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- 저자 : 기근홍 (검색결과 2 건)
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電子顯微鏡的 In situ hybridization 方法에 關한 硏究 : Human papillomavirus 와 Epsteinbarr virus를 對象으로
분자생물학적 수기가 발달함에 따라 진단병리학이나 세포 발생학 분야에서 이를 응용하는 등 그 이용범위가 넓어지고 있다. 또한 광학현미경에서 시행되던 in situ hybridization(ISH로 약기함)이 전자현미경적 수준에서 시도되어 세포의 미세구조와 함께 DNA나 RNA의 정확한 국지화가 가능해졌다. 이러한 전자현미경적 ISH의 경우는 조직 절편의 제작과정이나 염색과정에서 선택되는 재료에 따라 그 결과에 많은 영향을 주게 된다. 이에 저자는 면역조직화학적 염색, 광학현미경적 ISH 그리고 연쇄중합반응(polymerase chain reaction)을 시행하여, human papillomavirus(HPV) 감염이 확인된 자궁경부의 편평세포암종과, Epstein-Barr virus(EBV)의 존재가 확인된 세포주를 대상으로 여러 방법에 따른 포매후 전자현미경적 in situ hybridization을 시행하고, 기존의 연구결과와 비교한 결과는 다음과 같다. 1. 조직을 0.2% glutaraldehyde와 4% paraformaldehyde 용액에 고정한 경우에 양성 황금과립의 부착이 많았다. 2. 포매제는 Unicryl resin과 Lowicryl K4M을 이용한 경우에만 양성결과를 얻을 수 있었으며, Epon에 포매된 조직에서는 반응을 볼 수 없었다. 그리고 Unicryl resin을 이용한 경우 조직 절편제작이 더 용이하였다. 3. 조직내의 단백을 제거할 목적으로 시행한 효소 처리에는 proteinase K, trypsin을 이용하였으며 모두 세포구조의 관찰이 용이하였다. 그러나 이들의 농도를 높이면 세포구조의 관찰이 용이하지 않았다. 4. DNA 변성 방법은 70% formamide와 standard saline citrate(SSC)의 혼합액, 0.5N sodium hydroxide 단독 사용, 0.5N sodium hydroxide와 SSC를 혼합한 경우로 시행하였으며 이들 모두에서 양성 결과를 얻을 수 있었으나 0.5N sodium hydroxide만을 사용한 경우 배경 염색이 적은 더 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 5. DNA탐색자의 hybridization은 온도와 반응 시간을 달리하였으나 차이는 발견하지 못하였고 37℃에서 1시간정도 반응시키는 것이 좋으리라 생각된다. 6. 황금과립은 핵질내에 광범위하게 산재하여 있었으며, 특히 핵막에 연한 부분과 핵질이 뭉쳐져 진한 부분에 많았다. 관찰되는 양상은 대개 소군집 형태이거나 구상으로 뭉쳐져 있는 형태가 많았다. 이상의 연구결과로 전자현미경적 in situ hybridization시 가장 좋은 결과를 얻으려면 0.2% glutaraldehyde-paraformaldehyde 용액으로 고정하고 unicryl로 포매한 조직을 1 ㎕/ml proteinase K로 처치하고 0.5N sodium hydroxide로 DNA를 변성시켜 각종 탐색자를 반응시킨다. 반응은 37℃에서 1시간정도 시키고 황금과립으로 부착시켜 관찰하면 각종 viral DNA를 인지할 수 있으며, 이를 응용한 진단병리학적 이용이 가능하리라 여겨진다. In situ hybridization has become a standard method for localizing DNA or RNA sequences in tissue or cell preparation. The technique developed in electron-microscopic level enable the precise subcellular localization. A method was developed for detection of specific viral DNA. We have tested various methods and technique to detect specific viral DNA through ISH at electron microscopic level. Postembedding method of ultrastructural ISH is developed and successfully applied for the detection of human papilloma-virus(HPV) type 16 in squamous cell cercinoma of the uterine cervix and Epstein Barr virus in EBV infected leukemia cell line. Following results are made. 1. The best results were obtained in 0.2% glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde fixed tissue or cell block. 2. The labelling was best observed on Unicryl resin and Lowicry K4M resin sections. Epon sections showed no reactivity. Thin section of Unicryl resin was more easier than Lowicry K4M resin. 3. Enzymatic predigestion with proteinase K, pepsin and trypsins gave good results. However, high concentration of these produce a poor results due to excessive destruction of cellular component. 4. Alkali treatment with 0.5N sodium hydroxide made successful results in denaturation of target DNA. 5. The labelling density of gold particles was independent on incubation time or temperature in hybridization step. 6. The viral DNA labelling was localized mainly within the nucleus, both within and at the edge of electron dense regions, and below the nuclear membrane. And the labelling was seen in the form of dense, roughly spherical shape. In conclusion, best results are obtained by the conditions that tissues fixed by 0.2% glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde solution, embedded with Unicryl resin, protein denaturation by 0.1 ㎕/ml proteinase K, DNA denaturation by 0.5N sodium hydroxide, and reaction with DNA probe.
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O, P' - DDD가 흰쥐 뇌하수체 전엽의 ACTH 분비의 활성도에 미치는 영향에 관한 면역조직화학적 연구
It has been well known that the toxicity of o,p'-DDD on the zona fasciculata in adrenal gland. The toxicity revealed adrenostatic effect on the cortisol biosynthesis by mitochondrial destruction. So, o,p'-DDD was used for unoperable adrenocortical carcinoma and its metastasis. The secretory activity of cortisol in adrenal cortex depended on ACTH secretion in the adenohypophysis. o,p'-DDD was dissolved in corn oil arid administered orally for 28 days by 75mg/kg, 150mg/kg and 300mg/kg to investigate the adrenostatic effect on the cortisol biosynthesis of o,p'-DDD by assesment of ACTH secretory activity in anterior lobe of pituitary gland of rats. The results obtained were that the secretory activity of ACTH and the number of ACTH secretory cells were increased according to the dosage of o,p'-DDD, especially 300mg/kg administrated group. Therefore, the suppression of cortisol biosynthesis of o,p'-DDD was confirmed by increased secretory activity of ACTH and the number of ACTH secretory cells.
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