해양미세조류(Schizochytrium mangrovei)의 분리 동정과 DHA를 다량 함유하는 계육 및 계란 생산

정우철 慶尙大學校 2009 국내박사

최근에 미생물에 의해 생산되는 유용물질의 하나로 신체의 성장과 유지 및 여러 생리적 과정의 정상적인 기능을 수행함에 있어 그 중요성이 강조되고 있는 필수지방산인 오메가-3 고도불포화지방산들은 임상적인 효과 때문에 많은 연구자들에 의하여 관심의 초점이 되고 있다. 그러나 이들 지방산들은 현재 공업적으로 어유에서 추출·정제하여 사용하고 있으며, 여러 공정을 거쳐야 하는 단점이 있다. 또한 오메가-3 고도불포화지방산의 주요 공급원으로서 사용되어지는 해산어류는 바다로부터 공급되는 양은 한정되어 있으나, 수요는 급격히 증가되고 있는 추세이다. 따라서 DHA의 주요 공급원으로서 사용되어지는 어유를 대체할 수 있는 새로운 공급원이 절실히 필요한 실정이다. 이러한 점을 착안하여 이번 연구에서는 DHA의 대체공급원을 찾고자 세 가지 초점을 두고 실험을 실시하였다. 첫째, DHA의 새로운 공급원으로서 보다 높은 DHA를 함유하는 해양미생물을 분리하여 기본적 생리 특성 조건을 알아보고, 고도불포화지방산(DHA)를 가장 많이 생산할 수 있는 배양조건을 탐색하고자 하였다. 그 결과 해양미생[Thraustochytrid 科]로 추정하여 분리 한 균주에서 DHA가 30% 이상이고, 성장속도가 빠른 최종 5종의 균주를 최종 분리하여 18S rDNA sequencing 결과 최종적으로 Schizochytrium mangrovei MM103을 DHA 대체공급원의 균주로서 선택하였다. S. mangrovei MM103의 최적 성장 조건과 최적의 DHA 함유 조건을 찾아내고자 하였다. 최적 성장 조건의 경우 배양온도는 28℃, 염분농도는 20 psu, pH는 7로 나타났다. 하지만 DHA 가장 많이 함유하는 조건은 배양온도가 가장 낮은 실험구인 15℃, 염분도는 실험구간의 유의적 차이는 없는 것으로 나타났으며, pH는 성장 조건과 동일하게 pH7로 나타났다. 실험을 통해 다른 여러 조건에 비해 배양온도에 따라 성장과 DHA함량에 영향을 많이 미치는 것으로 나타났다. 배양배지의 경우 가장 적당한 탄소원은 glucose였으며, 질소원은 yeast extract로 나타났지만 대부분의 질소원에서 S. mangrovei MM103의 성장은 좋은 것으로 나타났다. 둘째, S. mangrovei MM103를 이용하여 700 L 교반조 발효기를 이용하여 교반속도에 따른 실험과 5 ton 교반조 발효기로의 scale-up 하고자 하였다. 교반속도에 따른 실험에서 균체량은 100 rpm 에서 10.74 g/L와 150 rpm에서 10.19 g/L로 두 실험구간에 차이는 없었으며, DHA 경우 45.31~ 43.78% 나타났다. 그러나 교반속도에 따른 DHA 생산량은 100 rpm일 때 2.01 g/L로 가장 많은 것으로 조사되었다. 그리고 S. mangrovei MM103의 최적 성장조건과 700 L 발효조를 이용한 교반 속도에 따른 실험결과를 바탕으로 5 ton 교반조 발효기로 scale-up하였다. 이 때 당소모량을 모니터링 함과 동시에 추가 영양배지를 공급함으로서 지속적인 성장을 가지도록 해주었다. 5 ton 교반조 발효기를 이용한 pilot 규모에서의 배양결과는 3 일째 생산된 균체량은 23.22 g/L, 4일 째는 31.85 g/L로 나타났다. 이는 실험실 수준에서 보다 2~ 3배 높은 균체량이다. DHA의 경우 실험실에서는 45.31~ 46.78%였지만, 발효조에서는 43.61~ 44.24%로 약간 낮게 나타났다. 이번 실험을 통해 DHA생산은 3일 째 4.37 g/L, 4일 째 5.73 g/L까지 생산하였다. 셋째, S. magrovei MM103을 이용한 DHA 발효대두박을 개발하고자 하였다 S. magrovei MM103을 이용하여 발효된 대두박은 기존의 대두박에 비해 특징적으로 많이 함유하고 있는 18:2n-6 지방산이 55.30%였고, DHA가 전혀 없었지만, 발효과정을 통해 18:2n-6는 28.67%로 감소하였고, DHA가 15.54%까지 높아지는 것으로 나타났다. 대두박을 S. mangrovi MM103로 발효하여 제조한 DHA 발효대두박을 시판 농협사료와 3%, 5%, 10% 혼합하여 육계용과 산란계용 실험 사료를 조제하여 3주간 급이하였다. 그 결과 DHA발효 대두박 농도와 관계없이 육계 가슴육과 다리육 및 계란에서 DHA 농도가 시판 사료 급여에 비하여 높게 나타났다. 발효대두박 10% 혼합 사료를 급여한 육계의 DHA는 가슴살, 다리살 및 계란에서 각각 2.21%, 2.02% 및 1.88%로 증가하였다. 또한 6주간 실험 사육했을 때 가슴육, 다리육 및 계란의 DHA 함량은 각각 5.10%, 2.48% 및 3.42%로 사육기간의 경과에 따라 증가하였다. 이번 실험을 통해 발효대두박을 이용한 DHA 함유 계육 및 계란 생산에 이용 가능성이 입증되었다. While the volume of fish caught from the sea is showing a declining trend in recent vears and being the major source of omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) will eventually be limited, the demand for PUFAs is rapidly increasing. Thus, there is an urgent need to look for a new resource that can replace fish as the main source of docosahexaenoic acid (DHA). Considering the mentioned scenario, this research carried out experiments on these three points in order to seek for an alternative source of DHA. First, this research attempted to identify marine organisms producing high amounts of DHA as a potential source to supply the raw material and then, proceeded to determine their optimum cultivation conditions. The results of this research yielded five final strains with DHA levels of more than 30% and showed fast growth rates, which were separated from other strains presumed to belong to the thraustochytrid family. After 18S rDNA sequencing of the five strains, Schizochytrium mangrovei MM103 (KCTC 11117BP) was selected as an alternative source of supply for the DHA. After which, the research attempted to find the optimum growth and DHA content conditions for this S. mangrovei MM103. Optimum growth occurs of S. mangrovei MM103 when the temperature is 28℃, chlorine level is 20 psu and pH at level 7. However, the DHA content condition occurs at a 15℃, which is the lowest experimental groups. For the chlorine content, there is no difference among the experimental groups. Also, the optimum pH is at 7, the same with the amount of growth rate. The experiment showed that the growth and DHA contents of the strains were more affected by temperature as compared top the other conditions. In the case of the culture media, glucose was used as a carbon source and yeast extract as nitrogen source. In addition, the growth of S. mangrovei MM103 was better then most of the nitrogen sources. Second, this research carried out an experiment according to stirring speed using S. mangrovei MM103 and 700 L stirred fermenter tank, and then attempted to scale-up the 700 L stirred fermenter tank to a 5 ton tank. In the experiment, according to the stirring speed, the biomass production amount was 21.48 g/L at 100 rpm and 20.38 g/L at 150 rpm, which showed that there was no difference between the experimental groups. The percentage of DHA was 45.31~ 43.78%. However, the largest production amount of DHA according to stirring speed was 2.01 g/L at 100 rpm. In addition, based on the experimental results according to stirring speed using the optimum growth condition of S. mangrovei MM103 and the 700 L stirred fermenter tank, the 700 L stirred fermenter tank was scaled-up to a 5 ton fermenter tank. At this point, consumption amounts were monitored and at the same time additional nutrition media were supplied for S. mangrovei MM103 for continual growth. As a result, the amount of biomass produced on the 3rd day in the 5 ton pilot was 46.44 g/L, and the amounts on the 4th day was 63.70 g/L. These amounts were 2~ 3 times higher than those in the lab. The percentages of DHA in the lab were 45.31~ 46.78%, but the percentage of DHA in the pilot size were lower at 43.61~ 44.24%.The amount of DHA produced could be 4.37 g/L on the third day and 5.73 g/L on the fourth day. Third, this research attempted to develop DHA fermented soybean meal using S. magrovei MM103. An existing soybean meal has 18:2n-6 fatty acid, which at 55.30% is an ingredient that is particularly and largely contained in soybean meal, and no DHA. However, through a fermentation process using S. magrovei MM103, the percentage of 18:2n-6 was reduced to 28.67%, and the percentage of DHA was increased to 15.54%. The objective of this study was to evaluate the DHA level of chicken meat and eggs which were fed with fermented soybean meal (FSM) by marine microalgae (Schizochytrium mangrovei MM103). The diets were composed with different amounts of fermented soybean meal level at 3% FSM, 5% FSM and 10% FSM in broiler diet. The DHA content of the carcass was increased when feeding level of fermented soybean meal increased. The DHA content of breast was higher in 10%(2.21%) than 5%(1.65%) and 3%(1.18%). The DHA content of legs was higher in 10%(2.02%) than 5%(1.22%) and 3%(0.73%). The DHA content of eggs was higher in 10%(1.88%) than 5%(1.37%) and 3%(0.81%). The level of long chain omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) such as DHA in the fermented soybean meal diet was significantly higher than those of the other treated groups(p<0.05). The results demonstrated that fermented soybean meal by marine microalgae (Schizochytrium mangrovei MM103) could be used the production of DHA-rich chicken meat and eggs.

Effects of marine protected areas to distribution and current status of seagrass bed

김태현 제주대학교 대학원 2023 국내석사

Multi-decadal changes in fish assemblages and sustainable fisheries management in the Korea Strait

이경환 제주대학교 대학원 2021 국내박사

This study showed 1) the multi-decadal changes in fish assemblages in relation to oceanic environment change in the Korea Strait, and 2) biological reference points and current fishing level for sustainable fisheries of Pacific anchovy and chub mackerel representing the dominant species in the Korea Strait. Chapter 1, I evaluated spatio-temporal changes of the fish-assemblage structure in the Korea Strait (KS, 126°-129°5'E, 33°5'-35°N) and its relationship with oceanic conditions from 1986 to 2010. Hydrographic data include depth-specific water temperature, salinity and inflow indices of the Tsushima Warm Current (TWC) and Korea Strait Bottom Cold Water (KSBCW). Spatio-temporal changes of the fish-assemblage structure and relationship with oceanic conditions evaluated by Correspondence analysis (CA) and canonical correspondence analysis (CCA). Anchovy was the most dominant species in the KS from 1986 to 2010. Shift in the fish assemblage was detected between 1990 and 1991. Sardine and filefish dominated from 1986 to the early-1990s, and chub mackerel and squid dominated from the early-1990s to 2010. Annual changes in fish assemblages were significantly correlated surface water temperature at 0-20 m depths. Regime shift in surface water temperature was detected shift in 1987. Among the significant oceanic conditions, water temperature delayed by 1 year showed the most significant correlation with change in fish assemblage structure. I conclude that 1) fish assemblage structure dramatically shift in the 1990-1991, 2) the KS is an intermediate area between the waters off Ieodo and the East Sea with respect to the timing of shift in fish assemblage structure, 3) the shift of fish assemblage structure in the KS was highly influenced by climate shift of surface water temperature in the late-1980s. Chapter 2, I developed and applied a simulation-based yield-per-recruit analysis that considered temperature-dependent growth and size-dependent mortality from egg to adult stages of anchovy. I projected changes in fisheries yield and egg production of anchovy with respect to varying biological reference points of 1) the instantaneous fishing mortality (F), 2) the minimum fork length of anchovy allowed to catch for protecting smaller anchovy (Lc,min), and 3) the maximum fork length allowed to catch for protecting bigger anchovy (Lc,max). Simulation showed that the anchovy yield will be maximized at ca. 1.4×106 tons when Lc,min ranges between 42-60 mm or at ca. 0.8×106 tons when Lc,max ranges from 88-160 mm. At Lc,min=30 mm, the present minimum length of catch, simulation indicated that the anchovy yield can reach a maximum of 1.3×106 tons in the long-term when F0.1=0.028 day-1. I expect that this yield-per-recruit model can be applied to other commercially-important small pelagic species in which the traditional Beverton-Holt Y/R model is difficult to apply. Chapter 3, to provide the biological reference points for management of chub mackerel stock, I applied a simulation-based yield-per-recruit analysis that considered 1) temperature-dependent growth in early life stage, 2) size-dependent mortality. I estimated fisheries yield with respect to varying biological reference points and environmental conditions such as 1) the instantaneous fishing mortality (F), 2) the length at first capture (Lc), and 3) spawning water temperature. The result of simulation showed that the yield-perrecruit (Y/R) could be greater when the Lc ranges from 19-27 cm and F ranges from 1.48-2 yr-1. Y/R with respect to varying spawning water temperature from 15 to 23℃ showed an increasing trend with increasing temperature. I suggest targeting an Lc of 17 cm (age=0.6 years) at F=0.48 yr-1, which is the current fishing mortality, for maximizing the chub mackerel harvest. 우리나라 연근해어업 생산량은 1970년 72만 톤에서 점차 증가하여 1986 년 173만 톤으로 최대 생산량을 나타냈으며, 이후 최근까지 감소하여 90-100만 톤을 유지하고 있다. 과거 연구를 통해 수산자원 변동과 감소는 크게 기후변화에 따른 해양환경 변화와 남획에 영향을 받는 것으로 평가되었다. 해양환경 변화가 수산어종 분포에 미치는 영향을 평가하기 위해 해양환경 장기 변동을 어종별 분포 및 어획량 변동과 연결하여 평가하는 연구가 지속적으 로 시도되고 있다. 우리나라 주변 해역을 대상으로 해양환경 변동이 수산어종에 미치는 영향을 평가한 연구에 따르면 1980년대 후반 해양환경 체제변환이 1990 년 초에 나타난 쥐치류와 정어리 자원의 급격한 감소와 관련이 있는 것으로 나 타났으며, 멸치-정어리의 주요 어종 교체 현상 또한 해양환경 변동과 연관되어 있는 것으로 나타났다. 일부 어종에 대해 가입당 생산량 분석과 같은 어획수준을 평가한 연구는 진행 되었지만, 어획과 어종별 자원량 변동의 관계를 뚜렷하게 평 가하지 못해 남획이 우리나라 주요 수산어종의 자원량 감소의 원인으로 평가하 기에는 부족하다. 따라서, 이 학위논문의 연구 목적은 1) 우리나라 주변 해역 중 대한해협을 대상으로 어류 군집 장기 변동과 해양환경 변동의 관계를 평가하고, 2) 대한해협 주요 수산어류 구분되는 멸치와 고등어를 대상으로 어류 자원의 지속적인 이용 을 위한 생물학적 기준점을 제시하기 위해 가입당 생산분석을 적용하여 어획조 건에 따른 가입당 생산량과 현행 어업수준을 평가하는 것이다. 대한해협 1986-2010년 우점종 변동과 해양환경 변동의 관계를 평가하기 위해 대응분석을 이용하여 연도별, 월별 우점종 변동과 어획지점에 따른 해구번 호별 어종 분포를 평가하고 정준대응분석을 이용하여 해양환경 변동이 연도별 우점종 변동에 미치는 영향을 평가하였다. 평가결과 대응분석을 통한 대한해협 어류군집은 1990-1991년 사이에 1번의 유의한 우점종 변동을 나타냈다. 1990s 초에 나타난 어류군집 우점종 변환을 기준으로 1986-1990년은 멸치, 쥐치, 정 어리가 우점하는 것으로 나타났으며, 1991-2010년은 멸치, 고등어, 오징어가 우 점하는 것으로 나타났다. 해구별 어종 분포 평가 결과 멸치는 남해동쪽 연안에 우점하는 것으로 나타나며, 고등어, 오징어, 갈치는 제주도 북쪽 해역에서 남해 동쪽으로 연결되는 가장 넓은 해역에 분포하는 것으로 나타났다. 정준대응분석을 통해 연도별 어류군집 변동은 표층수온 (0-20 m) 변동에 가장 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 멸치 연간어획량은 1992년 11만 톤 이후 2015년까지 19만 톤 이상의 어 획량을 나타냈으나 2016년 11만 톤으로 감소하였다. 멸치의 가입당생산량을 평 가하기 위해 수온 의존적인 성장과 체장 변화에 따른 자연사망률을 반영하여 알 -성어 단계까지 평가하였다. 멸치는 1) 짧은 생애주기와 2) 빠른 성숙 연령, 3) 연중 산란하는 생물학적 특성 때문에 일반적으로 사용하는 Beverton and Holt (1957)의 방법을 적용 하기에 문제점이 있다. 따라서, 멸치 생물학적 특성과 Beverton and Holt (1957)의 방법을 고려한 모의실험을 통해 1) 순간어획사망계 수(F)와 2) 어획개시체장(Lc) 변동에 따른 가입당생산량을 평가하였다. 또한, 현 행 어업 규정으로 적용하고 있는 1) 미성어를 우선 보호하며 어획하는 최소어획 체장(Lc,min=Lc 이상의 개체를 어획 하는 경우)과 2) 성어를 우선 보호하며 어획 하는 최대어획체장(Lc,max=Lc 이하의 개체를 어획 하는 경우) 조건에 따른 가입당 생산량을 평가하고 비교하였다. 평가결과 Lc,min가 42-60 mm 일 때 최대 가입당 생산량은 1.4×106 톤으로 나타냈으며, Lc,max가 88-160 mm 일 때 최대 가입당 생산량은 0.8×106 톤으로 나타났다. 현행 Lc,min 규제 기준으로 보고된 30 mm일 때 최대 가입당생산량은 13.1×106 톤(F=0.028 yr-1)으로 1990-2016년 멸치 평 균 어획량 2.2×106 톤(F=0.001 yr-1)과 비교하면 최대 생산량에 도달하기 위해 현재보다 약 28배의 추가적인 노력량이 필요한 것으로 평가된다. 어획조건에 따 른 최대생산량 차이는 미성어를 보호하며 어획할 경우 성어를 우선으로 보호하 며 어획하는 것 보다 약 1.9배 가입당 생산량이 높은 것으로 나타났다. 따라서, 미성어를 우선으로 보호하는 어획하는 최소어획체장 적용이 성어를 우선 보호하 며 어획하는 최대어획체장 적용 보다 장기적으로 멸치 어획고를 증대시키는데 유리한 규제 방법으로 평가되며, 지금보다 어획노력량을 늘려도 멸치 자원의 감 소 없이 더 많은 생산량을 얻을 수 있을 것으로 평가된다. 고등어는 1999년부터 연간 어획할 수 있는 어획량을 설정하여 자원을 관 리하는 총 허용어획량(total allowable catch, TAC) 대상 어종이다. 1970년대 부터 1995년까지 연간 약 10-20만 톤의 어획량을 나타냈으며, 1996년에 약 42 만톤까지 증가하였으나 2000년 약 15만톤 수준으로 감소하여 연도별 어획량 변 동이 크게 나타났다. 고등어 자원의 적정 어획을 위한 생물학적 기준점(F0.1과 Fmax)과 현행 어획수준을 평가하기 위해 1) 수온을 반영한 초기 성장과 2) 체장 변화에 따른 자연사망률을 고려하여 Beverton and Holt (1957)의 가입당 생산량 분석 방법을 기반으로 한 1) 순간어획사망계수(F)와 2) 어획개시체장(Lc) 변동에 따른 가입당 생산량을 평가하였다. 평가결과 Lc=19-27 cm, F=1.48-2 yr-1일 때, 약 1,830-1,925 g으로 최대생산량을 나타냈으며, Lc변동에 따른 F0.1지점의 생산 량은 Lc=25 cm, F=1.27 yr-1일 때 1,730 g으로 가장 높은 생산량을 나타냈다. 산란 수온 범위로 알려진 15-23℃ 범위에서 수온이 높을수록 가입당생산량이 증가하는 것으로 나타났다. 현행 어업 수준인 F=0.48 yr-1에서 고등어 가입당 생 산량은 Lc=17 cm 일 때 가장 높은 생산량을 얻을 수 있을 것으로 나타났으며, 이 때의 연령은 0.6세로 평가되었다. 현행 고등어 어업 수준을 평가하기 위해 Lc=25 cm일 때 F=0.48 yr-1 과 1.27 yr-1 (F0.1) 지점의 생산량을 비교하면 F=0.48 yr-1일 때 생산량(1,136 g)이 F=1.27 yr-1일 때 생산량 보다 낮기 때문에 지금보다 어획노력량을 늘려도 고등어 자원의 감소 없이 더 많은 생산량을 얻을 수 있을 것으로 평가된다. 대한해협 어류군집 장기변동 평가결과 해양환경 요인 중 표층 수온 변동 이 주요 어종 변동에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 멸치와 고등어 가입당 생산분석을 통해 현행 어업 수준에서 어획노력량을 늘려도 자원 감소 없 이 더 많은 생산량을 얻을 수 있을 것으로 나타났다. 따라서, 현행 어업 수준에 서 나타나는 수산자원 변동 및 감소는 어획보다 해양환경 변동에 더 큰 영향을 받는 것으로 예상된다.

해면에서 분리된 Bacillus megaterium의 probiotics 특성과 넙치의 면역반응 증강 효과

박소현 濟州大學校 2020 국내박사

.The ocean is a vast ecosystem that is home to more than 80% of living organisms, and is one of the most valuable biological resources. Marine organisms found in the ocean are indigenous to special environments compared to those living on land, in terms of salinity, temperature, and chlorophyll, and thus have the ability to produce unique substances and can produce various biologically active substances. Of all the marine life forms, sea sponges are important resources for studying new materials. The emergence of antibiotic resistant bacteria strains has led to an increase in the research for new substances, and the number of bioactive substances that are isolated from marine sponges is also on the rise. These bioactive substances have been reported to be produced by commensal bacteria existing in the sponges. Bacteria in sponges account for more than 40% of their biomass, and amongst the various microorganisms, some of them have been identified as Bacillus species. Bacillus is Gram-positive bacteria that have a bacilli form. Bacillus is also known to produce a variety of substances. Bacillus produces lipopeptides, and the most well-known are surfactin, iturin, and fengycin. These Bacilli are widely used in the aquaculture industry as probiotics. Probiotics produce digestive enzymes that increase digestibility and aid in growth. They also improve immunity and have inhibitory effects on microbes that cause diseases. In order to develop such probiotics, they should not have hemolytic activities, should produce antimicrobial substances, and must survive in strongly acidic digestive juices such as gastric acid and bile acid. In this study, marine-derived bacteria isolated from marine sponges were used to investigate antimicrobial activities, the suitability and stability as a probiotic strain were confirmed, and the probiotic Bacillus megaterium PPR15T, which was chosen for the final selection, was added to halibut feed to examine the potential as a feed additive by observing the growth, non-specific immune response, and disease resistance of the halibuts. In addition, novel candidate strains isolated from marine sponges were classified and identified to confirm that they are indeed new types of strains. As a result of testing for antimicrobial activity of flora isolated from four species of sea sponges against bacteria that cause diseases in fish mainly in inland aquatic farms of Jeju Island, a total of 20 bacterial strains showed a high level of antimicrobial activity. Zones of inhibition were observed as follows: 17 mm for strain PPR15T Edwardsiella tarda, 25 mm for Streptococcus iniae, 21 mm for Streptococcus parauberis, and 20 mm for Photobacterium damselae subsp. damselae. In addition, investigation of strain PPR15T on human health hazard showed that strain PPR15T did not produce urease, which is a known harmful metabolic enzyme, nor did there appear to be pathogenic β-hemolysis. PPR15T could also be cultivated in NaCl of 1-10% concentration, was resistant to acid and base, with the cultivation pH range between 4.0 and 11.0, and was able to grow in a wide temperature range of 10-50 ℃. In addition, resistance was confirmed in a culture medium of pH 2.0 and 3.0 with pepsin and a culture medium with 0.3% and 1% bile salts. As a result of testing for degradation ability of macromolecular organic matter, DNase, cellulase, amylase, digestive enzyme of casein, and lipase activity were confirmed. In addition, the results of phylogenetic analysis confirmed 100% nucleotide sequence similarity with B. megaterium. As a new probiotic, the suitability and safety of strain PPR15T isolated from marine sponges, therefore, were corroborated by excellent antibacterial activity against fish diseases, absence of harmful enzymes or hemolytic activity, high viability against low pH and bile acids, and high ability to degrade polymeric organic substances. Accordingly, the strain was named B. megaterium PPR15T. It is, therefore, considered to be of value as a halibut feed additive in the future, and further experiments on the effects of fish growth, congenital immunity, disease resistance, and so on, were carried out by conducting fish feeding experiments for development as a probiotic. After eight weeks of testing B. megaterium PPR15T additive feeding on halibuts, the growth rate, hematological analysis, non-specific immune response, and disease resistance were investigated. As a result, the increase rate, daily growth rate, and feed conversion efficiency of B. megaterium PPR15T-added group turned out to be higher than the control group. In addition, hematological analysis results showed that ALT, AST, glucose, and triglyceride levels decreased compared to the control group, while those of total protein increased. Also, the phagocytotic activity in serum was maintained at high levels from the second week of the experiment until the final eighth week. Lysozyme activity showed a sharp increase in eight weeks of the B. megaterium PPR15T supplement group compared to the control, and MPO and SOD activities showed the highest activity in six weeks. RNA was extracted from the kidney, intestine, liver, and spleen of the halibut, and the expression levels of immunity genes were examined through qRT-PCR. In the kidney and intestine, the genes of TNF-α, IL-1β, and CD4-1 were expressed higher in the B. megaterium PPR15T group compared to the control group. In addition, only the TNF-α gene in the liver and CD4-1 gene in the spleen showed high expression. From the comprehensive results, therefore, this study confirmed that B. megaterium PPR15T isolated from sea sponges is suitable as a probiotic, and it is believed that B. megaterium PPR15T in feed has potential as probiotics to increase disease resistance in fish by improving the growth of fish and their non-specific immune responses. Also, further experiments are called for to determine the physiological activity produced by B. megaterium PPR15T. A Gram-staining-negative, aerobic, light brown pigment bacterium, designated strain CE80T was isolated from marine sponge Callyspongia elegans in Jeju Island, Republic of Korea. Strain CE80T grew optimally 25°C, in the range of pH 5.0-11.0 (optimum 7.0-8.0), and with 1-5% NaCl (optimum 1-3% (w/v)). Phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequence showed that strain CE80T belonged to the genus Labrenzia and was closely related to L. suaedae YC6927T (98.3%), L. alexandrii DFL-11T (96.6%), L. aggregata IAM 12614T (96.6%) L. marina mano18T (96.5%) and L. alba CECT 5094T (96.2%). The major fatty acids of strain CE80T were C18:1 ω7c, and summed feature. The Polar lipid were diphosphatidylglycer ol (DPG), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), ph osphatidylglycerol (PG), phosphatidylmonomethylethanolamin (PMME), one unidentified aminolipid (AL), one phospholipid (PL) and four unidentified lipids (L). The DNA G+C content of strain CE80T was 55.9 mol%. The major respiratory quinone was Q-10. DNA-DNA relatedness values between strain CE80T and L. suaedae YC6927T was 56.1±2.8%. On the basis of, physiological and biochemical characterization, phylogenetic and chemotaxonomic analysis, strain CE80T represents a novel species of the Labrenzia, for which the name Labrenzia callyspongiae sp. nov., is proposed. The type strain is CE80T (=KCTC 42849T =JCM 31309T). 해양은 거대한 생태계로 살아있는 생물의 80% 이상이 서식하고 있으며, 생물학 적 자원 중 하나이다. 해양에서 서식하는 해양생물은 염분, 온도, 엽록소와 같은 육상과 다른 특수한 환경에 서식하고 있어, 독특한 물질을 생성하는 능력을 가지고 있으며, 다양한 생리활성물질을 생성할 수 있다. 해양생물 중 해면은 새로운 물질 을 연구하는데 중요한 자원이다. 항생제 내성균주의 출현으로 새로운 물질에 대한 연구는 증가하며, 해면에서 분리되는 생리활성 물질의 수도 증가되는 추세이다. 이 러한 생리활성물질은 해면에서 공생하는 세균에 의해 만들어진다고 보고되었다. 해 면은 생체량의 40%이상의 세균을 포함하고 있으며, 많은 미생물 중 일부로 Bacillus 종이 알려져 있다. Bacillus는 그람양성균으로 간균형태를 하고 있는 세 균이다. 이러한 Bacillus는 다양한 물질을 생산한다고도 알려져 있다. Bacillus는 lipopeptide 물질을 생산하며, 대표적으로 잘 알려진 물질은 surfactin, iturin, fengycin 등이 있다. 이러한 Bacillus는 Probiotics로 양식업에서 많이 사용되고 있다. Probiotics는 소화효소를 생산하여 소화율을 높여주고, 성장에도 도움을 준 다. 또한 면역을 향상시켜주어 질병세균에 대한 억제 능력도 가지고 있다. 이러한 Probiotics로 개발하기 위해서는 용혈능이 없고 항균물질을 생산하며, 위산과 담즙 산과 같은 강산의 소화액에서도 생존해야한다. 본 연구에서는 해면에서 분리된 해양유래 세균을 이용하여 어류 질병세균에 대 해서 항균활성을 탐색하였고, Probiotics 균주로서의 적합성과 안정성을 확인하였 으며, 최종 선발된 Bacillus megaterium PPR15T를 넙치 사료에 첨가하였을 때 넙치의 성장, 비특이적 면역반응 및 병 저항성을 확인하여 사료첨가제로서의 가능 성을 알아보고자 한다. 또한 해면에서 분리된 신종후보균주에 대해 분류·동정하여 신종임을 확인하였다. 4종의 해면에서 분리된 균주를 제주도 육상 양식장에서 주로 발생하는 어류 질 병 세균에 대한 항균활성을 확인한 결과, 총 20 균주가 모두 높은 항균활성을 나 타냈다. PPR15T는 Edwardsiella tarda에 17 mm, Streptococcus iniae에 25mm, Streptococcus parauberis에 21 mm, Photobacterium damselae subsp. damselae에 대해서 20 mm의 억제환이 나타났다. 또한 PPR15T의 인체유해성 조사결과 유해대사산물로 알려진 urease를 생성하지 않았으며, 병원성인 β-용혈현상이 나타나지 않았다. 또한 1-10% 농도의 NaCl에서 도 생육이 가능하였으며, 생육 pH 범위는 4.0-11.0으로 내산성과 내염기에 강했으 며, 10-50℃의 넓은 온도 범위에서도 생장이 가능했다. 또한, pH 2.0과 3.0에서 pepsin이 첨가된 배지와 0.3%와 1% bile salt가 첨가된 배지에서 내성을 확인되 었다. 고분자유기물질 분해능을 실시한 결과 DNase, cellulase, amylase, casein 분해효소, lipase활성을 확인하였다. 또한 계통학적 분석 결과 Bacillus megaterium과 100%의 염기서열 유사도를 확인하였다. 따라서 해면에서 분리된 PPR15T는 어류질병에 항균활성이 우수하며 유해효소와 용혈현상이 나타나지 않았고 낮은 pH와 담즙산에 높은 생존능력을 가지고 있고, 고분자 유기물질분해능이 뛰어남으로 신규 Probiotics 균주로서 적합성과 안전성 을 확인하였으며, B. megaterium PPR15T로 균주를 명명하였다. 이에 따라 넙치 사료첨가제로써의 가치가 있다고 사료되며, 생균제로서 개발을 위해 어류 급이 실험을 수행하여 어류성장에 미치는 효과, 선천성 면역 및 질병 저항성 등에 대한 추가실험이 진행하였다. 8주간 넙치를 대상으로 B. megaterium PPR15T 첨가 사료 급이 실험 후 성장도, 혈액학적 분석, 비특이적 면역반응, 질병 저항성에 대해 조사하였다. 그 결과, 대조구와 비교했을 때, Bacillus megaterium PPR15T 첨가구의 증체율, 일간성장률, 사료전환효율이 높아짐을 확인하였다. 또한 혈액학적 분석 결과, ALT, AST, glucose, triglyceride가 대조구에 비해 감소하였 으며, total protein은 증가하였다. 또한 혈청의 식세포 작용은 실험 시작 2주차부 터 끝나는 8주차까지 높은 활성이 유지되었다. Lysozyme은 대조구와 비교했을 때 B. megaterium PPR15T 첨가구에서 8주차에 급격히 증가함을 보였으며, MPO와 SOD 활성은 6주차 가장 높은 활성을 나타냈다. 넙치의 신장, 장, 간, 비장에서 RNA를 추출하였고, qRT-PCR을 통해 면역유전자의 발현량을 조사하였다. 신장과 장에서는 대조구보다 B. megaterium PPR15T에서 TNF-α, IL-1β, CD4-1의 유전 자가 높은 발현량을 나타냈다. 또한 간에서는 TNF-α, 비장에서는 CD4-1의 유전 자만 높은 발현량을 나타냈다.따라서 종합적인 결과를 볼 때, 본 연구에서는 해면에서 분리된 B. megaterium PPR15T가 Probiotics로의 적합함을 확인하였으며, 사료 내 B. megaterium PPR15T는 어류의 성장과 비특이적 면역반응을 향상시켜 어류질병세 균에 대한 저항성을 높일 수 있는 Probiotics으로서 가능성이 있다고 사료된다. 또 한 B. megaterium PPR15T이 생산하는 생리활성을 파악하고자 추가적인 실험이 필요하다고 된다고 판단된다. 또한 해면 Callyspongia elegans에서 분리된 신종후보균주 CE80T은 그람음성 균으로 호기성이며, 밝은 갈색을 띄고 있다. 신종후보균주 CE80T균주는 pH 범위 5.0-11.0 (최적 7.0-8.0), NaCl 범위는 1.0-5.0% (최적 1-3% (w/v)), 최적온도 25°C에서 생장했다. 16S RNA 염기서열 (1384 bp)을 기초한 계통학적 분석 결과 Labrenzia 속의 균주들과 높은 유사도를 보여주었으며, L. suaedae YC6927T (98.3%), L. alexandrii DFL-11T (96.6%), L. aggregata IAM 12614T (96.6%), L. marina mano18T (96.5%) 그리고 L. alba CECT 5094T (96.2%)와 가까운 유 사도를 보여주었다. CE80T의 Draft assembled genome size는 4,737,804 bp로 확인된 contig는 7개로, N50 length는 3,393,935 bp를 얻었다. Strain CE80T과 표준균주 L. suaedae YC6927T 사이의 ANI (average nucleotide identity) values은 83.7%로 종 동정에 대한 95-96% 기준치보단 낮게 나왔으며 신종으로 여겨진다. 주요지방산은 C18:1ω7c (66.7%), summed feature 2 (C14:03-OH/ iso-C16:1I) (10.2%)이다. 또한 주요 polar lipid는 diphosphatidylglycerol (DPG), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphati dylglycerol (PG), phosphatidylmonomethylethanolamin (PMME)과 하나의 알려 지지 않은 aminolipid와 알려지지 않은 2개의 lipid를 확인하였다. CE80T의 DNA G+C content 결과 55.9 mol%이며, 퀴논은 Q-10으로 분석되었다. CE80T와 L. suaedae YC6927T 사이의 DNA-DNA hybridization 실험 결과 56.1±2.8%으로 확인하였다. 이 값은 70% 미만으로 나타날 경우 신종으로 보고될 수 있다. 계통학 적, 형태학적, 생화학적 및 화학분류학적 분석 결과를 토대로 strain CE80T는 Labrenzia 속의 새로운 종임을 확인하였으며, 이를 Labrenzia callyspongiae 로 명명하였다

Investigation of the gut microbiome in marine organisms and their metabolic prediction

이준형 강릉원주대학교 대학원 2023 국내석사

Recent advances in the high-throughput sequencing technologies provided understanding of the interaction between the physiological characteristics of host animals and their gut microbiome. Nonetheless, fundamental information of gut microbiome in marine organisms is still limited compared to terrestrial animals. The aim of this study is to investigate the gut microbiomes of marine organisms. Total 48 gut samples were collected from five marine animal hosts (fish: Muraenesox cinereus (N=7), Paralichthys olivaceus (N=4), Oncorhynchus keta (N=2); crustaceans: Chionoecetes opilio (N=28), and gastropods: Haliotis discus hannai (N=7)). The bacterial community composition and diversity indexes were determined from the 48 gut microbiome through DNA metabarcoding approach using MiSeq platform with 16S rRNA gene (V3-V4 region). 16S rRNA gene sequences were clustered into 17,829 ASVs (Amplicon Sequence Variants). Alpha-diversity metrics (Chao1 and ACE diversity indices) were calculated to evaluate gut microbiome diversity of each host animals. The results revealed that P. olivaceus had the highest indices, and M. cinereus and O. keta exhibited the lowest indices of bacterial diversity. The bacterial beta-diversity of host animals was calculated using ASVs (N=17,829) and was projected by PCoA (Principal Coordinate Analysis), in which their clustering patterns suggest local bacterial communities in each host animals. Moreover, the PERMANOVA (Permutational Multivariate Analysis of Variance) revealed a significant difference of bacterial diversity between host animals (R2=0.41, P < 0.01). The 13 ASVs were determined to identify the host core microbiome and were taxonomically classified through the NCBI BLAST website(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). These determined taxa have been revealed to be related to the characteristics of the host animal. As a representative examples of the classification, the carnivorous fish M. cinereus was classified into the genus Vagococcus, which is related to the bacterial fermentation of carcasses in the gut, and the anadromous fish O. keta was classified into the genus Flavobacterium, these were related to the water-resistant pathogens of fish. Additionally, the fish P. olivaceus, grown in aquaculture, was classified into the genus Novosphingobium, which is related to activated sludge. The crustacean C. opilio, living in the deep sea, was classified as Psychrilyobacter, which is abundant in the low-temperature deep sea in the gut of host. Finally, In H. discus hannai a herbivorous gastropod, the genus Mycoplasma was classified that plays a role in producing lactic acid and acetic acid by decomposing proteins and oligosaccharides. Metabolic process of the gut microbiomes was predicted using PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States). Our prediction suggests the gut microbiomes of marine organisms seem to be related to habitat- specific host, diet- specific host, and stress-specific host. 최근 고 처리량 시퀀싱 기술의 발전으로 숙주 동물의 생리적 특성과 장내 미생물 군집 간의 상호 작용에 대한 이해는 확장 되었다. 그럼에도 불구하고, 숙주 동물 중 해양 생물의 장내 미생물 군집에 대한 기본 자료는 육상 동물에 비해 여전히 제한적인 정보만 있다. 이러한 이유로, 본 연구의 목적은 해양 생물의 장내 미생물 조사하는 것이다. 해양 생물 5종의 숙주 동물 (어류: Muraenesox cinereus (N=7), Paralichthys olivaceus (N=4), Oncorhynchus keta (N=2), 갑각류: Chionoecetes opilio (N=28) 및 복족류: Haliotis discus hannai (N=7)) 에서 총 48개의 장내 샘플을 수집 하였다. 48개의 장내 미생물 군집 에서 박테리아 구성 및 다양성 지수는 16S rRNA 유전자 (V3-V4 영역)가 포함된 Miseq 플랫폼을 사용한 DNA 메타바코딩 통해 조사 및 측정하였다. 16S rRNA 유전자 서열은 17,829개의 ASVs(Amplicon Sequence Variants)로 클러스터링 되었다. 각 숙주 동물의 장내 박테리아 군집 다양성을 평가 하기 위해 Alpha diversity 지수 (Chao1 및 ACE 다양성 지수)를 계산하였다. 그 결과 P. olivaceus가 가장 높은 다양성 지수 측정되었으며, M. cinereus 와 O. keta 는 가장 낮은 장내 박테리아 다양성 지수로 측정되었다. 숙주 동물의 장내 bacterial 군집 Beta diversity는 ASVs(N=17,829) 이용하여, 생물학적 거리 측정법 (Unifrac distance) 으로 측정된 거리 행렬을 기반으로 PCoA (Principal Coordinate Analysis) 로 가시화 되었으며, 숙주 동물 그룹에 따른 장내 박테리아 군집의 공간적으로 분리되는 경향을 보여주었다. 이러한 결과는, 숙주 동물의 그룹간의 특이적인 장내 박테리아 군집 구성을 제안하였다. 또한, PERMANOVA (Permutational Multivariate Analysis of Variance)를 통해 숙주 동물 그룹간 장내 박테리아 군집 다양성을 평가 하였으며,이는 유의적인 차이를 보여주었다. (R2=0.41, P < 0.01). 각 숙주 동물에 따라 공통적이고 지배적으로 관찰이 되는 장내 미생물 군집인 핵심 미생물 군집은 13ASVs가 결정 되었으며, NCBI blastn 웹사이트 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 를 이용하여 분류학적으로 분류 하였다. 이러한 결정된 핵심 미생물 군집 분류군 과 숙주 동물 사이의 관련성을 보여주었다. 예를 들어 육식성 어류인 M. cinereus 의 핵심 미생물 군집 사체의 세균 발효와 관련된 Vagococcus 속으로 분류되었고, 소하성 어류인 O. keta 의 핵심 미생물 군집은 Flavobacterium 속이 분류 되었으며, 이 분류군 은 어류의 내수성 병원균과 관련 있음을 보고하였다. 또한, 양식 어류인 P. olivaceus 에서는 폐수 공정에 관여하는 Novosphinogobium 속 분류군이 핵심 미생물 군집으로 결정되었다. 심해에 서식하는 C. opilio 는 저온 심해에서 숙주 동물 장에 보편적으로 서식하는 Psychrilyoacter 속 분류군이 결정되었다. 마지막으로 초식성 복족류인 H. discus hannai 의 핵심 미생물 군집은 단백질 및 올리고당을 분해하여 젖산과 초산을 생성 역할을 하는 Mycoplasma 속으로 분류 되었으며, 이는 다양한 복족류 종에서 관찰이 되는 핵심 미생물 군집으로 보고되었다. 장내 미생물 군집 의 대사 경로는 PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States) 를 사용하여 예측 되었다. 본 연구의 장내 미생물 군집의 대사 과정의 예측 결과로는, 해양 생물의 장내 미생물 군집은 숙주의 특이적인 서식지, 식이 습관 및 기타 스트레스와 관련이 있는 것으로 사료된다

Ecological and physiological responses of macroalgae to climate and environmental changes: From population to community levels

최선경 제주대학교 대학원 2021 국내박사

해양에서 분리된 방선균을 이용한 항생제 내성균의 항균활성에 관한 연구

한용재 제주대학교 대학원 2011 국내석사

43 strains of marine actinomycetes were isolated from marine soil sources in Jeju island. They were characterized by morphological and physio-biochemical properties, and the API 50CHB test. They were further confirm by molecular methods including partial sequencing of 16S rRNA. The phylogenic relationship and taxonomic position of the domain bacteria was investigated by performing a comparative sequence analysis of PCR-amplified 16S ribosomal RNA A neighbor-joining tree of partial 16S rRNA sequences divided in to 3 isolated HK-A13, HK-A43, HK-A44 of bacterial strains. major are, Gram positive bacteria/ Actinobacteria / Actinomycetales(order)/ Streptomycineae (suborder)/ Streptomycetaceae(family)/ Streptomyces(100%). All the 43 strains of Actinomtcetes, were grew in the various range of NaCl, pH and temperature. As the result, three strains of HK-A13, HK-A43, HK-A44 were for most similar to Streptomyces were named as Streptomyces sp. HK-A13 and Streptomyces sp. HK-A43, Streptomyces sp. HK-A44. HK-A13, HK-A43 and HK-A44 strains were showed that best growth on temperature between 20℃~40℃, and pH between 6~7. Streptomyces sp. HK-A13. showed 1% sucrose for carbon source and 1% ammonium nitrate for nitrogen source, and Streptomyces sp. HK-A43 showed 1% sucrose for carbon source and 1% yeast extract for nitrogen source, and Streptomyces sp. HK-A44 showed 1% lactose for carbon source and ammonium chloride or malt extract for nitrogen source indicating that it has the highest growth. As the Minimum InhInhtion Concysiration (MIC) result, methanol extraction from culture liquid of Streptomyces sp. HK-A13 was verified sp. Streptomyces sp. HK methanol extracts very high antimicrobial activation depending on density with Streptococcus parauberis SP-001, 003, 015, 044, 048, 060, 063, 065, 066, Proteus rettgeri CCARM 0263, Bacillus anthrasis CCARM 0217, SStreptococcus faecium CCARM 0210, Klebsiella pneumoniae CCARM 10258, Pseudomonas aeruginosa CCARM 0225 at 50㎎/㎖, Micrococcus luteus CCARM 0022, Staphylococcus aureus CCARM 0201, Enterobacter cloacae CCARM 0253 at 25㎎/㎖, Burkholderia cepacia CCARM 0226 at 6.3㎎/㎖. Methanol extraction of Streptomyces sp. HK-A43 had no sensitivity against human and fish diseases antibiotic-resistance bacteria other than Streptococcus parauberis SP-066, Micrococcus luteus CCARM 0022, Burkholderia cepacia CCARM 0226, Streptococcus faecium CCARM 0210, Enterobactrer cloacae CCARM 0253 causing human pathogen and fish diseases antibiotic-resistance bacteria. Methanol extraction of Streptomyces sp. HK-A44 in showed high sensitivity against Streptococcus parauberis SP-015, 044, 066, Micrococcus luteus CCARM 0022, Burkholderia cepacia CCARM 0226, Streptococcus faecium CCARM 0210 at 50 ㎎/㎖ and vibriosis causing fish diseases antibiotic-resistance bacteria Streptococcus parauberis SP-003, 063, 065 at 25㎎/㎖. The antioxidation activation of (DPPH radical scavenging activation) for each density of methanol extraction from isolated strains broth, was 1.4% HK-A13 at 0.05㎎/㎖, 14% for 0.25㎎/㎖, 25% for 0.5㎎/㎖ and 93% for 0.5㎎/㎖. (HK-A44 showed the RSA was 20%). Although there is no meaningful difference for Streptomyces broth methanol extract HK-A43. The antioxidation activities of 23% for addition of Streptomyces Broth methanol Extract HK-A13 way 0.25㎎/㎖ and 12 % 2.5㎎/㎖, and 83% 80% at 2.5㎎/㎖ of density. The result of Alkyl radical scavenging activity all tested bacterial showed signiticantly increased antioxidation activity at 0.25㎎/㎖. Extraction of HK-A13 atrain at 2.5㎎/㎖ showed the highest radical scavenging activation of 86%.

제주 연안에서 분리한 해양유래 방선균 Streptomyces carpaticus MK-01의 형태학적·생화학적 동정 및 어류질병균주에 대한 항균활성탐색

김민선 제주대학교 대학원 2015 국내석사

In this study, actinomycetes were isolated from seawater collected from Daejeong-coast of Jeju Island, to evaluate its antibacterial activity against fish pathogens. About 24 actinomycetes strains were isolated and identified using physiological, biochemical and molecular tools. Light microscopic observation of MK-01 strains hows gray spores bearing darkbrown mycelia colony which produce purple pigment. MK-01strain was found to have extensive antibacterial activity against S. iniae, S. parauberis, V.anguillarum, E. tarda. The optimum culture condition such as temperature, pH and NaCl(%) concentration required pH 6~7, 30℃ and 2% respectively. The results of biochemical and physiochemical studies revealed that the best carbon source, organic nitrogen source and mineral source for cell growth and antibacterial activity are dextrose, tryptone, and MgSO4·7H2O respectively. Ethyl acetate and Methanol treated fractions of MK-01 culture supernatant were used for the antibacterial assay. Minimum inhibitory concentration (MIC) of Methanol and Ethyl acetated fractions were about 31.25 ㎍/㎖ 32.5 ㎍/㎖, 1000 ㎍/㎖ in the S. iniae, S. parauberis and V. anguillarum respectively while the minimum bacterial concentration (MBC) were found to be 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1000 ㎍/㎖ for S. iniae, S. parauberis and V. anguillarum Phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences of the strain MK-01 shows the high similarity to Streptomyces carpaticus (97.63%). DPPH radical scavenging activity of different methnol fraction of MK-01 culture showed 31.25㎍/㎖ for 13%, 62.5㎍/㎖ for 15%,, 125㎍/㎖ for 19%, 250㎍/㎖ for 22%, 500㎍/㎖ for 23% and 1000㎍/㎖ for 29% and Ethyl acetate fraction showed 31.25㎍/㎖ for 9%, 62.5㎍/㎖ for 11%,, 125㎍/㎖ for 19%, 250㎍/㎖ for 20%, 500㎍/㎖ for 21.12% and 1000㎍/㎖ for 26% Hydroxyl radical scavenging activity for methnol fraction showed 31.25㎍/㎖ for 13%, 62.5㎍/㎖ for 16.68%,, 125㎍/㎖ for 23.87%, 250㎍/㎖ for 38.2%, 500㎍/㎖ for 42.9% and 1000㎍/㎖ for 58.8% and for Ethyl acetate fraction showed 31.25㎍/㎖ for 9.32%, 62.5㎍/㎖ for 14.68%,, 125㎍/㎖ for 20.78%, 250㎍/㎖ for 29.2%, 500㎍/㎖ for 39.8% and 1000㎍/㎖ for 49.9% Dietary effect of MK-01 supernatant on non-specific immune response such as Lysozyme activity and Phagocytic activity of Olive flounder was assessed with 3% of supernatant mixed flounder feed.

Marine-derived bioactive compound regulates obesity through leptin signaling pathway

강나래 제주대학교 대학원 2016 국내박사

Obesity Overweight and obesity are conditions that results in an abnormal or excessive fat accumulation that might have a negative effect on human health (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/en/). In normal physiological condition, the body weight is maintained by keeping an energy balance between intake and expenditure. Failure of the energy homeostasis, however, increases the body weight, and eventually leads to overweight and obesity (Klok, Jakobsdottir, & Drent, 2007). Body mass index (BMI) is a commonly used parameter to classify overweight and obesity in adults. BMI is defined as a body weight in kilograms divided by the square of height in meters (kg/m2). World Health Organization (WHO) defines overweight and obesity by using following BMI levels; a BMI ≥ 25 is overweight, a BMI ≥ 30 is obesity. Worldwide obesity rate Recently, obesity is rapidly increasing around the world and that has affected on both gender and age (Sáinz, Barrenetxe, Moreno-Aliaga, & Martínez, 2015). The worldwide prevalence of obesity has more than doubled between 1980 and 2014. According to the WHO report estimated in 2014, more than 1.9 billion adults, aged 18 years and older, were overweight. Among them, over 600 million were found to be obese. By definition, 39% of adults were overweight and 13% of them were obese. Moreover, 42 million children, under the age of 5, were overweight or obese in 2013. Complications of obesity Obesity is closely associated with various metabolic disorders including dyslipidemia, cardiovascular disease, stroke, insulin resistance, and type 2 diabetes (Zhou & Rui, 2013). Chronic inflammation in adipose tissues may play a critical role in the development of obesity-related metabolic dysfunctions. Thus, obesity increases the risk of developing a variety of pathological conditions, including insulin resistance, dyslipidemia, type 2 diabetes, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), hypertension, coronary heart disease, ischemic stroke and several cancer conditions. (Ladenheim, 2015), (Jung & Choi, 2014), (R. Yang & Barouch, 2007). Cause of obesity: imbalance The fundamental cause of obesity and overweight is a long-term energy imbalance between the consumption and expenditure of calories. The energy homeostasis is maintained by two kind of hormones; leptin and ghrelin. Leptin suppresses food intake and thereby induces weight loss. Ghrelin, on the other hand, plays a role in meal initiation (Klok, Jakobsdottir, & Drent, 2007) Imbalance results in leptin resistance The failure of leptin signaling to suppress food intake and mediate weight loss is commonly referred to as leptin resistance. In this condition, obese individuals do not respond to leptin in an adequate manner (Balland & Cowley, 2015). Thus, high circulating leptin levels are observed in obese human, contrary to theory that absence of leptin leads to obesity (Carter, Caron, Richard, & Picard, 2013; Myers, Cowley, & Münzberg, 2008). Leptin signaling pathway Leptin, a hormone derived from lep gene, is produced and secreted predominantly from white adipose tissues into the circulation and regulates food intake and energy homeostasis in body (Meister, 2000). The central regulation is mediated through the binding of leptin to its receptor, ObR in central nervous system (CNS) (Roujeau, Jockers, & Dam, 2014). Circulating leptin crosses the blood-brain barrier (BBB) through a receptor-mediated endocytosis mechanism and acts on ObR expressed in distinct regions of brain, including arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus (Crujeiras, Carreira, Cabia, Andrade, Amil, & Casanueva, 2015). Marine natural products Ocean, covering more than 70% of the earth's surface, is a rich repository of natural resources. Among the total number of species, 80% are living in the ocean ecosystem and are rapidly evolving as an abundant biomass. Moreover, the marine organisms live in an exigent, competitive and aggressive environment that could have resulted in the production of structurally diverse secondary metabolites. These materials include polysaccharides, polyunsaturated fatty acids (PUFA), algal polyphenols, phytocholesterols, pigments, and peptides. The materials have potentials to improve health condition and reduce the risk of diseases. Before several years, a number of novel compounds have been found from marine organisms and their bioactivities have extensively been studied. These marine natural products possess antioxidant, antihypertensive, anti-inflammatory, antidiabetogenic, and anti-cancer activity. These studies are basis for the development of marine organisms as healthy and functional food ingredients. Phlorotannins Marine organisms are rich sources of structurally diverse bioactive compounds with various biological activities. In particular, brown algae contain a variety of bioactive compounds including phlorotannins, polysaccharides, and pigments. Among them, phlorotannins, polymers of phloroglucinols (1,3,5-trihydroxybenzene), possess a variety of biological activities and potential health benefits such as antioxidant activity (A.-R. Kim, Shin, Lee, Park, Park, Yoon, et al., 2009), anti-diabetic activity (Lee, Kang, Ko, Moon, Jeon, Lee, et al., 2014), (Lee, Kang, Ko, Kang, & Jeon, 2013), antihypertensive effects (Li, Wijesekara, Li, & Kim, 2011), matrix metalloproteinase inhibition effect (M.-M. Kim, Van Ta, Mendis, Rajapakse, Jung, Byun, et al., 2006), and anticancer activity (S. J. Park, Kim, & Jeon, 2012), (Y.-I. Yang, Ahn, Choi, & Choi, 2015). Phlorotannins could have the potential and the possibility to develop new functional foods and pharmaceuticals to improve human health (Li, Wijesekara, Li, & Kim, 2011). Objectives of the study In this study, we searched for a prospective leptin substitute among natural marine products, and investigated its anti-obesity effects. To select candidates, from marinederived natural products affecting the leptin signaling pathway, an in silico analysis was performed using the crystal structure of the leptin receptor (PDB ID: 3V6O). Among the examined natural marine products, octaphlorethol A (OPA) derived from Ishige sinicola, and pyrogallol-phloroglucinol-6,6-bieckol (PP) derived from Ecklonia cava, brown algae found along the coast of Jeju Island, Korea, favorably docked to the leptin receptor. Of the candidates that favorably docked to the leptin receptor, OPA (0.1 μg/mL) stimulated the leptin signaling pathway, including STAT5, in hypothalamic N1 neuron cell line. To investigate the anti-obesity effects of OPA through the leptin signaling pathway, 0.25 mg/kg OPA was orally administrated to C57BL/6J obese mice fed on a high-fat diet for 4 weeks, and the leptin signaling pathway was analyzed in the brain, white adipose tissues, liver, and muscle. C57BL/6J obese mice treated with OPA showed reduced body weight and food intake compared to that observed in control obese mice. Furthermore, OPA stimulated leptin receptors, and activated phospho- STAT5 in the hypothalamic arcuate nucleus (ARC). Moreover, OPA activated leptin signaling in all peripheral tissues including white adipose tissues, liver, and muscle. It also reduced the fat size, hepatic steatosis, and regulated glucose metabolism. These results indicate that OPA, a marine-derived bioactive compound, regulates obesity through the leptin signaling pathway in both appetite control via the central nervous system and energy homeostasis via the peripheral nervous system in obese mice fed on a high-fat diet. 현대 질병-비만 서구화된 식습관을 비롯한 운동의 부족, 과도한 업무로 인한 스트레스 등의 사회 적 변화는 다양한 현대 질병을 야기하였다. 체내 에너지 대사의 불균형에 따라 발 생하는 비만, 당뇨, 고혈압과 같은 대사성 질환이 대표적인 현대 질병이다. 특히 비 만은 과거에는 외형적, 미용적 문제로만 여겨졌으나 최근 전 세계적으로 비만 발생 률이 높아지고 있으며, 과체중이나 비만을 넘어서 고도비만에 이르러 문제가 심각 해지면서 점차 질병으로 인식되고 있다. 이에 따라 세계보건기구에서는 비만을 ‘건 강에 해가 될 정도로 비정상적이거나 과도하게 지방이 축적된 상태’라고 정의하였 으며, ‘21세기 신종 전염병’이라고 지목하면서 그 위험성에 대하여 경고하고 있다. 비만의 지표 성인의 과체중 또는 비만을 구분하는 지표로서 체질량지수 (Body Mass Index; BMI) 가 가장 보편적으로 사용되고 있으며, 이 수치는 신장(m)의 제곱에 대한 체중 (kg/m2)을 나타낸다. 세계보건기구에서는 인종이나 성별에 관계없이 체질량지수 25 kg/m2 이상을 과체중, 30 kg/m2 이상을 비만으로 정의하였다. 그러나 우리나라를 비롯한 아시아인의 경우 체질량지수 25 kg/m2를 시점으로 비만 관련 질환 발병률 이 1.5~2 배로 증가하며, 그 이하에서도 비만과 연관되어 있다고 알려진 당뇨병 및 심혈관계질환 위험이 나타나고 있다. 또한 동일한 체질량지수에서 서양인에 비해 상대적으로 복부지방과 체지방률이 높다. 따라서 세계보건기구 아시아태평양 지역 과 대한비만학회에서는 아시아인의 과체중의 기준을 체질량지수 23 kg/m2 이상, 비 만의 기준을 25 kg/m2 이상으로 정의하고 있다. 비만 문제의 심각성-비만 유병률 및 비만 합병증 세계보건기구에서 2016년 6월에 발표한 보고에 따르면 2014년에 전 세계 성인 (18세 이상) 19억 명 이상이 과체중이며, 이 중 6억 명 이상이 비만인 것으로 나타 났다. 이는 전 세계 18세 이상 성인의 39%가 과체중이고, 13%가 비만임을 의미한 다. 또한 4천 1만 명의 5세 이하의 어린이들이 과체중 또는 비만인 것으로 나타났 다. 이러한 세계 비만 유병률은 1980년보다 2배 이상 증가한 수치이다. 우리나라의 만 19세 이상 성인의 비만 유병률도 1998년 26.0%에서 2013년 31~32%로 증가하 였고, 특히 남성의 비만 유병률은 35~37%인 것으로 나타나 여성보다 남성의 비만 유병률이 높다고 보고되었다 (2013 국민건강통계, 보건복지부). 한편, 비만 인구의 증가와 함께 제 2형 당뇨병 및 대사증후군의 발병률이 증가하 고 있다. 비만은 인슐린 저항성을 일으켜 대사 합병증인 이상지질혈증, 고혈압, 당 대사 장애, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 심혈관계 질환, 뇌졸중, 담낭질환, 신장질환, 간 기능 부전, 근골격계 질환, 관절염, 수면장애, 악성신생물 등의 각종 합병증을 야기 한다. 또한 BMI가 35~40 kg/m2인 경우 사망위험이 정상인보다 2~8 배 높으며, 고 도비만 (> 40 kg/m2)환자의 사망률은 정상인보다 12배 높다. 비만의 치료-비만치료제 비만 치료를 위해서는 생활 습관을 개선하는 생활요법이 가장 중요하지만, 생활 습관 개선이 어렵거나 비만의 정도가 심한 경우, 비만 치료를 돕기 위해 여러 가지 비만치료제가 개발되어 판매되고 있다. 일반적으로 비만치료제는 약물 기전에 따라 크게 지방흡수저해제와 식욕억제제로 구분할 수 있다. 현재 상용되고 있는 비만치료제의 종류로는 1994년 4월에 미국 FDA (Food and Drug Administration)의 승인을 받아 최초로 공인받은 약제로 기록되고 있는 올리스 타트 (Orlistat)와 2012년에 승인을 받은 펜터민/토피라메이트 병합제 (Phentermine/topiramate; Qsymia)와 로카세린 (Lorcaserin; Belviq), 2014년에 승인을 받은 날트렉손/부프로피온 병합제 (Naltrexone/bupropion; Contrave)가 있다. 올리스 타트 (Orlistat)와 함께 기존에 사용되던 시부트라민 (Sibutramine)은 심혈관질환 또 는 당뇨병이 있는 환자를 대상으로 시행한 연구에서 혈압과 맥박을 증가시키고, 관 상 동맥질환, 울혈성 심부전, 부정맥, 뇌졸중 등의 심혈관질환이 발생하는 부작용을 보여, 2010년 10월 이후로 전 세계적으로 사용이 중단되었다. 올리스타트 (Orlistat)는 지방분해효소인 췌장의 라이페이즈 (lipase) 억제제로서 음 식물에 포함된 지방의 분해 및 흡수를 억제한다. 따라서 섭취한 지방의 약 30%는 소화 및 흡수되지 않고 그대로 몸 밖으로 배출된다. 반면, 펜터민/토피라메이트 병 합제 (Phentermine/topiramate)의 펜터민 (Phentermine), 로카세린 (Lorcaserin), 날트 렉손/부프로피온 (Naltrexone/bupropion)은 식욕억제 기전을 갖는 비만치료제이다. 펜터민 (Phentermine)은 흥분성 신경전달물질 분비를 통해 식욕을 억제하는 약물이 고, 로카세린 (Lorcaserin)은 세로토닌 계열의 식욕억제제로서 세로토닌2C수용체 (5- HT2C receptor)에 선택적으로 작용하는 약물이다. 날트렉손과 부프로피온 (Naltrexone/bupropion)은 시상하부와 중뇌 변연계 (Limbic system)의 보상중추에 작용하는 식욕억제제이다. 비만치료제의 부작용 이러한 약물들은 전임상 및 임상연구를 통해 항비만 효과가 검증되어 있지만, 약 물의 기전에 따라 메슥거림, 불면증, 소화 불량, 심혈관질환, 정신질환 등의 여러 가 지 부작용도 나타나고 있다. 또한 올리스타트 (Orlistat)를 제외하고 최근 FDA의 허 가를 받은 비만치료제의 경우, 임상 연구기간이 2년 정도로 짧아 장기간 복용시의 안전성에 대한 연구가 부재한 실정이다. 그럼에도 불구하고 환자의 상태를 고려하 지 않거나, 관리기관의 권고 사항을 무시한 비만치료제의 오남용 또는 과다처방으 로 심각한 부작용의 사례가 발생하고 있다. 현재 상용중인 식욕억제제의 문제점 특히 현재 상용되고 있는 몇몇 식욕억제제는 근본적인 식욕억제 기전을 따르는 약 제가 아니라, 뇌에서 배고픔을 덜 느끼게 하거나, 포만감을 느끼게 하는 기전으로 마약류 (향정신성의약품)로 분류되어 있다. 이는 약제 의존성이나 내성이 발생할 수 있으며, 두근거림, 혈압상승, 가슴통증, 현기증, 불안, 초조, 불면, 흥분 등에서부터 장기간 복용할 경우, 폐동맥 고혈압, 심장실환, 정신분열 등의 심각한 부작용이 나 타날 수 있다. 근본적 식욕억제의 기전-렙틴 (Leptin) 식욕의 항상성은 그렐린 (Ghrelin)과 렙틴 (Leptin)이라는 두 가지의 호르몬이 관여 하는데, 위 (Stomach)에서 분비되는 그렐린 (Ghrelin)에 의해 식욕자극 및 에너지 대 사 억제가 일어나고, 지방 (Fat)에서 분비되는 렙틴 (Leptin)에 의해 식욕억제 및 에 너지 대사가 일어난다. 각 조직에서 그렐린 (Ghrelin) 또는 렙틴 (Leptin)이 분비되면, 뇌의 시상하부에서 식욕 기능을 담당하는 프로오피오멜라노코르틴 (Proopiomelanocortin, POMC) 신경세포와 아구티-관련 펩타이드 (Agouti-related peptide, AgRP) 신경세포에 존재하는 각각의 수용체 (Receptor)에 작용하여 신호를 일으킨다. 대개의 비만 환자의 경우, 혈중 렙틴 (Leptin)의 수치가 정상범위를 초과 하는 렙틴저항성 (Leptin resistance)을 나타낸다. 이는 지방세포에서 분비된 렙틴 (Leptin)이 렙틴 수용체에 결합하고, 그 신호가 세포 내로 전달되는 각 단계에서의 구조적 결함에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 그러나 렙틴저항성 (Leptin resistance)이 식욕 억제를 방해하고 비만을 유발하는 중요한 원인임에도 불구하고 이를 개선하는 비만 치료제 연구 개발이 부족한 실정이다. 식의약소재로서의 해양생물자원의 가치 해양은 지구 전체 면적의 70%를 차지하고 있으며, 지구 생물종의 80%가 해양에 서식하는 생물 자원의 보고이다. 또한 해양생물은 육상생물과는 전혀 다른 환경에 서 서식하여 다양한 자기방어 기제로 구조적으로 특이하고 다양한 2차 대사산물을 생산한다. 이러한 천연물은 합성 의약품과 달리 부작용이 없기 때문에 최근 신의약 품 소재 개발 연구에 활용되고 있다. 해조류에는 미네랄, 비타민, 다당류 및 폴리페놀이 풍부하게 함유되어 있다. 특히 해조류의 폴리페놀은 항산화, 항암, 항염, 항염증 등 다양한 활성 성분이 알려져 있 다. 하지만 육상식물 유래의 폴리페놀의 대사성질환 치료제, 비만, 당뇨, 고혈압에 대한 치료제로써의 연구는 다양한 방면에서 연구되고 있으나 해조류에서의 폴리페 놀의 대사성 질환 치료제로써의 연구는 미흡한 실정이다. 연구의 목적 따라서 이 연구에서는 비만 개선 및 치료물질로서 렙틴/렙틴리셉터의 작용을 이용 한 해양 천연물 유래 신의약 소재를 탐색하였다. 이를 위하여 제주 자생 해조류에 서 분리된 다양한 플로로탄닌 (phlorotannin) 계열의 컴파운드를 대상으로 leptin signaling pathway를 통한 항비만 효과를 검증하여 기능성 의약품 소재로서의 개발 가능성을 확인하였다. Part 1에서는 in silico study를 통하여 총 13가지 컴파운드를 대상으로 Leptin receptor의 결합부위에 대한 ligands 결합 친화도 (docking energy)를 비교 분석하 였으며, 이 중 가장 높은 결합 친화도를 나타내는 컴파운드를 선정하였다. 또한 선 정된 컴파운드의 leptin signaling pathway를 통한 식욕억제 효과를 검증하기 위하여 Leptin signal이 일어나는 주요 세포인 hypothalamic N1 neuron cell을 실험에 사용 하였다. Part 2에서는 Part 1의 연구결과로 선정된 compound의 Leptin signal을 통한 식욕 억제 효과를 in vivo study로서 검증하였다. 동물은 C57BL/6J를 사용하였고, 총 10주 의 실험 기간 동안 45 kcal 고지방 사료를 급이하여 비만을 유도하였다. 사료 급이 6주 후부터는 선정된 compound를 2.5 mg/kg으로 매일 경구투여하였다. 실험 종료 후, 동물을 희생하여 식욕억제 신호가 일어나는 조직인 뇌를 분리 적출하여 leptin signal의 중요한 molecules의 변화를 확인하였다. Part 3에서는 Part 1의 연구결과로 선정된 compound의 Leptin signal을 통한 말초 조직의 에너지 대사 조절 효과를 in vivo study로 확인하였다. 동물은 C57BL/6J를 사용하였고, 총 10주의 실험 기간 동안 45 kcal 고지방 사료를 급이하여 비만을 유 도하였다. 사료 급이 6주 후부터는 선정된 compound를 2.5 mg/kg으로 매일 경구 투여하였다. 실험 종료 후, 동물을 희생하여 에너지 대사가 일어나는 조직인 백색 지방, 간, 근육을 분리 적출하였다. 이후, 지방의 크기, 지방간염, 근육 조직 등을 확인함으로써 에너지 대사의 조절을 확인하였으며, 렙틴 신호의 변화를 확인함으 로써 에너지 대사와 렙틴 신호의 상호작용을 확인하였다.

해조생장촉진제 살포해역의 해조류 식생변화

이형준 경상국립대학교 대학원 2023 국내석사

Currently, as one of the measures to promote the growth of aquacultured seaweeds and to restore the sea sites where barren ground occurs, the algae formation technique using seaweed growth promoters is being applied internally and externally. However, the exact mechanism of how the algae growth promoter contributes to the algae growth promotion and colony restoration in the algae ecosystem is unknown. This study was conducted to elucidate the changes in the vegetation of seaweed after the application of the seaweed growth promotant. The experimental seaweed growth Promotant was developed by ‘Dongsung marine development Co., Ltd.’. In November 2018, about 36,180 kg was installed in the coastal of Daejin-ri, Goseong, and about 15,630 kg was installed in the coast of Ulleungdo. The vegetation survey after the application was conducted 4 times per season from February 2019 to November 2019 using SCUBA Diving. The control site was located at the site of the seaweed growth promotant and about 1 km away from the experimental site. In Daejin-ri, Goseong, during the entire 4 seasons, a total of 72 species (12 green, 20 brown, 38 red, 2 seagrasses) were identified in the experimental site and 44 species (7 green, 16 brown, 20 red, 1 seagrass) were identified in the control site. The biomass was a total of 5,753.6 g/m2 (Chlorophyta 28.3 g/m2, Ochrophyta 5,258.3 g/m2, Rhodophyta 466.8 g/m2, Magnoliophyta 0.2 g/m2) at the experimental site, and 4,671.8 g/m2 (Chlorophyta 0.9 g/m2, Ochrophyta 4,241.8 g/m2, Rhodophyta 428.3 g/m2, Magnoliophyta 0.8 g/m2) at the control site. In Taeha-ri, Ulleungdo, during the entire 4 seasons, a total of 64 species (7 green, 25 brown, 31 red, 1 seagrass) were identified in the experimental site and 45 species (6 green, 22 brown, 16 red, 1 seagrass) were identified in the control site. The biomass was a total of 7,176.5 g/m2 (Chlorophyta 4.9 g/m2, Ochrophyta 7,108.3 g/m2, Rhodophyta 63.3 g/m2) at the experimental site, and 7,024.2 g/m2 (Chlorophyta 12.1 g/m2, Ochrophyta 6,972.4 g/m2, Rhodophyta 39.7 g/m2) at the control site. The biomass was higher in the control site than in the experimental site in the winter season, about 3 months after the application of seaweed growth promotant. Although the effect of the seaweed growth promotant was not clear at the beginning (in Feb. 2019), the biomass of the experimental site increased rapidly over time compared to the control site. In particular, it was found that the biomass of the experimental site increased and the restoration speed of the algal communities was faster than that of the control site as it passed the loss period in the summer and entered the fall season. In conclusion, it was confirmed that the seaweed growth promotant was effective in restoring the algal communities. 현재 국내ㆍ외에서 양식 해조류의 생장촉진과 갯녹음 발생해역의 복원대책 중 하나로 해조생장촉진제를 이용한 조장조성 기법이 적용되고 있으나, 해조생장촉진제가 해조생태계내에서 어떤 형태로 해조류의 생장촉진 및 군락의 복원에 기여하는지 그 기작을 정확히 알 수 없다. 이 연구는 해조생장촉진제를 살포한 후의 해조류 식생변화를 추적하고자 실시하였다. 실험용 해조생장촉진제는 동성해양개발㈜ 제품으로 2018년 11월 강원도 고성 대진리 연안 해역에 약 36,180 kg를 살포하였으며, 울릉도 태하리 연안 해역에 약 15,630 kg을 살포하였다. 살포 후의 식생조사는 SCUBA Diving을 이용하여 2019년 2월부터 2019년 11월까지 해조생장촉진제 시설구(살포지)와 시설구로부터 약 1 km 이격된 지점에 대조구(비살포지)를 정한 후 계절별로 총 4회 실시하였다. 전 조사 기간 동안 출현한 해조류는 고성군 대진리 시설구에서 총 72종, 대조구에서 총 44종 출현하였다. 울릉도 태하리 시설구에서는 총 64종, 대조구에서 총 45종 출현하였다. 전 조사 기간 동안 출현한 해조류의 생체량은 대진리 시설구에서 총 5.8 kg/m2, 대조구에서 총 4.7 kg/m2로 나타났으며 태하리 시설구에서는 총 7.2 kg/m2, 대조구에서 총 7.0 kg/m2로 나타났다. 2018년 11월에 시설 후 약 3개월이 지난 동계에는 시설구에 비해 대조구에서 높게 나타나 생장촉진제의 효과가 뚜렷하진 않았으나, 시간이 경과 하면서 시설구의 생체량이 대조구에 비해 빠르게 증가하는 현상을 보였다. 특히, 하계의 유실기를 지나 추계에 들면서 대조구에 비해 시설구의 생체량 증가 및 군락의 복원속도가 빠른 것으로 나타나 해조생장촉진제가 군락의 복원에 효과가 있는 것으로 확인되었다.