The study of iron effect on cellular oxidative stress in rat glial cells : 쥐 신경 교세포의 산화 스트레스에 미치는 철분의 효과에 대한 연구

Kim, Jinsun Graduate School Sookmyung Women’s University 일반대학원 2005 국내박사

철분은 세포의 정상적인 기능을 위해 필수적인 전이 금속이지만, 과잉의 철분은 Fenton’s reaction을 통해 활성산소를 생성하므로, 철분의 항성성은 엄격히 조절되어야 한다. 따라서, 철분에 대한 항상성이 변할 때, 세포 내 어떤 기능 변화가 발생하는지 확인하기 위하여 쥐에 철을 주입하여 철분 과잉 상태를 유도한 후, 뇌와 간을 적출하여 실험을 진행하였다. In vivo 상태의 철분 과잉은 활성 산소를 증가시킨다. 또한, 철 저장 단백질인 ferritin의 thiol oxidation과 단백질 산화가 증가하는 것을 통해 ferritin 자체에 손상이 일어남을 확인하였다. 게다가, Ferritin이 철분을 저장하기 위해 필요한 ferroxidase의 활성도 감소하며, 저장기능도 현저히 감소함을 관찰하였다. 즉, 과잉의 철분은 ferritin의 기능 이상을 초래하고, 이로 인해 철분의 항상성이 유지되지 못함을 확인하였다. Ferritin의 기능 이상으로 증가된 반응성이 높은 철분들은 세포 내 주요 소기관인 미토콘드리아에도 손상을 초래하였다. 단백질 산화 및 지질 과산화가 증가할 뿐 아니라, 항산화의 역할을 하는 GSH, NAD(P)H가 산화되어, 정상적인 기능을 수행하지 못함을 관찰하였다. 이러한 구조적 손상은 호흡율, 막전위와 같은 미토콘드리아의 기능에도 영향을 주어, ATP 합성에 장애가 초래되었다. In vivo 실험을 통해, 철분 항상성에 이상이 초래된 경우, ferritin은 철분을 효율적으로 저장 및 무독성화 시키지 못하며, 이로 인해 증가된 불안정하고 반응성이 높은 철분은 미토콘드리아의 고유한 기능을 저하시킴을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 볼 때, 철분 과잉의 상태에서, ferritin은 철분 저장소가 아닌, 철분 제공자로서의 기능을 하는 것으로 보인다. 이를 확인하기 위해, ferritin을 구성하는 성분 중 하나로 ferroxidase 활성을 갖는 H-subunit의 단백질 발현을 조절하여, ferritin이 세포 내 산화적 스트레스 및 미토콘드리아의 기능에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. H ferritin의 발현을 억제한 경우, 세포 내 철분, 특히 반응성이 높은 철분의 농도가 현저히 증가하였다. 이로 인해, GSH, NAD(P)H와 같은 항산화제의 산화가 증가되었을 뿐 아니라, 단백질 산화 및 지질 과산화와 같은 세포 내 주요 성분의 산화 또한 증가하였다. H ferritin 발현을 억제했을 때, 세포 수준에서 뿐만 아니라, 미토콘드리아에 많은 손상이 초래되었다. 또한, in vivo 실험에서와 유사하게, 미토콘드리아 내의 철분 농도, 칼슘 농도가 증가하였으며, Fenton’s reaction에 의한 활성산소의 발생도 크게 증가하였다. 이와 같은 산화적 스트레스에 의해 미토콘드리아 내의 중요한 항산화제인 GSH와 NAD(P)H가 크게 감소하였고, 막전위와 같은 중요한 기능이 유지되지 못하였다. H ferritin을 과잉 발현시켰을 경우에는 이와 반대의 결과를 얻었다. 즉, H ferritin이 과잉 발현된 세포의 경우는, 철분 과잉으로 인해 야기된 손상들이 대조군에서 관찰되는 수준으로 회복되었다. 즉, ferritin의 기능 이상은 세포 내 철분의 농도를 증가시켰으며, 이로 인해 야기된 미토콘드리아의 기능 이상은 세포 내 산화적 스트레스를 악화시킨다는 것을 확인하였다. 철분에 의해 유도된 세포 내 산화적 스트레스는 미토콘드리아의 기능 이상과 함께, 세포의 생존능력을 감소시켰다. H ferritin 발현이 억제된 세포의 경우, 외부에서 첨가된 산화적 스트레스에 대한 저항성이 상당히 낮아졌으며, 과잉의 철분에 의해 apoptosis가 유도됨을 관찰하였다. 철분이 과잉 처리된 쥐의 신경교세포의 경우, p38 MAPK가 활성화되어, 이로 인해 미토콘드리아로부터 cytochrome c가 방출되어 apoptosis가 진행되었다. 결과적으로 세포 내 존재하는 과잉의 철분은 ferritin의 기능을 저해시키며, 이는 미토콘드리아의 기능 저해를 초래한다. 미토콘드리아의 기능 저해는 세포 내 산화적 스트레스를 악화시키며, 이로 인해 세포의 생존율이 저하하고, apoptosis를 일으킨다. It has been reported that iron accumulation was observed in several diseases such as hemochromatosis, frataxia, thalassemia, and some neurological disorders. Even though iron is the essential transition metal for maintaining cellular function, its overload causes the increase of reactive oxygen species (ROS) via Fenton chemistry. To study the effect of iron overload to cellular oxidative stress, we used rats to induce iron overload by injection iron and experimented with the brain and liver. Under in vivo iron overload, it was observed that ROS was increased and ferritin, iron storage protein, itself damaged by iron-induced oxidative stress when measured by protein and thiol oxidation. Furthermore, ferroxidase activity that is required for iron uptake of ferritin was inhibited and ferritin released easily and rapidly iron under iron overload condition compared with control. It was cleared that cellular free reactive iron termed labile iron pool (LIP) and ROS were increased in this condition. It was observed that, besides ferritin, mitochondria damaged by iron overload. LIP and ROS levels in mitochondria were increased in brain and liver under iron overload condition. Oxidative damage in mitochondria such as protein and lipid oxidation was increased but antioxidant system such as GSH, NAD(P)H, and thiol was decreased in iron overload tissues. Respiratory control ratio (RCR) and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) were decreased, whereas mitochondrial permeability transition (MPT) was increased. According to results above, ferritin could not function as an iron storage protein and mitochondria did not maintain its unique properties in iron overload condition. We hypothesized the ferritin turned iron storage protein to LIP source under iron overload condition, so it played a role in exacerbating of intracellular oxidative stress. To test this hypothesis, we prepared H ferritin knockdown and overexpressed glial cells. In H ferritin knockdown cells, cellular iron, especially LIP was increased dramatically. This LIP aggravated cellular oxidative stress via oxidation of cellular protective systems such as GSH and NAD(P)H via Fenton reaction. LIP itself and LIP-induced oxidative stress altered mitochondrial function such as RCR, membrane potential, ATP synthesis as much as accumulation of LIP and Ca^(2+). H ferritin overexpression showed the opposite effect to the results that were observed in H ferritin knockdown cells. Namely, it maintained mitochondrial function by sequestration of increased LIP. Consequently, uncontrolled iron overload due to ferritin dysfunction might be the important factor to induce and deteriorate cellular oxidative stress. It was shown that increased LIP in cytosol and mitochondria by disruption of H ferritin influenced on cell viability. In addition to the raise of mitochondrial dysfunction, it caused the activated specific apoptotic pathway via mitochondria.

The specific interaction of AIRP and Athb-12, an ABA-inducible homeodomain protein from Arabidopsis thaliana

Ji, Yeon Suh Graduate School Sookmyung Women's University 일반대학원 2004 국내석사

ABA라는 식물 호르몬은 salt stress에 의한 식물의 반응에 관여를 하다. ABA에 의해 발현이 유도되는 Athb-12 gene은 transcription factor 이면서 homeodomain leucine-zipper family의 한 구성원이다. Athb-12는 Arabidopsis의 salt tolerance에 관여할 것이라는 연구보고들이 발표되었다. 본 연구에서는 Athb-12 interacting RING-finger protein (AIRP)이 소개된다 . RING-finger protein은 단백질 가수 분해 경로 통해 제거될 수 있도록 특정 기질에 ubiquitin을 전달하는 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이미 Athb-12를 bait로 yeast two-hybrid를 통해 분리가 되어있기 때문에 같은 yeast two-hybrid system으로 특정한 interaction이 확인되었다. 다음으로 Athb-12 와 AIRP의 발현양상이 비교되었다. RT-PCR로 ABA에 의한 유도 발현이 시간별로 이루어졌는데 AIRP gene 이 Athb-12 gene보다 약간 늦게 유도되는 것이 밝혀졌다. 다른 조직에서와 다른 발생단계에서 발현양상 비교해본 결과 발현양상이 비슷하다라는 것이 보여졌다. In vitro에서는 Athb-12와 AIRP의 상호작용이 보여지지 않았다. 다음으로는 in vivo 상호작용을 보이기 위해 N. benthamiana가 식물 system 으로 쓰였다. In vivo 실험 결과는 Athb-12와 AIRP가 상호작용할 것이라는 가능성을 보였다. Athb-12 단백질의 network system에 관해서 더 밝히기 위하여 Athb-12를 Arabidopsis에 형질전환시기도 하였다. 전체적으로 봤을때 AIRP가 ABA로 유도발현된 Athb-12를 단백질 가수 분해 경로 통해 제거한다는 사실을 암시한다. ABA is involved in the response of plants to salt stress. An ABA-inducible Athb-12 gene is a member of homeodomain leucine-zipper family. There are several evidence to suggest that Athb-12 plays a role in salt tolerance in Arabidopsis. Previously an interacting protein with Athb-12 was isolated and named Athb-12 interacting RING-finger protein (AIRP) as it contains the RING finger motif. RING-finger protein are known to play critical roles in mediating the transfer of ubiquitin to its substrate to eliminate proteins through ubiquitin-dependent proteolysis pathway. Since it was already isolated from a yeast two-hybrid screening with Athb-12 as bait, the specific interaction was further confirmed with yeast two-hybrid system. Then expression patterns of Athb-12 and AIRP were compared. RT-PCR of ABA induction in time courses revealed that the AIRP gene is induced a little later than Athb-12. RT-PCR in different tissues and developmental stages showed that both have similar expression patterns. In vitro binding experiment did not prove their interaction. Then the Nicotiana benthamiana plant system was used for in vivo binding assay. The results showed a possibility that Athb-12 and AIRP interact. To reveal more about Athb-12 protein network system we transformed Athb-12 into Arabidopsis to do Tandem affinity purification. Given together, it is suggested that AIRP may play a role in Athb-12 degradation after ABA induction.

The roles of ATHB12 and ATHB53, phytohormone-regulated homeodomain-leucine zipper proteins in Arabidopsis development

Son, Ora Graduate School Sookmyung Women's University 일반대학원 2005 국내박사

homeobox는 생물체의 발달 과정에 관련된 많은 유전자들에 존재하는 180 bp consensus DNA 서열이다. homeobox 는 60개 아미노산 모티프를 암호화하고, 이 단백질은 특이적인 DNA결합 구조로 접혀진다. 식물의 homeobox들은 비교적 최근에 발견되었는데, homeodomain내의 서열 유사성과 부가된 서열의 존재에 따라 각각 다른 family들로 분류될 수 있고, 그 family 내에서도 또한 여러 class들로 분류될 수 있다. 예를 들어 KN1 family는 class I 과 class II 유전자들로 분류되고, HD-Zip family는 네 개의 class들로 분류될 수 있음이 밝혀졌다. HD-Zip 유전자들은 지금까지 식물에서만 발견되었다. 식물에서HD-Zip 유전자들의 기능은 다양한 실험들로 밝혀져 왔다. 식물 호르몬 생합성 및 신호전달 기작에 관련된 유전자 수준의 연구는 호르몬이 식물 생장과 발달을 조절하는 아주 중요한 조절인자임을 알 수 있게 하는 많은 기회들을 제공해왔다. 지금까지 많은 식물 homeobox 유전자들이 식물 호르몬 신호전달 및 생합성 기작에 관여하고 있음이 밝혀졌다. 나의 연구의 목적은 호르몬에 의해 조절되는 HD-Zip family class I 멤버 ATHB12과 ATHB53 이 식물 발달 과정에서의 어떤 역할을 하는지 이해하는 것이었다. ABA및 가뭄과 염분 스트레스에 의한 발현 유도와 관련된 ATHB12유전자의 cis-acting elements를 찾기 위해 PATHB12;;GUS 재조합 DNA를 도입한 형질전환 담배 식물체를 가지고 fluorometric assay 실험이 이루어졌다. ABA-insensitive mutants인 abi1과 abi2 에서 줄어든 ATHB12 유전자의 발현이 quantitative real time RT-PCR를 통해 밝혀졌으며, 이것은 ATHB12 유전자의 발현이 ABA 신호전달 기작에서 ABI1 과 ABI2에 의해 조절되고 있다는 것을 의미한다. ATHB12 유전자에 T-DNA가 삽입된 돌연변이체가 선발되었는데, 이 돌연변이체는 야생형에 비해influorescence stem이 더 긴 특징이 관찰되었다. ABA를 포함한 배지에서 자란 이 athb12돌연변이체는 야생형 식물체보다 더 높은 발아율과 가뭄저항 능력의 저하를 보여주었다. athb12 돌연변이체의 줄기에서는 GA 생합성 관련 효소 GA4과 GA5을 암호화하는 유전자들의 높은 발현과, GA 분해 효소 GA2-oxidase를 암호화하는 유전자들의 줄어든 발현이 보였다. 이 현상은 ATHB12 가 GA 생합성을 조절함으로서 줄기의 길이 생장을 negatively 하게 조절할 가능성이 있다는 것을 의미한다. 이 가능성을 조사하기 위해 athb12 돌연변이식물의 줄기에서 활성을 가진 GA의 양을 측정하는 것이 필요하다. 이것이 증명된다면 ATHB12는 ABA에 의해 발현이 증가되는 유전자로서, GA 생합성량을 조절하여 줄기의 길이 생장을 조절하는 최초의 예가 될 것이다. 식물호르몬에 의해서 조절되는 또다른 homeobox 유전자들을 연구하기 위해, homeobox 유전자로 예측되는 8개의 ORFs를 바탕으로 primers를 제작하여 식물에 오옥신/사이토키닌 처리 후 RT-PCR 하였다. 그것들 중 하나인 ATHB53 유전자는 오옥신에 의해 발현이 유도되며, 사이토키닌에 의해 다시 그 발현이 줄어드는 패턴을 보여주었다. ATHB53의 전체 cDNA가 분리되었고, HD-Zip family에 속하는 단백질을 암호화 하는 것이 확인되었다. Whole-mount in situ hybridization 과 RT-PCR은 ATHB53 가 뿌리 정단분열조직에서 발현되는 것을 보여주었고, 오옥신에 의해 그 발현이 증가되고 있음이 확인되었다. 이 결과들은 Promoter-reporter를 도입한 Arabidopsis 형질전환체의 GUS histochemical assays를 통해서 확인되었다. 더욱이 ATHB53는 주근의 pericycle 층 조직에서 발생하기 시작하는 측근의 primordium과 root-hypocotyl junction에서 특히 강하게 발현되고 있음을 알 수 있었다. ATHB53 T-DNA knock-out 돌연변이체는 야생형 보다 그 뿌리 길이가 다소 짧은 특징을 보였다. 요약하자면, 본 실험 데이터들은 오옥신/사이토키닌에 의해 발현이 조절되는 ATHB53이 뿌리생장에서 그 역할을 할 가능성을 보여준다. 생리적 및 분자생물학적 차원 에서의 ATHB53의 기능은 ATHB53 과발현체를 포함한 다양한 형질전환체를 이용한 실험을 통하여 밝혀질 수 있을 것이며, 이 연구는 뿌리 발달에서의 오옥신과 사이토키닌 사이의 상호작용에 대한 통찰을 제시할 수 있을 것이다. 결론적으로 HD-Zip 단백질인 ATHB12는 ABA 의존적인 GA 합성 및 분해 기작의 조절자로서 기능하여, influorescence stem의 길이생장을 조절할 가능성이 있다. ATHB53는 오옥신/사이토키닌에 의해 전사수준에서 조절됨으로서 뿌리발달과정 동안에 중요한 조절자로서 기능할 수 있는 단서들이 제시된다. 이 두 유전자들의 기능적 분석은 주로 T-DNA 삽입 돌연변이체의 표현형 분석을 통해 이루어졌다. 이 조절자들의 기능을 완전히 규명하기 위해 여러 가지 다양한 형질전환체를 통한 실험들이 보완되어야 할 것이다.