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양현걸 포항공과대학교 일반대학원 (융합생명공학부) 2019 국내박사
자연살해세포는 직접적인 세포 독성과 면역 조절 잠재력을 가진 선천성 림프구이다. 이렇게 특화된 기능들과 몸을 지키는 역할 때문에 자연살해세포에 대한 연구와 활용법에 대한 관심이 커져 왔다. 하지만 높아진 관심에도 불구하고, 자연상태의 자연살해세포들의 특징들, 이를 테면 혈액 속에 적게 존재하고, ex vivo 증식이 제한적이며, 순수한 세포들을 분리하기 위한 기술적 한계 등으로 인해 보다 심도 깊은 연구가 어려웠다. 따라서 영구적인 자연살해세포주를 만드는 것은 이러한 한계들을 극복할 수 있는 해결책이 될 수 있다. 순수한 자연살해세포들을 무한정 공급이 가능하며, 사용하기 쉬울 뿐 아니라, 윤리적 문제에서도 자유롭기 때문에 과학적인 연구뿐 아니라 바이오의학 분야에 있어서도 귀중한 도구로 사용될 수 있다. 연구의 첫번째 파트에서는 새롭게 구축된 자연살해세포주인 NK101을 형태학, 면역표현형, 세포독성, 사이토카인/키모카인 분비의 관점에서 종합적으로 분석하였다. 기본적으로 NK101의 경우 자연적인 자연살해세포와 유사하게 대형과립림프구 세포의 형태와 전형적인 표면 마커 프로필을 보일 뿐 아니라, 독성 과립의 내재 및 자가 변형/손실에 대한 인식 능력과 같은 다른 주요 특징들 역시 가지고 있었다. 흥미롭게도 NK101은 특이적인 CD56dimCD62L+ 표현형을 가지고 있었는데, 이는 자연살해세포의 분화 과정 중, 중간 단계에 해당하는 소그룹의 특징들로 알려져 왔다. 실제로 NK101의 경우 앞서 확인한 면역 표현형뿐만 아니라, 기능적인 부분 역시 CD56dimCD62L+자연살해세포 소그룹을 대표하는 다중 기능 작용기 특성과 유사한 것을 확인되었다. 다시 말해 NK101은 사이토카인 자극에 의해 향상된 분열능력 및 인터페론 감마 분비 촉진을 보일 뿐만 아니라, 암세포를 직접적으로 인지하고 죽일 수 있는 다중 기능 작용기를 가지고 있음을 확인하였다. 이러한 결과들은 NK101이 앞서 언급한 자연적인 자연살해세포들의 여러 한계로 인해 거의 연구되지 못했던 희귀한 다중 기능 자연살해세포 소그룹을 연구하는데 있어 유용한 모델로 쓰일 수 있음을 보여주고 있다. 연구의 두번째 파트에서는 NK101이 종양치료를 위한 세포치료제 플랫폼으로 가능성이 있는지를 연구하였다. 현재까지 임상시험에 들어간 자연살해세포주의 경우 NK-92가 유일하기 때문에, NK101을 세포독성, 사이토카인 분비 특성, 유전자 발현 프로필, 생산성 측면에서 NK-92와 직접적으로 비교하였다. NK101의 경우 NK-92와 비교하여 낮은 세포독성을 보였는데, 이는 상대적으로 낮은 perforin과 granzyme B의 발현 때문으로 보인다. 대신 NK101에서 인터페론 감마 및 TNF-α와 같은 면역 반응을 촉진하는 사이토카인들이 NK-92에 비해 높게 발현되는 것을 확인하였다. 반면, IL-1ra나 IL-10과 같이 면역 반응을 억제하는 사이토카인들의 경우 NK101에서는 거의 발현되지 않는 반면 NK-92에서 매우 높게 발현되었다. 유사한 맥락으로 백혈구의 증식을 긍정적으로 조절하는 유전자들이 NK101에서 높게 발현되는 반면, 반대의 역할, 즉 백혈구의 증식을 억제하는 유전자들의 경우 NK-92에서 높게 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 기능성/발현양상의 차이는 면역력이 보존된 4T1 종양 모델에서 잘 나타났다. NK101의 경우 강한 종양-특이적 면역 반응과 함께 NK-92보다 강한 항암 효과를 보였다. 이뿐 아니라 생산성 측면에서 NK-92와 비교해, NK101은 해동 이후 회복이 훨씬 빠를 뿐 아니라, 20일 배양 기준 200배가 넘는 성장 프로필을 보여주었다. 종합적으로, 본 연구는 NK101이라는 새로운 자연살해세포주가 희귀한 CD56dimCD62L+ 소그룹으로서 가지는 차별화된 특징들을 강조할 뿐만 아니라, 이들이 면역항암요법의 새로운 세포치료제로써 가능성이 있음을 시사한다. Natural killer (NK) cells are innate lymphocytes endowed with direct cytotoxicity and immunomodulatory potential. Specialized functions and roles for the host defense gives rise to attention for NK cell study and its applications. However, despite elevated interest in understanding NK cells, characteristics of primary NK cells such as scarcity in blood, limited ex vivo life span, and the technical challenges in isolating pure population constrain further extensive study. Thus, establishing permanent NK cell line could become a solution overcoming those limitations. It is limitless in supply, easy-to-use, no ethical concerns, and homogeneous population, being an invaluable tool not only in scientific research, but also in the field of biomedicine. In the first part of the study, a newly established NK cell line, NK101, was comprehensively characterized with regard to morphology, immunophenotype, cytotoxicity, and cytokines/chemokines secretion. Basically, NK101 resembled major features of natural NK cells including large-granular-lymphocyte morphology, typical surface marker profile, inclusion of cytolytic granules, and capacity of ‘missing-self’ recognition. Interestingly, NK101 had a unique CD56dimCD62L+ phenotype, which has been known as a feature of NK subset in the intermediate stage of differentiation. In agreement with the immunophenotypes, NK101 was verified to have polyfunctional effector properties that are representative of CD56dimCD62L+ NK subset. It displayed enhanced proliferation and interferon-γ secretion upon cytokine stimulation as well as direct cytotoxicity against cancer cells. These findings suggest that NK101 provides a valuable model for studying a unique polyfunctional NK cell subset, which has been little studied due to several limitations of primary NK cells. In the second part of the study, I assessed a potential of NK101 as a cellular platform for cancer treatment. Since NK-92 is only available NK cell line entering clinical trials, NK101 was compared with NK-92 in terms of cytotoxicity, cytokine signature, gene expression profile and manufacturing potential. NK101 expressed lower levels of perforin and granzyme B that correlated with weaker cytotoxicity than NK-92, but produced higher levels of pro-inflammatory cytokines including IFN-γ and TNF-α. On the other hand, anti-inflammatory cytokines such as IL-1 receptor antagonist and IL-10 were highly produced by NK-92, which were nearly undetectable in NK101. Similarly, genes linked to the positive regulation of leukocyte proliferation were enriched in NK101, while those associated with opposite function were highly upregulated in NK-92. Such functional and expressional disparities were well-represented in immunocompetent 4T1 tumor model where NK101 showed more potent anti-tumor effects than those of NK-92, accompanied with stronger tumor-specific immune responses. Regarding manufacturing potential, NK101 not only recovered rapidly after thawing, but also exhibited faster growth profile than NK-92, yielding more than 200-fold higher cell numbers after 20-day culture. Overall, this study not only highlights the distinctive features of a novel NK cell line, NK101, as a unique polyfunctional CD56dimCD62L+ NK subset, but also addresses the capability of NK101 as a new platform for adoptive cancer immunotherapy.
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