Study on the establishment and characterization of a novel CD56dimCD62L+ natural killer cell line with distinct immunostimulatory potential derived from extra-nodal NK/T lymphoma

양현걸 포항공과대학교 일반대학원 (융합생명공학부) 2019 국내박사

자연살해세포는 직접적인 세포 독성과 면역 조절 잠재력을 가진 선천성 림프구이다. 이렇게 특화된 기능들과 몸을 지키는 역할 때문에 자연살해세포에 대한 연구와 활용법에 대한 관심이 커져 왔다. 하지만 높아진 관심에도 불구하고, 자연상태의 자연살해세포들의 특징들, 이를 테면 혈액 속에 적게 존재하고, ex vivo 증식이 제한적이며, 순수한 세포들을 분리하기 위한 기술적 한계 등으로 인해 보다 심도 깊은 연구가 어려웠다. 따라서 영구적인 자연살해세포주를 만드는 것은 이러한 한계들을 극복할 수 있는 해결책이 될 수 있다. 순수한 자연살해세포들을 무한정 공급이 가능하며, 사용하기 쉬울 뿐 아니라, 윤리적 문제에서도 자유롭기 때문에 과학적인 연구뿐 아니라 바이오의학 분야에 있어서도 귀중한 도구로 사용될 수 있다. 연구의 첫번째 파트에서는 새롭게 구축된 자연살해세포주인 NK101을 형태학, 면역표현형, 세포독성, 사이토카인/키모카인 분비의 관점에서 종합적으로 분석하였다. 기본적으로 NK101의 경우 자연적인 자연살해세포와 유사하게 대형과립림프구 세포의 형태와 전형적인 표면 마커 프로필을 보일 뿐 아니라, 독성 과립의 내재 및 자가 변형/손실에 대한 인식 능력과 같은 다른 주요 특징들 역시 가지고 있었다. 흥미롭게도 NK101은 특이적인 CD56dimCD62L+ 표현형을 가지고 있었는데, 이는 자연살해세포의 분화 과정 중, 중간 단계에 해당하는 소그룹의 특징들로 알려져 왔다. 실제로 NK101의 경우 앞서 확인한 면역 표현형뿐만 아니라, 기능적인 부분 역시 CD56dimCD62L+자연살해세포 소그룹을 대표하는 다중 기능 작용기 특성과 유사한 것을 확인되었다. 다시 말해 NK101은 사이토카인 자극에 의해 향상된 분열능력 및 인터페론 감마 분비 촉진을 보일 뿐만 아니라, 암세포를 직접적으로 인지하고 죽일 수 있는 다중 기능 작용기를 가지고 있음을 확인하였다. 이러한 결과들은 NK101이 앞서 언급한 자연적인 자연살해세포들의 여러 한계로 인해 거의 연구되지 못했던 희귀한 다중 기능 자연살해세포 소그룹을 연구하는데 있어 유용한 모델로 쓰일 수 있음을 보여주고 있다. 연구의 두번째 파트에서는 NK101이 종양치료를 위한 세포치료제 플랫폼으로 가능성이 있는지를 연구하였다. 현재까지 임상시험에 들어간 자연살해세포주의 경우 NK-92가 유일하기 때문에, NK101을 세포독성, 사이토카인 분비 특성, 유전자 발현 프로필, 생산성 측면에서 NK-92와 직접적으로 비교하였다. NK101의 경우 NK-92와 비교하여 낮은 세포독성을 보였는데, 이는 상대적으로 낮은 perforin과 granzyme B의 발현 때문으로 보인다. 대신 NK101에서 인터페론 감마 및 TNF-α와 같은 면역 반응을 촉진하는 사이토카인들이 NK-92에 비해 높게 발현되는 것을 확인하였다. 반면, IL-1ra나 IL-10과 같이 면역 반응을 억제하는 사이토카인들의 경우 NK101에서는 거의 발현되지 않는 반면 NK-92에서 매우 높게 발현되었다. 유사한 맥락으로 백혈구의 증식을 긍정적으로 조절하는 유전자들이 NK101에서 높게 발현되는 반면, 반대의 역할, 즉 백혈구의 증식을 억제하는 유전자들의 경우 NK-92에서 높게 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 기능성/발현양상의 차이는 면역력이 보존된 4T1 종양 모델에서 잘 나타났다. NK101의 경우 강한 종양-특이적 면역 반응과 함께 NK-92보다 강한 항암 효과를 보였다. 이뿐 아니라 생산성 측면에서 NK-92와 비교해, NK101은 해동 이후 회복이 훨씬 빠를 뿐 아니라, 20일 배양 기준 200배가 넘는 성장 프로필을 보여주었다. 종합적으로, 본 연구는 NK101이라는 새로운 자연살해세포주가 희귀한 CD56dimCD62L+ 소그룹으로서 가지는 차별화된 특징들을 강조할 뿐만 아니라, 이들이 면역항암요법의 새로운 세포치료제로써 가능성이 있음을 시사한다. Natural killer (NK) cells are innate lymphocytes endowed with direct cytotoxicity and immunomodulatory potential. Specialized functions and roles for the host defense gives rise to attention for NK cell study and its applications. However, despite elevated interest in understanding NK cells, characteristics of primary NK cells such as scarcity in blood, limited ex vivo life span, and the technical challenges in isolating pure population constrain further extensive study. Thus, establishing permanent NK cell line could become a solution overcoming those limitations. It is limitless in supply, easy-to-use, no ethical concerns, and homogeneous population, being an invaluable tool not only in scientific research, but also in the field of biomedicine. In the first part of the study, a newly established NK cell line, NK101, was comprehensively characterized with regard to morphology, immunophenotype, cytotoxicity, and cytokines/chemokines secretion. Basically, NK101 resembled major features of natural NK cells including large-granular-lymphocyte morphology, typical surface marker profile, inclusion of cytolytic granules, and capacity of ‘missing-self’ recognition. Interestingly, NK101 had a unique CD56dimCD62L+ phenotype, which has been known as a feature of NK subset in the intermediate stage of differentiation. In agreement with the immunophenotypes, NK101 was verified to have polyfunctional effector properties that are representative of CD56dimCD62L+ NK subset. It displayed enhanced proliferation and interferon-γ secretion upon cytokine stimulation as well as direct cytotoxicity against cancer cells. These findings suggest that NK101 provides a valuable model for studying a unique polyfunctional NK cell subset, which has been little studied due to several limitations of primary NK cells. In the second part of the study, I assessed a potential of NK101 as a cellular platform for cancer treatment. Since NK-92 is only available NK cell line entering clinical trials, NK101 was compared with NK-92 in terms of cytotoxicity, cytokine signature, gene expression profile and manufacturing potential. NK101 expressed lower levels of perforin and granzyme B that correlated with weaker cytotoxicity than NK-92, but produced higher levels of pro-inflammatory cytokines including IFN-γ and TNF-α. On the other hand, anti-inflammatory cytokines such as IL-1 receptor antagonist and IL-10 were highly produced by NK-92, which were nearly undetectable in NK101. Similarly, genes linked to the positive regulation of leukocyte proliferation were enriched in NK101, while those associated with opposite function were highly upregulated in NK-92. Such functional and expressional disparities were well-represented in immunocompetent 4T1 tumor model where NK101 showed more potent anti-tumor effects than those of NK-92, accompanied with stronger tumor-specific immune responses. Regarding manufacturing potential, NK101 not only recovered rapidly after thawing, but also exhibited faster growth profile than NK-92, yielding more than 200-fold higher cell numbers after 20-day culture. Overall, this study not only highlights the distinctive features of a novel NK cell line, NK101, as a unique polyfunctional CD56dimCD62L+ NK subset, but also addresses the capability of NK101 as a new platform for adoptive cancer immunotherapy.

Translational regulations of GluA1 and Bmal1 by RNA-binding proteins

정영섭 포항공과대학교 일반대학원 융합생명공학부 2019 국내박사

진핵세포에서의 정교한 단백질 합성은 신경계와 일주기 리듬에서 중요한 역할을 하는 유전자 발현에 필수적인 과정이다. 단백질을 합성하는 과정, 즉 번역 과정을 이루는 개시, 신장, 종결의 3 단계 중 가장 중요한 개시 단계는 크게 캡-의존적 번역과 캡-비의존적 번역의 두 가지로 나눌 수 있다. 캡-의존적 번역 개시는 전령 RNA의 5’ 말단에 존재하는 7-메틸 구아노신 캡을 인식하는 캡-결합 단백질을 통해 리보솜이 전령 RNA에 결합하여 일어나며, 캡-비의존적 번역 개시는 캡-결합 단백질과 캡 사이의 상호 작용 없이 특정 RNA-결합 단백질이 전령 RNA의 특정 2차 구조, 혹은 시퀀스를 인식해 결합한 후 리보솜을 끌어들여 번역이 시작된다. 많은 연구를 통해 신경세포의 기능과 일주기 리듬의 유지에 중요한 전령 RNA의 번역은 캡-의존적, 캡-비의존적 개시 과정 모두를 활용하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 이러한 전령 RNA의 번역 개시 조절 메카니즘은 아직 알려지지 않은 부분이 많이 남아있다. 본 학위 과정을 통해 신경 세포에서 중요한 역할을 하는 GluA1, 일주기 리듬에서 필수적인 역할을 하는 Bmal1의 번역 과정이 각각 hnRNP A2/B1, hnRNP Q에 의해 조절된다는 것을 밝혔다. 첫번째 장에서 GluA1의 번역 조절 과정을 다루었다. AMPA 수용체 아단위 중 하나인 GluA1은 시냅스 가소성에 필수적인 요소이다. AMPA 수용체의 발현 조절에 대해서는 많은 연구가 진행되었지만, 시냅스 활성에 의한 GluA1 단백질 합성 조절의 기저 메커니즘은 밝혀진 바가 적다. 이 논문에서 뇌유래신경영양인자인 BDNF가 GluA1의 국소 번역을 증가시키는 것을 보였다. 또한 해마 신경세포의 수지상 조직에서 RNA-결합 단백질 중 하나인 hnRNP A2/B1이 GluA1 전령 RNA에 결합하는 것과 GluA1의 캡-비의존적 번역 개시를 매개하는 것을 밝혔다. 그리고 신경세포에서 새롭게 합성된 GluA1을 직접적으로 시각화할 수 있었고, 더욱이 뇌유래신경영양인자를 통해 유도된 GluA1 번역 과정과 GluA1 전체 발현양, 표면 발현양은 hnRNP A2/B1이 knockdown된 신경세포에서 현저히 낮아짐을 보였다. 마지막으로 해마 신경세포에서 hnRNP A2/B1의 발현양을 낮추면 수상돌기의 발달이 뚜렷하게 저하되는 것을 관찰했다. 이 연구 결과로 hnRNP A2/B1으로 매개된 GluA1의 번역 조절 과정을 통해 시냅스 활성-의존적 AMPA 수용체 국소 발현에서 새로운 메커니즘을 제시할 수 있었다. 두번째 장에서는 일주기 리듬의 중요 유전자 중 하나인 Bmal1의 번역 조절 과정을 다루었다. 지구상에 존재하는 대부분의 생명체는 정교하게 조절되는 시계 유전자들간의 전사-번역 피드백 회로를 통해 만들어지는 일주기 리듬을 갖는다. Bmal1 유전자는 주요 시계 유전자 중 하나이며 피드백 회로의 한 축을 대표하는 전사인자이다. 일주기 리듬에서의 필수불가결한 Bmal1의 역할에도 불구하고 Bmal1의 번역 조절의 기저 메커니즘은 거의 알려진 바가 없다. 이 논문에서 NIH-3T3 섬유아세포와 유전자 벡터, 다양한 생화학적 실험 방법을 이용하여 Bmal1의 번역은 RNA-결합 단백질 중 하나인 hnRNP Q에 의해 억제된다는 것을 밝혔다. 흥미롭게도 hnRNP Q는 시간에 따라 Bmal1 전령 RNA의 5’ 비번역부위에 결합하여 Bmal1의 시간-의존적 발현을 조절했다. 또한, hnRNP Q의 단백질 발현을 억제하니 Bmal1 전령 RNA의 양은 변화가 없었지만 단백질의 양은 증가하였고, Bmal1 전령 RNA의 진동 패턴에는 변화가 없었지만 Bmal1 단백질 진동의 진폭은 크게 증가하였다. 그리고 hnRNP Q의 발현양을 낮추면 Bmal1을 통해 조절되는 유전자의 전령 RNA 진동 진폭이 증가했다. 이 연구 결과를 통해 hnRNP Q가 Bmal1의 번역 조절 과정과 Bmal1에 의해 조절되는 유전자 발현에 중심적인 역할을 하는 것을 밝혔다. 결론적으로, 학위 과정 동안 진행된 연구는 RNA-결합 단백질이 AMPA 수용체 아단위 GluA1과 주요 시계 유전자 Bmal1의 번역 조절 과정에 주요한 역할을 한다는 증거를 제시하였다. 그 동안 캡-비의존적 번역 개시는 특정 상황에서만 유도된다고 알려져 있었지만, 이 연구를 통해 일반적인 상황과 시냅스 활성이 주어진 상황에서 GluA1 단백질은 hnRNP A2/B1의 조절로 캡-비의존적 번역 개시를 통해 합성될 수 있음을 처음으로 밝혔다. 또한, 전혀 연구된 바 없었던 주요 시계 유전자인 Bmal1의 번역 과정은 hnRNP Q를 통해 억제되고 있음을 처음으로 확인하였다. 따라서 이 연구 결과를 통해 신경 세포와 일주기 리듬에서 RNA-결합 단백질에 의한 새로운 번역 조절 메커니즘을 제시함으로써 정교하게 조절되는 유전자 발현에 대한 이해를 넓히는데 크게 기여할 것으로 기대한다. Regulated translational control in eukaryotic cells is essential for gene expression in nervous system and circadian rhythm. Accumulating evidence has shown that the translation of mRNAs, which are critical for neuronal function or daily rhythmicity, is initiated by both cap-dependent and cap-independent mechanisms. However, translational regulation mechanisms of these mRNAs are not fully understood. Here, I demonstrate that the translation of GluA1 and Bmal1 is regulated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2/B1 and Q, respectively. In the first chapter, I will discuss about the translational regulation of GluA1. AMPA receptor subunit GluA1 is essential for induction of synaptic plasticity. Mounting evidence demonstrates the regulations of AMPA receptor expression, but underlying molecular mechanisms of the GluA1 protein synthesis elicited by synaptic activity are not fully understood. Here, I show that brain-derived neurotrophic factor (BDNF) stimulation results in the increase of GluA1 local translation. I also demonstrate that hnRNP A2/B1 interacts with GluA1 mRNA and mediates internal translational initiation of GluA1 in hippocampal neuronal dendrites. In addition, I directly visualize newly synthesized GluA1 in neuronal compartments. Moreover, the BDNF-induced GluA1 local translation as well as GluA1 total and surface expressions are significantly inhibited in the hnRNP A2/B1 deficient neuron. Furthermore, I monitor that the absence of hnRNP A2/B1 results in a significant impairment of dendritic spine development in hippocampal neurons. Taken together, hnRNP A2/B1-mediated translational regulation of GluA1 mRNA provides novel aspect for activity-dependent local expression of AMPA receptor. Next, I will describe the translational control of core clock gene Bmal1. Most living creatures have a circadian rhythm that is generated by precisely regulated transcriptional-translational feedback loop of clock genes. Brain and muscle ARNT-like 1 (BMAL1) is one of the core clock genes and transcription factors, which represents a positive arm of this autoregulatory circadian clock system. Despite the indispensable role of BMAL1 in circadian rhythm, the molecular mechanisms underlying translational control of BMAL1 are largely unknown. Here, using murine NIH-3T3 cells, gene constructs and a variety of biochemical approaches, I show that the translation of Bmal1 is negatively regulated by an RNA-binding protein, hnRNP Q. Interestingly, I find that hnRNP Q rhythmically binds to a specific region of Bmal1 mRNA 5’UTR and controls its time-dependent expression. Moreover, I demonstrate that knockdown of hnRNP Q modulates BMAL1 protein oscillation amplitude without affecting mRNA rhythmic patterns. Furthermore, hnRNP Q depletion increases mRNA oscillation amplitudes of BMAL1-regulated target genes. Together, my results suggest that hnRNP Q plays a pivotal role in both Bmal1 translation and BMAL1-regulated gene expression. Collectively, this study provides evidence that RNA-binding proteins have a critical role in translational control of AMPA receptor subunit GluA1 and core clock gene Bmal1. Cellular cap-independent translation initiation has been thought to be induced at specific situations including stress conditions and mitosis. However, this study first shows that GluA1 is synthesized by cap-independent initiation in normal and activity conditions. Also, I showed that hnRNP A2/B1 has a pivotal role in this process. Translational control of core clock gene Bmal1 is poorly understood. Here, I first presented that hnRNP Q negatively regulates Bmal1 protein synthesis. These studies provide novel findings of translational control mechanisms in neuronal and circadian clock system, and widen the scope of our perspective in tightly regulated gene expression.