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A study on biodefense and immune-related genes of Japanese flounder, paralichthys olivaceus
남보혜 Tokyo University of Fisheries 2000 해외박사
「ヒラメの生體防御關連遺傳子の構造および機能解析」 魚類の免疫ㆍ生體防御において白血球が重要な役割を果たしていることは廣く知られているが, 免疫系で동いている因子とその遺傳子についてはほとんど解明されていない. そこで, 本硏究では, 魚類の免疫ㆍ生體防御機構を明らかにすることを目的とし, 免疫反應機構および免疫に最も重要な細胞であるT細胞表面タンパク質について解析を行つた. 免疫反應機構の解明については, まず最初に, 多數の免疫ㆍ生體防御關連遺傳子をクロ-ン化し, 魚類の白血球においてウイルス感染あるいはマイトジエンの刺激により, 發現が誘導される遺傳子を同定し, 解析した. 次いで, 魚類のB細胞に比較して魚類のT細胞に對する抗體は末開發であり, 細胞レべルでの同定ができていないのが現狀である. そこで, 抗T細胞抗體の開發において重要と思われるT細胞表面タンパク質, 主にT細胞レセプタ-(TCR)遺傳子について解析を行つた. 免疫ㆍ生體防御關連遺傳子の解析には, ヒラメラブドウイルス(HRV) (105.8xTCID50/fish) を接種後, 24, 48, 72および96時間後に採し, 白血球をパ-コ-ル溶液 (1.072g/㎎) を用いて分離した. 分離した白血球よりmRNAを抽出し, 4サンプルを-ルした後, cDNAライブラリ-(HRV感染ヒラメ白血球cDNAライブラリ-)を作製した. また, T細胞のマイトジエンであるConcarnavalin A(Con A)およびphorbol myristate acetate(PMA)で刺激した末梢血より分離した白血球を10%FCS 含有RPMI1640にCon A(70㎍/㎖)およびPMA(0.35㎍/㎖)を加えた培地の中で, 1, 2および3時間培養したものをそれぞれ回收し, mRNAの抽出を行つた. 各白血球のサンプルをプ-ルしてcDNAライブラリ-(ConA/PMA處理ヒラメ白血球cDNAライブラリ-)を作製つた. これらのcDNAライブラリ-よりクロ-ンを無作爲に選擇し, 部分的DNAの鹽基配列を決定した. 決定した鹽基配列および推定アミノ酸配列はGenBankに登錄されている配列と比較同定し, EST解析を行つた. HRVを感染したラメ白血球cDNAライブラリ-より, 總數896クロ-ンの鹽基配列を決定した. 解析した全クロ-ンの內, 350クロ-ン(39%)は旣に登錄してある遺傳子と相同性を示したが, 殘り546クロ-ン(61%)は未知の遺傳子であつた. また, Con A/PMAを處理したヒラメ白血球cDNAライブラリ-からは550クロ-ンを選擇し, 鹽基配列を決定した結果, 262クロ-ン(47%)が旣知の遺傳子と相同性を示した. 2種類のcDNAライブラリ-において, 旣知の遺傳子と相同性を示したクロ-ンがコ-ドしているタンパク質の機能により7つのカテゴリ-(細胞分化, 細胞シグナル傳達, 細胞および組織の生體防御, 遺傳子およびタンパク質の發現, 細胞構造および運動性, 代謝, その他)に分類された. HRVを感染したラメ白血球cDNAライブラリ-は, 68%の旣知の遺傳子が免疫應答に關われると思わるカテゴリ-(細胞分化, 細胞シグナル傳達, 細胞および組織の生體防御, 遺傳子およびタンパク質の發現) に含まれた. さらに, 二つのライブラリ-より得られた遺傳子を比較して見ると, HRVを感染したラメ白血球cDNAライブラリ-からは白血球の表面に存在する樣樣なレセプタ-およびCD(cluster of differentiaion)などの膜タンパク質をコ-ドする遺傳子が多く, Con A/PMAで處理したヒラメ白血球cDNAライブラリ-からは, サイトカインおよび轉寫因子などのシグナル傳達および遺傳子發現に係わる遺傳子が主に同定されたことから, 誘導方法の偉いにより發現する遺傳子が異なることが明らかとなつた. T細胞表面のみ特異的に發現する細胞表面タンパク質の遺傳子解釋は, 主にT細胞レセプタ-(TCR)遺傳子を中心につた. 哺乳類のT細胞はTCRによつて, αβ型とγδ型に分類されている. ヒラメのTCRα鎖およびβ鎖はディジエネレイトPCR法を用いて, δ鎖はEST解析よりクロ-ンした. TCRの遺傳子再構成の特徵を調ベるため, α鎖は50クロ-ン, β鎖より37クロ-ン, δ鎖より46個のcDNAロ-ンの鹽基配列を決定した. その結果, ヒラメのTCRα, β, およびδ鎖も旣知のTCRと同樣の遺傳子構造および遺傳子再構成能力を持つことかった. さらに, ヒラメのゲノムBACクロ-ンを用いてゲノム解析を行った結果, 他の哺乳類と同樣にα鎖の遺傳子座の中にδ鎖の遺傳子座がコ-ドされていることが明らかとなつた. さらに, EST解析により, 細胞傷害性T細胞のみ發現するCD8遺傳子もクロ-ン化した. これらTCR α, β, δおよびCD8α鎖を指標として in situ hybridization(ISH)を行い, 今回クロ-ン化したこれらの遺傳子がT胞のサブタイプの同定に有效であるかどうかを試みた. 末梢血の白血球および腎臟の白血球に對してISHを行つた結果, 末梢血白血球では16.6%の細胞がTCRα鎖と, 15.1%の細胞がTCRβ鎖と, 25.5%の細胞がTCRδ鎖と陽性反應を示した. 一方, 腎臟から分離した白血球では25.4%および21.6%の細胞がTCRαおよびβ鎖に對し, 13.9%の細胞がTCRδ鎖に對し陽性反應を示し,末梢血白血球とは異なる分布率を示した. CD8α鎖のRNAプロ-ブは末梢血白血球では11.9%の細胞と, 腎臟の白血球では18.5%の細胞と陽性反應を示したが, CD8α鎖を發現するα/β T細胞に對してはそれぞれ75%および78%であり, ほとんど同じ比率であつた. これらの結果より, 我我がクロ-ン化したTCR α, β, δおよびCD8α鎖は異なるT細胞のサブタイプの檢出およびその分布率を調ベるプロ?ブとして有效であると考えられる. これらの遺傳子を用いて抗體製作が可能であれば, 魚類のB細胞と同樣に抗體を用いたT細胞の分類が可能になり, 今まで不明な部分が多かった魚類の免疫の仕組みがより明らになるものと考えられた.
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