척수 허혈, 재관류 동물 모델에서 cerebrolysin의 척수 보호

윤효철 충남대학교 의학전문대학원 2013 국내박사

배경: 흉부, 복부 대동맥 수술 중 허혈, 재 관류에 의한 척수 신경손상으로 생기는 하지 마비는 수술의 중요한 합병증이다. 이러한 허혈, 재 관류 손상을 줄이기 위하여 손상의 기전 및 이에 대한 치료에 대하여 많은 연구가 이루어져왔다. 허혈성 뇌신경 손상에서 뇌신경 보호의 임상적 효과가 알려진 cerebrolysin이 허혈 재 관류 손상을 입은 척수 신경에 대한 효과는 아직 밝혀진 바 없다. 저자들은 백서를 이용하여 허혈 재 관류 동물 모델을 만들고 이를 통해 cerebrolysin의 척수 신경 보호 효과를 알아보고자 한다. 재료 및 방법: 24마리의 백서를 척수 허혈의 동물 모델을 만들기 위하여, 1군(n=6), 2군(n=6), 3군(n=6), 4군(n=6)으로 무작위 배분 하였다. 1군의 백서는 마취 및 복부의 정중 절개 후, 좌측 신동맥 하방과 복부 대동맥 분지부 두 곳을 결찰 하였다. 2군은 횡경막 하방의 복부 대동맥을 결찰 하였다. 3군과 4군은 우측 신동맥 상방 복부 대동맥을 결찰 하였다. 1군은 60분 허혈 손상을 주었다. 2군은 45분(N=3), 60분(n=3) 마지막으로 3군은 45분, 4군은 30분 허혈 손상을 주었다. cerebrolysin의 허혈, 재 관류 후 척수세포 보호 효과를 척수 손상 모델 백서(n=16)로 실험 하였다. 실험군(n=8)과 대조군 (n=8)으로 나눈 후 실험군 백서의 복강으로 cerebrolysin 5mg/kg을 대조군은 같은 용량의 생리 식염수를 정중 절개직전, 1시간, 1일, 2일 간격으로 각각 주입 하였다. 실험군과 대조군의 운동 신경학적 검사는 Tarlov score를 이용하여 양군에서 허혈 손상 후 2시간 동안 30분 간격으로 측정하였다. 72시간후 25% 유레탄 4ml/kg를 복강 내 주입하여 마취 후 경추 탈골로 절명시키고 요부 척추를 적출하였다. 적출한 조직은 10% 포르말린 용액에 3일간 고정시킨 후 조직병리학적 검사와 TUNEL assay를 시행 하여 cerebrolysin의 척수 신경세포 보호 효과를 관찰하였다. 결과: 허혈 재관류 척수 손상 동물 모델 1군은 허혈에 의한 하지 마비를 관찰 할 수 없었고, 2군은 대동맥 조작 후 생존한 백서가 없었으며 3군은 3례에서 사망 하였다. 하지마비와 함께 사망 례가 없는 4군을 허혈에 의한 척수 손상 모델로 삼았다. 16마리의 백서를 이용한 cerebrolysin 허혈 재관류 모델에 대한 척수 신경 보호 효과 결과는 실험군(n=8)과 대조군(n=8) 모두 조직 병리학적 검사에서 신경 세포 자멸사의 특징인 붉은 신경 세포를 척수 전각에서 확인 할 수 있었으며 TUNEL assay에서도 apoptotic body를 양군에서 관찰 할 수 있었다. 붉은 신경세포의 수는 실험군은 14.7개, 대조군은 18.5개로 통계적 유의성을 보이는 차이를 보였다(p=002). 실험군과 대조군은 통계적 유의성을 보이는 운동신경 검사 결과를 보이지 않았다(p=0.61). 결론: 본 연구에서 사용한 척수 허혈 재 관류 백서 모델은 첫째, 실험군과 대조군 모두에서 조직학적으로 척수 전방각의 신경세포의 세포 자멸사를 확인 할 수 있었으므로 안정적인 동물 모델이 구축된 것을 확인할 수 있었다. 둘째, 실험군의 척수 전방각의 운동 신경이 대조군에 비해 생존률이 높았으므로 cerebrolysin의 허혈과 재 관류에 의한 신경세포 손상에 신경세포 보호 효과가 있음을 알 수 있었다. Background: The most sensitive organ is the spinal cord, and ischemic injury can produce paraplegia after operation. There has been many efforts to protect the spinal cord against ischemic-reperfusion injury. We were to develope animal model for the spinal cord ischemic injury with rats and then examined the neuroprotective effect of cerebrolysin on ischemic-reperfusion spinal cord injury in newly developed animal model Methods: Twenty four Spargue-Dawley male rats were randomly divided into four groups for ischemic-reperfusion model. Group 1 (n=6) underwent spinal cord injury by ligation of the abdominal aorta between the Lt.renal artery and the bifucation site, group 2 (n=6) by ligation of the abdominal aorta just below the diaphragm, and group 3 (n=6) & group 4 (n=6) by ligation of the abdominal aorta above the Rt.renal artery. Ischemic injury time was 60 min in group 1 .In group 2, ischemic injury time was 45min (n=3), 60min (n=3). In group 3, ischemic injury time was 45min and 30min in group 4. With this ischemic-reperfusion animal model, we tested neuroprotective effect of cerebrolysin, For a test group (n=8), cerebrolysin 5mg/kg was injected intraperitonialy and normal saline was injected in control group (n=8). The locomotor function was checked according to Tarlov score at every 30 minutes for 2 hours. The spinal cords were harvested for histopathologic examination and TUNEL assay to exam spinal cord protective effect of cerebrolysin on 72 hours. Results: In group 1, neurologic examination showed no lower limb paralysis. In group 2, there were no survival rats after ischemic procedure. In group 3, there were three death cases. Group 4 showed reliable ischemic-reperfusin injury animal model then we adopted group 4. Cerebrolysin group(n=8) and control group(n=8), using this animal model, did not show significant statistical difference in Tarlov score (p=0.61) but red neuron cell count showed statistical significant (p=0.02) between test group, mean 14.7 cell count and control group. 18,5 mean cell count. Conclusions: As a animal spinal cord ischemic model, ligation of the abdominal aorta above the Rt. renal artery might be reliable method, proved by histopathologic confirmation of red neuron cell. By using this animal model, neuroprotective effect of cerebrolysin was tested and it might be concluded that cerebrolysin has the spinal cord protective effect by showing less red neuron cell counts in ant. horn of spinal cord,

관상동맥우회술 시 공여혈관 보존제로서 Nafamostat mesilate의 유용성

윤유상 충남대학교 의학전문대학원 2013 국내박사

배경: 관상동맥우회술에 사용되는 공여혈관 보존액은 혈관의 수축을 방지하는 항경련성 약제와 혈관 내 혈전 생선을 방지하는 항응고제 및 혈관 세포들의 생존률을 유지할 수 있는 성분들을 첨가되어 사용된다. Nafamostat mesilate는 항염증 작용과 항응고 작용이 있는 약제이며, 심장수술이나 체외막 산소화 장치에도 사용이 증가하는 추세이다. Papaverine은 강력한 국소 혈관 확장제로 공여혈관 보존액에 자주 사용된다. 본 연구에서는 nafamostat mesilate와 papaverine을 장력 검사, 혈관 내피세포의 생존률과 혈관 세포들의 세포자멸사에 대한 보호능력 등을 비교하여 공여 혈관 보존약제로써 nafamostat mesilate의 유용성을 알아보고자 하였다. 재료 및 방법: 6마리 백서의 흉부 대동맥 단편을 사용하여 실험조에서 수축과 이완 실험을 시행하였다. 3μg/ml과 10μg/ml 농도의 nafamostat mesilate와 papaverine을 이용하여 전처치를 시행한 후 phenylephrine(PE)과 acethycholine(ACh)을 이용하여 수축 및 이완실험을 시행하였다. 혈관 내피 세포 독성 실험은 HUVECs을 24시간 배양한 다음, nafamostat mesilate와 papaverine을 농도별로 첨가 후 24시간 더 배양을 시행한 뒤 살아있는 세포들을 정량하여서 백분율로 표시하였다. 6마리의 백서의 흉부 대동맥 단편을 사용하여 생리식염수군, nafamostat mesilate군, papaverine군으로 나누었다. 생리식염수와 10μg/ml 농도의 nafamostat mesilate와 papaverine에 1시간 담가둔 후 10% 포르말린 용액에 3일간 고정시킨 다음, 조직병리학적 검사와 TUNEL assay를 시행 하여 혈관 세포 내막과 중막의 구조물 손상 정도 및 두께를 비교하였다. 결과: 정상 대조군의 대동맥환에서 3μg/ml papaverine과 nafamostat mesilate로 전처치를 한 뒤 PE에 대한 혈관 수축 반응을 본 결과, papaverine이 Nafamostat mesilate보다 좀 더 수축 능력의 저하 효과가 좋아 보이나 PE 10-7M과 3X10-7M의 두 농도 모두에서 통계학적인 유의한 차이는 보이지 않았다(p>0.05). 10μg/ml papaverine과 nafamostat mesilate로 전처치를 한 후 PE에 대한 혈관 수축 반응을 본 결과, papaverine이 nafamostat mesilate보다 PE 3X10-8M, 10-7M과 3X10-7M 농도의 모두에서 통계학적인 유의한 차이를 보이는 수축 능력의 저하 효과가 있었다 (p<0.05). 3μg/ml papaverine과 nafamostat mesilate로 전처치를 한 후 Ach에 대한 이완검사에서는 papaverine군이 nafamostat mesilate군에 비하여 이완 능력이 좋아 보이나 ACh의 모든 실험 농도에서 통계학적인 유의한 차이는 보이지 않았다(P>0.05). HUVECs 배양을 통한 혈관 내피세포의 생존률 검사는 nafamostat mesilate와 papaverine 두 군 모두에서 90%이상의 우수한 생존률을 보였다. 혈관 세포들의 세포자멸사에 대한 보호 효과를 보기위해 시행한 조직병리학적 검사에서는 혈관의 내막 두께에는 생리식염수군과 papaverine군, nafamostat mesilate군 모두에서 차이가 없었지만, 중막의 두께는 nafamostat mesilate군이 가장 컸으며(p<0.05), 생리식염수, papaverine군 순으로 두꺼웠다. TUNEL assay 결과에서도 nafamostat mesilat군에서는 TUNEL 양성 세포들이 내막과 중막 세포들 중 약 29% 정도로 적게 발견되었으나, 생리식염수군과 papaverine군에서는 혈관 내막 및 중막 세포의 세포의 자멸사가 많이 진행되어서 각각 80%와 74%의 TUNEL 양성 세포가 발견되어, 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다(p<0.05). 결론: 백서의 흉부대동맥분절을 이용하여 관상동맥우회술에 사용되는 공여혈관 보존제로서 nafamostat mesilate의 유용성을 papaverine과 비교하여 연구를 하였고 다음과 같은 결론을 얻었다. 첫째, nafamostat mesilate의 혈관 확장성은 3μg/ml농도에서 papaverine과 비슷한 혈관 수축 저하 효과와 혈관 이완효과를 보여주었다. 둘째, nafamostate 군에서 혈관 내피세포의 생존률이나 혈관 내피세포의 세포자멸사 보호 능력이 우수한 것을 알 수 있었다. 셋째, nafamostat mesilate는 항응고 및 섬유소용해 작용이 있어 혈관내 혈종 생성을 막을 수 있을 뿐 아니라, 봉합 부위의 출혈을 감소시키는 장점이 있으므로, 관상동맥우회술에 사용되는 공여혈관 보존액에 사용가능한 약제이다. 그렇지만 인체 조직을 이용한 추가 실험이 필요하다. Background: The graft vessel preservation solution in coronary artery bypass surgery (CABG) is used to maintain the graft conduit in optimal condition during perioperative period. It consists of antispasmatic, anti-inflammatory, and anticoagulative components. Antispasmatic drug is preventing vasospasm of graft conduit in the perioperative period. Nafamostat mesilate has anticoagulation, anti-inflammatory and antifibrinolytic effects. It is used predominantly as an anticoagulator in CABG or as an extracorporeal membrane oxygenator. However, its effect as a vasodilator is relatively unknown. Papaverine is commonly used vasodilator in CABG operations. Therefore we investigated nafamostat mesilate and its effect on vascular dilatation, endothelial cell viability, and vascular cell protection as a compared to papaverine to evaluate its potential as a conduit preservative agent. Methods: Sprague Dawley rat (n=6) thoracic aortas were examined for their contraction-relaxation ability using phenylephrine (PE) and acetylcholine (ACh) following preincubation with papaverine and nafamostat mesilate in standard classical organ baths. Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were cultured after preincubation with papaverine and nafamostat mesilate to check for the endothelial cell viability. Histopathological examination and TUNEL assay were performed on the thoracic aortas of three Sprague-Dawley male rats (n=6) after preincubation with saline, papaverine and nafamostat mesilate. Morphological changes and the thickness of intima and media were checked with H&E staining. Brown color stained TUNEL positive cells were counted in TUNEL assay. Results: The effect of nafamostat mesilate and papaverine on PE induced vasoconstraction were found to be similar at 3 μg/ml using PE 10-7M and 3X10-7M. However the anti-contraction effects of papaverine were superior to that of nafamostat mesilate at 10μg/ml using PE 3X10-8M, 10-7M and 3X10-7M (p<0.05). The relaxation effect of nafamostat mesilate on ACh induced vasodilatation was not statistically different to that of papaverine at 3μg/mL under various concentrations of ACh. Viability assays using HUVECs showed endothelial cells survival rates of over 90% in various concentrations of both NM and Papaverine. Intimal thicknesses was not different across groups. However, medial thickness in H&E staining and necrotic grade in TUNEL assay both showed a protective effect against necrosis and apoptosis(p<0.05)in the nafamostat mesilate group whereas the saline control group and papaverine group showed similar results in terms of protective effects and cell viability. Conclusions: Examination in thoracic aorta in rat showed that the relaxation effect of nafamostat mesilate and papaverine are similar at 3 μg/ml concentration. Additionally, We found that nafamostat mesilate is better at protecting against necrosis and apoptosis of vascular cells as shown by H&E staining and TUNEL assay. Along with its anticoagulative, anti-inflammatory and antifibrinolytic effects, we conclude that NM is a good potential conduit preserving agent and warrants further studies for use in humans.

人間 肝의 肝細胞癌腫과 非癌性 病變에서 Mitogen Inducible Gene-6의 發現

김석현 忠南大學校 醫學專門大學院 2011 국내박사

Aims/Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a very serious disease with worldwide importance. Many investigators have conducted studies about signaling pathways that have been implicated in HCC development and progression, including pathways associated with cell proliferation, survival, differentiation, inflammation, oxidative stress, and angiogenesis. Mitogen inducible gene-6 (MIG-6), also known as receptor-associated late transducer (RALT), erythroblastic leukemia viral oncogene homolog (ErbB) receptor feedback inhibitor (Errfi-1), and gene 33, is an adaptive protein implicated in the regulation of receptor tyrosine kinases. Some studies showed that MIG-6 is involved as a tumor suppressor gene in several malignancies, including breast cancer, lung cancer, thyroid cancer, and endometrial cancer. A recent study showed that MIG-6 is a negative regulator of epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in HCC cell lines. To understand the role of MIG-6 as a tumor suppressor gene in human HCC, we examined the expression of MIG-6, EGFR, ErbB 2, and mesenchymal epithelial transition factor (MET) in human HCC. Methods: We examined 47 human tissue specimens (HCC tissues, 19; cirrhotic tissues, 16; and normal tissues, 12), which were stored at −70℃ after hepatic resection, by MIG-6-specific immunohistochemical staining; quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-RCR) for MIG-6, EGFR, ErbB 2, and MET; and western blot for MIG-6. Results: Human HCC tissue specimens were not stained by MIG-6-specific immunohistochemical statin, but normal tissue and cirrhotic tissue specimens showed diffuse staining. MIG-6 mRNA expression was significantly lower in the human HCC tissue than in the surrounding non-neoplastic tissue (p=0.02). Moreover, western blot analysis showed that MIG-6 expression in the human HCC tissue was markedly lower than in the surrounding non-neoplastic tissue. No significant differences were observed between the expression of EGFR mRNA and ErbB 2 mRNA in the human HCC tissue and in the surrounding non-neoplatic tissue. Expression of MET mRNA in the human HCC tissue was significantly higher than that in the surrounding non-neoplastic tissue (p =0.03). However, the expression of MIG-6 mRNA, EGFR mRNA, ErbB 2 mRNA and MET mRNA did not significantly differ between normal and cirrhotic tissue specimens. Conclusion: We showed that in human HCC, a decrease in the expression of MIG-6 was accompanied by an increase in the expression of MET. On the basis of our findings, we recommend that the relationship between MIG-6 and MET in human HCC needs to be studied further.

한국인에서 연령 증가에 따른 분노와 공격성의 변화

박재상 충남대학교 의학전문대학원 2010 국내석사

Objective: This study was to investigate the trends in anger and aggression with aging in Korean population aged from twenties to eighties. Method: Two hundreds ninety-five subjects included, ranged 22 to 92 years old. All subject participate in a clinical interview with psychiatrists who use the MINI(Mini international Neuropsychiatric Interview) to diagnosis psychiatric disorders, and were not any psychiatric disorders. All subjects completed Anger/Aggression measures - STAXI (State and Trait Anger Inventory), RI (Reaction Inventory), and AQ (Aggression Questionnaire). The comparison by sex and by adult group and elderly group for total scores and factors of STAXI, AQ, and RI used independent t-test. The correlation of anger and aggression with age were analysed by Pearson correlation and linear regression analysis. Statistics was carried out by SPSS 17.0. Window version Result: The scores of Acting-out of STAXI, Physical Aggression and Total of AQ, and Unpleasant circumstances of RI were higher in men than women. In elderly group, the scores of Trait anger, Anger expression, and totol of STAXI were higher than adult group, where as the scores of State anger of STAXI, Hostility of AQ, and Disturbances, Embarrassing, Unpleasant circumstances, and total of RI were higher in adult group. Trait anger and Anger expression were shown trends to increase with age. On the other hands, State anger, Hostility, and Reaction to external stimuli were shown trends to decrease with age. Conclusion: The reaction to anger situation and aggression decrease with age, although anger increase with age. Moreover, we found sex difference in anger and aggression. Various factor, such as defense mechanism may affect on aggressive expression and response. There will be needed to investigate associated factors between anger and aggression.