http://chineseinput.net/에서 pinyin(병음)방식으로 중국어를 변환할 수 있습니다.
변환된 중국어를 복사하여 사용하시면 됩니다.
- 中文 을 입력하시려면 zhongwen을 입력하시고 space를누르시면됩니다.
- 北京 을 입력하시려면 beijing을 입력하시고 space를 누르시면 됩니다.
RISS 인기검색어
- 검색키워드
- 저자 : 유리운 (검색결과 1 건)
-
유리운 Graduate School Chungnam National University 2004 국내박사
돼지 코로나바이러스인 porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)와 transmmisible gastroenteritis virus(TGEV)는 특히 새끼돼지에 심각한 위장내 질병을 일으킨다. PEDV와 TGEV 감염여부를 확인할 수 있는 유일한 징후는 묽은 설사이다. 로타바이러스 감염과 함께 PED와 TGE는 돼지의 위장에 영향을 미치는 3대 바이러스성 질병으로 특히 이로 인해 새끼 돼지의 50-100%가 죽게 되며 돼지 산업의 경제적 손실을 말할 것도 없다. PEDV와 TGEV 감염에 대한 특이항체 진단시스템을 개발하기 위해 우리는 재조합된 각각의 핵캡시드(N) 단백질을 ELISA 항원으로 사용하였다. 먼저 우리는 PEDV와 TGEV의 N 유전자 발현벡터인 pQE30에 클로닝하여 대장균 XL1-Blue에서 융합 단백질을 발현시켰다. 이 발현방법은 PEDV와 TGEV의 N 부분(각각 48.62kDa, 42.13kDa)을 과량발현시켰다. 두번째로, 단백중합체의 카르복실말단에 6개의 히스티딘을 붙이고 니켈-나이트릴로트리아세트산 금속 친화성 크로마토그래피를 이용하여 PEDV와 TGEV의 재조합 N 단백질을 정제하였다. 세번째로, 정제된 N 단백질을 토끼에 주사하여 PEDV와 TGEV에 대한 복합항원 항체를 생산하고 ELISA를 이용하여 PEDV와 TGEV 감염여부를 진단하는데 사용하였다. PEDV-ELISA(0.18)과 TGEV-ELISA(0.144)에 대한 음성 컷오프값은 PEDV와 TGEV 음성혈청을 사용하여 결정하였고, 음성 컷오프값 이상의 흡광도를 가지는 임상샘플들을 양성, 음성 컷오프값 이내에 있는 것들은 음성으로 결정하였다. 결론적으로는 대장균에서 나온 재조합 N 단백질은 PEDV와 TGEV 감염의 빠르고 신뢰할만한 진단에 적합한 항원이다. 대부분 감염되는 바이러스성, 세균성 질병들은 병원균이 점막표면에 침투한다. 따라서 강력한 예장기능이 있는 점막 면역반응 유도백신 개발이 중요하다. 그러나 점막에서부터 혈류까지 병원균이 퍼진다면 강력한 조직 면역반응 또한 필요하다. 따라서 이상적인 백신은 점막표면에 국부적 면역반응을 일으키고 림프조직에서 백신특이적인 면역반응도 일으켜야 한다. 설사를 일으키는 바이러스의 경우 경구와 후두부로 백신을 접종하여 국부 및 전신 면역반응을 일으키는 것이 효율적이다. 점막에 침투하는 다양한 병원체를 경구투여하는 것이 국부 및 전신 면역반응을 유도하기에 효율적이나, 위장내부는 산성을 나타내며 분해효소들을 가지고 있어 면역반응을 높이려면 고농도로 주입하여야 한다. 반면 후두부 접종은 더 적은 양으로도 효율적인 면역반응이 가능하며 산성에 대한 문제도 피할 수 있다. 따라서 우리는 폴리감마 글루탐산 합성효소 복합체에서 표면발현 모티프인 pgsA를 도입하여 PEDV와 TGEV의 N 단백질을 락토바실러스 표면에 발현시켰다. 우리는 N 단백질 발현을 위해 셔틀벡터인 pHCE1LB를 제작하였다. pHCE1LB-pgsA-PEDN과 pHCE1LB-pgsA-TGEN로 락토바실러스를 형질 전환시키고 락토바실러스 표면에 N 단백질을 발현시켜서 전체 세포를 이용한 ELISA로 검출하였다. 또한 이 항원들이 세균표면에 발현될 때 더 좋은 면역원이 되는지 알아보기 위해 마우스와 돼지모델로 PEDV와 TGEV N 항원의 면역원성을 알아보았다. 재조합 PEDN이나 TN 락토바실러스를 주입한 마우스들은 면역글로블린 G 수치가 높았으며, 경구투여와 후두부 투여로 생긴 면역반응에 큰 차이는 없었다. 죽어있는 항원은 살아있는 항원보다 늦게 항체를 생성하였다. 임신한 암퇘지에 락토바실러스에서 만든 재조합 PEDN과 TN을 경구투여하였더니 면역글로블린 A 수치는 현저히 높았다. 재조합 락토바실러스를 주입한 암퇘지의 초유를 먹은 새끼돼지의 면역글로블린 G 수치는 약간 증가하였다. 그러나 락토바실러스에서 재조합한 PEDN을 접종한 새끼돼지의 면역글로블린 G 수치는 현저히 증가하였다. 따라서 pgsA 단백질은 외부항원을 면역계에 전달할 수 있으며 재조합된 락틱산 세균을 경구와 후두부로 투여하여 외부 항원에 대해 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한 이러한 종에서 발현된 N 항원의 면역원성은 백신개발에 중요한 사실을 나타낸다. Swine coronaviruses porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and transmissible gastroenteritis virus (TGEV) cause severe gastrointestinal diseases, especially in neonatal pigs. The only observable clinical signs of PED and TGE are watery diarrhea. Together with rotavirus infection, they form the three major viral diseases affecting to gastrointestinal tract in pigs, especially piglets resulting in 50-100% mortality, not to mention economic loss to the swine industry. To develop specific antibody detection systems for PEDV and TGEV infections, we adopted recombinant nucleocapsid (N) protein of each virus as the ELISA antigen. First, we cloned the N gene of PEDV and TGEV into expression vector pQE30 and expressed fusion proteins in Escherichia coli XL1-Blue. This expression method overproduced the N domains of PEDV and TGEV. Second, using the 6×histidine-tag at the carboxyl-terminal of polypeptides, the recombinant N protein of PEDV and TGEV (48kDa and 42kDa, respectively) was purified by nickel-nitrilotriacetic acid metal affinity chromatography. Third, purified N proteins were injected to rabbits to generate polyclonal antibodies against PEDV and TGEV. An Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on these purified recombinant N proteins was evaluated for diagnosis of PEDV and TGEV infections. The negative cut-off values for PEDV-ELISA (0.18) and TGEV-ELISA (0.144) were determined using PEDV and TGEV negative sera. Clinical samples with absorbance above the negative cut-off values were considered positive while those that were within the negative cut-off values were considered negative. In conclusion, our findings suggest E. coli-derived recombinant N proteins would be suitable diagnostic antigens for quick and reliable screening of PEDV and TGEV infections. Most infectious viral and bacterial diseases involve colonization or invasion of the mucosal surfaces by the pathogen. Hence it is important to develop vaccines that induce strong protective mucosal immune responses. However, if the organism is able to disseminate from the mucosa into the bloodstream, a strong systemic responses is also required to engender. Thus, an ideal vaccine should generate both local immune responses at mucosal surfaces and generalized vaccine-specific immunity in the systemic lymphoid organs. For diarrhea viruses, eliciting local and systemic immunity are effective via administration of vaccine through oral and intranasal routes. Oral immunization with viable organisms, which can colonize the mucosa, is effective in inducing local and systemic immune responses. However, because of the acidic pH and the presence of degradation enzymes in the gastrointestinal tract, high concentrations are often required to elicit high levels of immunity. On the other hand, intranasal immunization requires less immunogen for effective vaccination and avoids the problems of low pH. For this purpose, we also expressed the N proteins of PEDV and TGEV on the surface of Lactobacillus casei using the surface-display motif pgsA, which was adopted from the poly-γ-glutamic acid synthetase complex. We constructed a shuttle vector pHCE1LB for expression of N proteins. The clones of pHCE1LB: pgsA: PN and pHCE1LB pgsA: TN were transformed into Lactobacillus casei and expressed the N proteins on the surface of Lactobacillus casei detected by whole-cell ELISA. In order to determine whether an antigen is a better immunogen when exported to the bacterial surface, the immunogenicity of N antigens of PEDV and TGEV were studied through mouse and swine models. Mice immunized with recombinant PN or TN Lactobacillus casei developed high titers of IgG. There are no significant different in the immune response between oral and intranasal administration. The killed antigens produced antibodies later than that of the live antigens. Pregnant sows were orally administrated with recombinant PN or TN Lactobacillus casei, IgA titers were significantly high. However, IgG titers of the piglets sucking the colostrum secreted from sow previously inoculated recombinant Lactobacillus casei were slightly increased. However, piglets were inoculated PN recombinant Lactobacillus casei, their IgG titers increased significantly. In conclusion, the pgsA protein is capable of presenting foreign epitopes to the immune system and can induce a specific immune response against foreign epitopes via oral and intranasal administration of recombinant lactic acid bacteria. Also, the immunogenicity of N antigens expressed by such strain may present significant opportunities for vaccine development.
연관 검색어 추천
이 검색어로 많이 본 자료
활용도 높은 자료
