolved PL의 측정을 통하여 연구하였다.. AlGaAs-cladding 층이 존재하는 경우에는 운반자들의 완화에 있어 Auger processes가 중요한 역할을 하는 반면에, AlGaAs-cladding 층이 존재하지 않는 경우에는 Auger processes 현상은 관찰 할 수 없었다. 높은 여기상태하에서 AlGaAs-cladding 층이 존재하는 경우에는 양자점의 첫번째 들뜬상태의 decay profile이 두개의 지수형태 즉 빠르게 decay 하다가 느리게 decay 하는 형태로 나타남을 확인할 수 있었다. 더욱이, GaAs 장벽은 양자점의 첫번째 들뜬상태의 빠른 decay time과 일치하는 느린 rise time을 가짐을 확인할 수 있었으며 이런 결과들은 GaAs-장벽과 InGaAs-양자점의 첫번째 여기상태 사이에서는 운반자들의 완화에 직접적으로 Auger processes 현상들이 나타남을 보여 준다. (2) InGaAs 양자점에서의 열처리효과 Droplet 방법으로 성장 된 GaAs 양자점에 대하여 열처리에 따른 광학적 특성들을 온도와 여기세기에 따른 PL을 통하여 조사하였다. 열처리 온도를 800℃까지 증가시킴에 따라 InGaAs-양자점의 PL peak 에너지가 높은 에너지쪽으로 122meV만큼 이동하였다. 특히 실험적 결과는 지수함수의 형태로 주어짐을 확인할 수 있었다. 또한 열처리의 효과로 들뜬 상태와 바닥상태간의 에너지 차와 PL peak의 반치폭이 감소하는 결과를 가져온다. 이런 결과들은 열처리에 따라 양자점과 GaAs- 장벽간의 접합부분에서 In-Ga atoms간의 상호 확산에 따른 양자점 조성비의 변화에 따른 결과이다. 그러므로, PL peak과 들뜬 상태와 바닥상태간의 에너지차를 열처리를 통하여 얼마든지 조절할 수 있다. (3) 단일 양자점에 대한 PL peak의 관찰 Droplet방법으로 성장 된 GaAs/AlGaAs양자점에 대하여 열처리에 따른 광학적 특성들을 온도와 여기세기에 따른 PL과 micro-PL을 통하여 조사하였다. 열처리에 따라 PL peak이 높은 에너지쪽으로 이동할 뿐만 아니라, PL 세기가 급격하게 증가함을 관찰할 수 있었다. 이런 효과들은 양자점의 결정성이 좋아짐과 아울러 양자점 크지의 감소, Ga-Al atoms간의 상호 확산에 따른 양자점 구성비의 변화에 따른 결과로 해석할 수 있다. 또한 micro-PL 측정을 통하여 단일 양자점에 대한 단일 PL peak을 얻을 수 있었다. 가장 낮은 레이저의 세기에 대해서, PL peak의 반치폭은 약 1.45, 1.65 meV만큼 작은 값을 얻을 수 있었다. 이런 값은 k_(B)T나 atom의 1-ML 변화량(~2meV)보다도 작은 수치로서 단일 양자점에 관한 peak이라 말할 수 있다. 높은 레이저 세기에 대해서는 양자점의 inhomogeneous broadening현상이 나타나며 일반적 PL 스펙트럼과 거의 같은 모양을 가짐을 확인할 수 있었다. 그러므로, 일반적 PL의 넓은 peak은 양자점 구조에서의 크기변동에 따른 결과라 말할 수 있다. (4)자연 성장된 InAs양자점에서 열적으로 여기된 운반자의 이동 및 bimodal 크기 분포 자연 성장된 InAs/GaAs 양자점에 대하여 온도와 여기세기에 따른 PL 특성을 조사하였다. 여기세기 의존성 PL 결과는 두개의 다른 양자점 분과에서 발광되는 두개의 바닥상태 peak을 보여준다. 두개의 다른 양자점 분과사이에서 운반자들의 열적 재분포 효과를 온도 의존성 PL peak 에너지, 반치폭등을 이용하여 조사하였다. 온도 증가에 따른 PL 세기의 감소는 서로 다른 activation 에너지로 인해 두 양자점 분과에서 서로 다르게 전개되며, 반치폭 역시 온도에 따라 이례적인 변화의 양상을 띤다. 실험적 결과를 토대로 양자점의 두 분과사이에서 운반자의 이동에 wetting 층이 중요하게 작용할 수 있음을 알 수 있었다. (5)AlGaN/GaN 이중접합구조에서 2DEG와 관련된 PL 변조도핑된 AlGaN/GaN 이중접합구조에서의 광학적 특성을 조사하였다. 2DEG와 관련된 PL peak은 GaN와 AlGaN bandgap 사이에서 관측할 수 있었으며 그의 물리적 특성을 살펴보았다. GaN위의 도핑하지 않은 AlGaN층의 두께가 20nm 인 경우, 2DEG PL peak은 강한 piezoelectric polarization때문에 높은 온도에서도 관측할 수 있었다. 온도가 증가함에 따라, 일반적으로 격자의 팽창에 의하여 낮은 에너지쪽으로 에너지가 이동하나, 2DEG경우는 온도가 증가할수록 2DEG의 밀도가 증가해서 상대적으로 낮은 에너지쪽으로 이동하는 양이 작다. 이는 이중접합영역에서 전도대의 구부러짐으로 인한 운반자들의 screening 효과에 기인한다. 한편, 온도가 80℃에서 180℃로 증가하면 2DEG의 반치폭이 급격히 증가함으로써 페르미영역이 넓어짐에 의하여 페르미 근처의 2DEG peak의 강화현상은 사라지게 된다. 이들의 결과들은 종합하면, AlGaN/GaN 이종접합구조에서도 페르미 영역에서의 강화현상이 일어날 수 있음을 보여준다. 한편, AlN buffer층을 이용하였을 경우 운반자들의 이동도가 77K에서 최고 3725㎠/V·s 의 값을 Hall 측정을 통하여 얻을 수 있었다. 또한 상온과 비교할 때 3배 이상의 이동도를 가짐으로 GaN와 AlGaN 접합부분에서 2DEG가 형성됨을 알 수 있다. 2DEG와 관련된 발광현상은 온도가 증가함에 따라 현저히 감소하다가 약 120K이상의 온도영역에서는 사라짐을 PL을 통하여 확인할 수 있었다.

Functional analysis of NtDSK1 encoding a novel dual-specificity protein kinase, and DNA Gyrase in tobacco : 담배, Nicotiana benthamiana에서 바이러스 유도적 유전자 발현억제 시스템을 이용한 DNA Gyrase 유전자의 기능분석

조혜선 Graduate School Chungnam National University 2004 국내박사

DNA Gyrase는 일시적으로 DNA 이중나선을 분할해 DNA의 위치적 전환을 촉매하는 기능으로 원핵생물의 DNA 복제와 전사에 매우 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 고등식물에서 DNA Gyrase가 세포 소기관인 엽록체와 미토콘드리아의 DNA 대사에 중요한 역할을 함을 증명하고자 한다. DNA Gyrase A와 B subunit을 암호화하는 담배 benthamiana의 Gyrase, NbGyrA와 NbGyrB를 바이러스 유도적 유전자 발현억제 시스템을 통해 유전자의 발현을 억제 시킨 결과 두가지 유전자 모두 잎의 엽록소가 감소하는 표현형을 나타냈다. 세포 수준에서의 고찰로 엽록체의 숫자는 크게 감소하고 모양도 심하게 변형된 반면 미토콘드리아 기관은 수적 감소는 직접적으로 확인할 수 없었지만 막의 기능은 심하게 손상 되었음을 알 수 있었다. 더구나, 이들 비정상적 소기관들은 퇴화되는 과정 중으로 소별됨을 알 수 있었다. NbGyrA와 NbGyrB 유전자의 발현은 대등하게 조절되며. 엽록체나 미토콘드리아 소기관의 분열이 일어나는 조건에 상응하게 자극 되어지는 발현 양상을 보였다. 형광단백질을 이용한 발현으로 DNA Gyrase A와 B 소단위 단백질 모두 엽록체와 미토콘드리아의 두곳의 세포 소기관에 이중 위치 함을 알 수 있었다. 결론적으로, flow cytometry 분석으로 유전자 발현이 억제된 식물체의 엽록체와 미토콘드리아의 DNA양이 대조구에 비해 증가하였고 이결과는 DNA Gyrase가 두 소기관의 유전체 복제와 분배에 관여 함을 보여 주었다. 본 연구의 결과로 DNA Gyrase가 세포 소기관인 엽록체나 미토콘드리아의 DNA 대사에 필수적인 기능을 수행함이 진핵생물 최초로 밝혀졌다.DNA Gyrase는 일시적으로 DNA 이중나선을 분할해 DNA의 위치적 전환을 촉매하는 기능으로 원핵생물의 DNA 복제와 전사에 매우 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 고등식물에서 DNA Gyrase가 세포 소기관인 엽록체와 미토콘드리아의 DNA 대사에 중요한 역할을 함을 증명하고자 한다. DNA Gyrase A와 B subunit을 암호화하는 담배 benthamiana의 Gyrase, NbGyrA와 NbGyrB를 바이러스 유도적 유전자 발현억제 시스템을 통해 유전자의 발현을 억제 시킨 결과 두가지 유전자 모두 잎의 엽록소가 감소하는 표현형을 나타냈다. 세포 수준에서의 고찰로 엽록체의 숫자는 크게 감소하고 모양도 심하게 변형된 반면 미토콘드리아 기관은 수적 감소는 직접적으로 확인할 수 없었지만 막의 기능은 심하게 손상 되었음을 알 수 있었다. 더구나, 이들 비정상적 소기관들은 퇴화되는 과정 중으로 소멸됨을 알 수 있었다. NbGyrA와 NbGyrB 유전자의 발현은 대등하게 조절되며. 엽록체나 미토콘드리아 소기관의 분열이 일어나는 조건에 상응하게 자극 되어지는 발현 양상을 보였다. 형광단백질을 이용한 발현으로 DNA Gyrase A와 B 소단위 단백질 모두 엽록체와 미토콘드리아의 두곳의 세포 소기관에 이중 위치 함을 알 수 있었다. 결론적으로, flow cytometry 분석으로 유전자 발현이 억제된 식물체의 엽록체와 미토콘드리아의 DNA양이 대조구에 비해 증가하였고 이결과는 DNA Gyrase가 두 소기관의 유전체 복제와 분배에 관여 함을 보여 주었다. 본 연구의 결과로 DNA Gyrase가 세포 소기관인 엽록체나 미토콘드리아의 DNA 대사에 필수적인 기능을 수행함이 진핵생물 최초로 밝혀졌다. DNA gyrase, which catalyzes DNA topological transformation by introducing a transient double strand break in DNA, plays an essential role in replication and transcription in prokaryotes. Here we demonstrate that DNA gyrase play an essential role in propagation of chloroplasts and mitochondria in higher plants. Virus-induced gene silencing of NbGyrA and NbGyrB, putatively encoding DNA gyrase subunit A and B, respectively, both resulted in leaf yellowing phenotypes in Nicotiana benthamiana. At the cellular level, the number of chloroplasts was greatly reduced and their morphology severely altered, while the number of mitochondria was only slightly reduced, but their membrane integrity significantly disrupted. Furthermore, many of chloroplasts and mitochondria appeared to be degenerating. Expression of NbGyrA and NbGyrB was coordinately regulated, and was stimulated under the conditions that require organelle division. DNA gyrase subunit A and B were dual targeted to chloroplasts and mitochondria. Finally, flow cytometry analysis revealed that the average DNA contents in the affected chloroplasts and mitochondria were significantly higher than that of control, demonstrating that DNA gyrase participate in genome replication and partitioning in both organelles. This is the first report demonstrating that DNA gyrase is essential in eukaryotic cells for organelle DNA metabolism.

Effects of Hovenia Species on Memory and Neurotransmitter Levels in Ethanol Treated Mice : 지구자 추출물이 에탄올 투여한 생쥐의 기억 및 뇌중신경전달물질에 미치는 영향

Pham, Hoai Long Graduate School Chungnam National University 2004 국내박사

지구자(Hovenia acerba, Hovenia dulcis)의 추출물이 에탄올을 투여한 생쥐의 기억 및 학습효과에 미치는 영향을 검토하였다. Hovenia acerba의 열매를 메탄올로(HV_(a))추출한 후 부탄올(HVB_(a)), 에틸아세테이트(HVE_(a)), 물(HVW_(a))로 각각 분획하였다. Hovenia dulcis의 목질부도 동일하게 추출하여 HV_(d), HVB_(d), HVE_(d), HVW_(d) 분획을 각각 조제하였다. 각각의 분획으로 에탄올 투여한 생쥐에 대하여 수동회피 실험을 수행한 결과 H. acerba의 부탄올과 에틸아세테이트 분획(HVE_(a), HAB_(a))이 유의한 기억력 증강작용을 나타내었다. 투여용량을 변화시켰을 때 HVB_(a)는 약 10 mg/kg에서, HVE_(a)는 약 5 mg/kg에서 높은 작용을 보였다. 생쥐의 기억력과 뇌중신경전달물질과의 상관관계를 보기 위하여 H. dulcis와 H. acerba의 부탄올 분획과 에틸아세테이트 분획을 생쥐에 투여한 후 뇌중 신경전달물질의 변화를 관찰하였다. 4가지의 분획(HVB_(a), HVE_(a), HVB_(d), HVE_(d))에 대하여 생쥐의 해마에서 choline이 유의적으로 감소하였으며, 유의성은 없지만 glutamic acid가 뇌의 전부분에서 증가하는 경향을 보였다. 그 외 도파민성 및 세로토닌성 신경전달 물질에 대해서는 유의한 패턴변화를 보이지 않았다. 각각의 분획에 대하여 라디칼 소거작용과 과산화지질 억제작용을 검토하였을 경우 친 H. acesba과 H. dulcis의 에틸아세테이트 분획과 부탄올 분획은 강한 작용을 나타내었다. 상기 결과를 종합하면 H. acesba의 에틸아세테이트 분획은 에탄올 투여한 생쥐에 대해 기억 및 학습능력을 증가시켰는데, 이 작용은 이들 분획이 뇌중 choline이나 glutamic acid의 농도를 변화시키거나, 분획 자체의 항산화 작용과 관련이 있는 것으로 추정된다. 본 논문에서 사용된 방법은 식물추출물이나 성분의 기억 및 학습능력개선 작용을 측정하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다. Effect of Hovenia extracts on memory enhancement and the neurotransmitter level in ethanol-treated mice as well as the effect of these extracts on anti-oxidant activity were studies. The Hovenia extracts were examined on the impairment of acquisition induced by the oral administration of 3 g/kg ethanol in step-through test. The level of neurotransmitter in three brain regions (frontal cortex, hippocampus and striatum) was also determined by HPLC with electrochemical detection. In respect of simplicity, efficiency and sensitivity, the method in this study was suitable for the detection of neurotransmitter level in mice brain regions. By employing these methods, the levels of catecholamine, serotonin, glutamic acid, γ-aminobutiric acid, choline and acetylcholine in mouse brain tissue samples were conveniently determined. To achieve experiment mentioned above, the methanol, ethyl acetate, butanol and water extracts of H. acerba and H. dulcis were produced. Among of these extracts, the ethyl acetate (HVE_(a)) and butanol (HVB_(a)) extracts of H. acerba improved the latency of acquisition in ethanol-treated mice, suggesting that the memory enhancement of these extracts could be related to the modulation of neurotransmitters in mouse brain. In addition, the activity of Hovenia extracts on the modulation of neurotransmitters was further studies. From this study, significant changes of choline, serotonin, noradnenalin, and homovanillic acid were observed in hippocampus region by the treatment of ethyl acetate extract off H. dulcis and butanol, ethyl acetate extracts of H. acerba. On the other hand, the effects of Hovenia extracts on the anti-oxidative activity were measured, and H. dulcis showed the potent activities on DPPH scavenging and inhibition of lipid peroxidation. Based on these result and the knowledge acquired from the investigation suggested that the ethyl acetate extract of H. acerba could be used as a memory enhancing substance with the mechanism of neurotransmitter modulation and anti-oxidative effects.

Fine Mapping of QTLs for Agronomic Traits Using Near Isogenic Lines from a Cross between Oryza sativa and O. rufipogon : Oryza x O. rufipogon 교잡 NIL 계통 이용 농업적 형질 관련 QTLs의 고밀도지도 작성

송미희 Graduate School Chungnam National University 2006 국내박사

화성벼를 반복친, O. rufipogon (IRGC 105491)을 수여친으로 BC_(3)F_(1) 개체를 육성하였다. 육성된 개체들은 반복친인 화성벼와 임실율, 수수등에서 현저한 차이를 보였다. 이들 BC_(3)F_(1) 개체들에 이입된 O. rufipogon 의 염색체 단편을 검정하기 위해 SSR 분석을 실시하였다. 벼염색체에 고르게 분포한 308개 SSR 마커 검정을 실시한 결과, 총 223개의 마커 (75.6%)가 양친간의 차이를 보였으며, 그 중 113개의 마커가 분석에 사용하였다. 이들 BC_(3)F_(1) 개체 중 형태적으로 차이가 있고 염색체 4번, 5번, 및 8번에 4개의 이입 단편을 가진 BC_(1)F_(1) 한 개체를 선정, 이를 자식시켜 총 50개의 BC_(3)F_(3) 집단을 육성하였다. 육성된 50 계통의 BC_(3)F_(3) 집단은 임실률 및 수수에서 반복친인 화성과는 다른 특성으로 보였다. QTL 분석결과, 염색체 4번에서 수수와 관련된 QTL 만이 탐색되었는데, 이는 분석에 사용된 계통 수가 작기 때문이라 사료된다. 정확한 QTL 분석과 BC_(3)F_(3) 집단에서 탐지되지 않은 임실율 등에 관여하 QTLs 를 탐지하기 위해 총 200개 BC_(3)F_(4) 계통의 특성 평가를 실시하였다. QTL 분석결과, 임실률, 수당립수 및 수수와 관련된 3개의 QTL 탐지되었으며, 이들 QTLs 는 염색체 4번의 long arm 지역에 밀집되어 존재하였다. 이들 중 임실율에 관하여하는 QTL 은 전체 표현형 변이의 21.5%를 설명하는 QTL 로써, S-30(t)로 명명하였다. 수당립수에 관여하는 QTL은 표현형 변이 값이 전체 변이값의 31.4%로써, spp4로 명명하였다. 마지막으로 수수에 관여하는 QTL는 pn4로 명명하였으며, 전체 표현형 변이값의 20.4%를 설명하였다. S-30(t) 와 spp4 의 유전자좌에서는 O. ruripogon의 대립유전자가 임실률과 수당립수를 감소시키는 방향으로 작용하였고, pn4 유전자좌는 O.rufipogon의 대립유전자가 수수값를 증가시키는 방향으로 작용하였다. QTLs의 위치를 정확히 알아보기 위해, substiution mapping을 실시하였다. 이를 위해 200개의 BC3F4 계통을 RM3474와RM6540 지역 내에서 조환으로 인해 발생된 계통들의 유전자형에 근거하여 총 6개의 군으로 분류하였다. 각 군에 속한 계통들의 임실률과 수당립수 평균치를 Ducan의 다중비교를 이용하여 비교하였다. 분석 결과 S-30과 spp4는 RM6540와RM7051 사이에 위치하였으며, 두 마커 사이 거리는 약 673kb 였다. S-30과 spp4 가 밀집되어 있는 현상은 한 유전자의 다면발현이나 밀접히 연관된 유전자들에 의한 결과로 설명될 수 있으나, 정확한 원인을 규명하기 위해서는 두 마커 사이에 추가적인 마커 개발과 많은 수의 후대를 이용한 분석이 필요하다 현재 임실률, 수당립수 및 수수와 관련된 QTLs 을 포함한 NILs 을 육성하고 있으며, 차후 여러 번의 여고잡 및 MAS 를 통하여 목표유전자를 포함한 최소한의 O.rufigpogon의 단편이 삽입된 NILs 을 선발할 예정이다. 또한 선발되어진 NIL 은 불임성과 관련된 유전적 메카니즘을 연구하거나 임실률, 수당립수 및 수수 와 관련된 유전자 cloning에 좋은 재료가 될 것이라 사료된다. The BC_(3)F_(1) Plants were developed from a cross between Hwaseongbyeo as a recurrent parent and O.rufipogon (IRGC 105491) as a dornar Parent. A total of 308 microsatellite markers of known chromosmal position were used for the parental survey. of the 308 markers, 223 (75.6%) showed polymorphisms and 113 SSR markers were used to detect introgressed segments in the BC_(3)F_(1) plants, one selected plant designed as CR 105 had four introgressed segments on chromosomes 4, 5, 7, and 8, respectively, and showed differences compared to Hwaseongbyeo in fertility and pancle number. CR105 was selfed two times to generate 50 BC_(3)F_(3) families, which were phenotyped and genotyped with SSR makrkers located on the introgressed segments. One QTL for panicle number, pn4 was detected in BC_(3)F_(3) families. To detected additional QTL not deteeted in BC_(3)F_(3) 200 BC_(3)F_(4) families were developed from selected 20 BC_(3)F_(3) families and were genotyped using SSR marker. QTL analysis was carried out to determine the relationship between marker genotype and trais evaluated. A total of three putative QTLs for fertility (S-30(t)), spikelets per panicle (spp4) and panicle number (pn4) were indentified on the long arm of chromosome 4. These QTLs explained 21.5, 31.4 and 20.4% of the total phenotypic variation, respectively. The O. rufipogon alleles decreased fertiliy and spikelets per panicle, while it increased panicle number. Substitution mapping with six groups at the 200 BC_(3)F_(4), the S-30(t) and spp4 were further narrowed down at the interval RM6540-RM7051. The candidate position for S-30(t) and spp4 is about 673kb based on the sequence information of Nipponbare BAC library. SSR marker tightly linked to the traits would facilitate marker-assisted selection in breeding program. Repeated backcrossing with MAS will be conducted to purify the NILs. The NILs would provide the basis for additional fine mapping aimed at cloning the S-30(t).