The Potential of Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi for Improving Oral and Respiratory Health

강초은 건국대학교 대학원 2024 국내석사

Probiotics, living organisms with health-promoting properties when ingested, have been extensively studied for their various functionalities, including antioxidative, anti- inflammatory, anticancer, immunomodulatory, and anti-obesity effects. The purpose of this study was to assess the potential for improving oral health and respiratory health using lactic acid bacteria strains isolated from Korean fermented kimchi. Firstly, in previous studies, Weissella cibaria D29, D30, D31, and B22 were reported for their probiotic characteristics, as well as their antioxidative and anti- inflammatory effects. This study aimed to evaluate th possibility of improving oral health by identifying whether the live cells and cell-free supernatant of hese four W. cibaria strains could exhibit antibacterial and anti-biofilm effects when exposed to three strains of cavity-causing Streptococcus mutans. W. cibaria live cells showed the ability to inhibit growth and biofilm formation of S. mutans through co-aggregation. Additionally, the cell-free supernatant of W. cibaria displayed an inhibitory and degradative effect on biofilm by suppressing the growth, insoluble exopolysaccharides formation, auto-aggregation, quorum sensing, and the expression of virulence factors in S. mutans. These effects were further investigated through scanning electron microscopy and confocal laser scanning microscopy. Secondly, Levilactobacillus brevis KU15151 was reported in previous studies for its probiotic characteristics, antioxidative properties, and anti-inflammatory effects on RAW 264.7 cells. This study aimed to explore the potential of heat-killed L. brevis KU15151 in improving respiratory health by identifying its antioxidant and anti- inflammatory effects on LPS-induced A549 cells. Inactivated L. brevis KU15151 showed strong DPPH and ABTS radical scavenging abilities and effectively reduced the production of reactive oxygen species. In addition, it was found to have an anti- inflammatory effect by inhibiting the phosphorylation of ERK 1/2, JNK, p38 MAPK, p65, and IκB-α, which are involved in MAPK and NF-κB signaling. It also suppressed the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines, which are significant factors in respiratory diseases. This investigation has validated the antibacterial and anti-biofilm properties of live cells and cell-free supernatants derived from four W. cibaria strains, estimating their mechanisms. It has also determined the antioxidative and anti-inflammatory potential of heat-killed L. brevis KU15151 when applied to LPS-induced A549 cells. Therefore, it is expected that the four strains of W. cibaria and heat-killed L. brevis KU15151 can contribute to the enhancement of oral health and the improvement of respiratory health, respectively. 프로바이오틱스는 섭취 시 건강 상의 유익한 작용을 하는 미생물로 여러 균주에 대해 생균체, 사균체, 대사물 등의 형태로 항산화, 항염, 항암, 면역 조절, 항비만 등 다양한 기능성이 연구되어 왔다. 본 연구에서는 한국의 전통 발효 식품인 김치에서 분리한 유산균 균주를 사용하여 구강 건강과 호흡기 건강 개선의 가능성을 평가하는 것을 목적으로 하였다. 첫째, Weissella cibaria D29, D30, D31, B22 네 균주는 본 연구실의 선행 연구에서 프로바이오틱스 특성과 항산화 및 항염 효과가 보고되었다. 본 연구에서는 W. ciabria 네 균주의 생균체 및 상등액을 충치 원인균인 Streptococcus mutans 세 균주와 반응시킨 후 항균 및 항바이오필름 효과를 확인하여 구강건강 개선에 도움을 줄 수 있는지를 평가하고자 하였다. W. ciabria 생균체는 공동응집을 통해 S. mutans 의 생장과 바이오필름 형성을 억제하였다. W. ciabria 상등액은 S. mutans 의 생장, 불용성 exopolysaccharides 생성능, 자가응집력, 쿼럼센싱, 독성인자의 발현 등을 조절하여 바이오필름 형성억제 및 제거에 효과를 보였으며, 이는 주사전자현미경과 공초점 레이저 주사현미경을 통해 확인되었다. 둘째, Levilactobacillus brevis KU15151 생균체는 선행 연구에서 프로바이오틱스 특성과 항산화능, RAW 264.7 세포에 대한 항염 효과가 보고되었다. 본 연구에서는 열처리된 L. brevis KU15151 사균체에서의 항산화능 및 A549 세포에 대한 항염 효과를 확인하여 호흡기건강 개선에 도움을 줄 수 있는지 그 가능성을 평가하고자 하였다. L. brevis KU15151 사균체는 강력한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 보였으며 활성 산소종의 발생을 효과적으로 억제하였다. 또한 MAPK 및 NF-kB signaling 에 관여하는 ERK 1/2, JNK, p38 MAPK, p65, IκB-α 의 인산화를 억제하고, 호흡기 질환에 큰 영향을 주는 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 및 IL-6, eotaxin 수치를 감소시켜 LPS 로 유도된 A549 세포에 대한 항염 효과를 가지는 것으로 확인되었다. 본 연구는 프로바이오틱스 특성을 가진 W. ciabria 네 균주에서 얻은 생균체 및 대사물의 충치균에 대한 항균 및 항바이오필름 효과, 작용 방식을 확인하였다. 또한, 열처리한 L. brevis KU15151 의 사균체의 항산화능과 LPS 로 유도된 폐 상피세포에 대한 항염 효과를 검증하였다. 따라서, W. ciabria 네 종의 생균체 및 대사물이 구강건강 개선에 도움을 줄 수 있으며, L. brevis KU15151 의 사균체가 호흡기건강 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대한다.

Development of Nivolumab Bio-Better using mammalian and plant Glyco-Delete platform

강초은 Graduate School, Yonsei University 2022 국내석사

항체에 부착된 당사슬은 다양한 생물학적 활성, 즉 단백 안전성, 이동성, 단백 제거율, 수용체 접합성 등을 변화시켜 치료 효능, 체내 지속성, 타겟팅 및 면역반응 등에 중요한 역할을 수행하기 때문에 항체의약품의 품질을 결정하는 주요인자이다. 그러나 당사슬은 다양한 효소의 작용으로 만들어지고 생산공정 과정이나 조건에 따라 각 효소의 활성이 다를 수 있으므로 단백질에 균일하지 않게 부착될 수 있다. 이러한 당사슬을 균일하게 조절할 수 있다면 항체의 품질을 지속적으로 유지할 수 있다. 특히 표적가림용 항체의약품의 경우 항체부착에 의해 표적발현 세포의 사멸을 초래할 수 있는데, 당사슬 조절을 통해 그러한 표적발현세포의 사멸 능력을 제거할 수 있다. 본 연구는 CHO 세포와 식물인 담배의 당화과정을 조절하여, 항체의 ASN297에 한 개의 GlcNAc 분자만 부착된 형태를 생산하는 당사슬제거 (Glyco-Delete, GD) CHO세포와 당사슬제거 담배시스템을 구축하고 이를 통해 생산된 항체의 기능을 평가하는 연구이다. IgG1과 IgG4 형태의 니볼루맵들을 생산하여, 고유능력인 항원결합력, PD1 활성화 예방능력 및 싸이토카인 분비 등의 T 세포 활성조절능력을 확인할 뿐 아니라, 궁극적으로 PD1발현 세포에 대한 면역원성의 감소를 관찰하는 것을 목적으로 했다. 또한 당사슬제거 식물 시스템을 이용하여 마찬가지로 식물 니볼루맵을 생산하여 그 기능을 함께 평가하고자 했다. 본 연구는 CHO 세포 및 식물에서 생산된 당사슬제거 니볼루맵들의 면역원성이 낮아짐을 증명했다. 이를 통해 니볼루맵의 타겟인 T세포의 사멸을 줄여 개선된 안정성을 규명함과 동시에, 항체 적용 시 면역활동에 참여하여 효과를 일으키는 T세포의 사멸을 줄임으로써 궁극적으로 향상된 항체의 효능 또한 규명하였다. 이러한 결과는 니볼루맵과 같은 표적가림용 항체의 성능을 향상시켜 동∙식물 항체 플랫폼의 개선에 기여할 수 있을 것이다. The glycan in Fc region regulates therapeutic efficacy of antibody by changing various biological activities such as protein safety, mobility, protein clearance, and receptor conjugation. Also, since it has various biological activities, such as playing an important role in targeting antigen and immune response, it is a factor that determines the quality of antibody. However, since glycans are made by the action of various enzymes and the activity of each enzyme may be different depending on the production process or conditions, it is difficult to homogeneously attach to the protein. Nivolumab is a human IgG4 monoclonal antibody that blocks PD1. It was approved for medical use in the United States in 2014 and treats several types of cancer includes melanoma, lung cancer, malignant pleural mesothelioma, renal cell carcinoma, etc. It is mainly used as a first-line treatment for metastatic melanoma and non-small cell lung cancer, and many clinical trials are ongoing as a combination treatment with various targeted anticancer drugs. Also, Nivolumab is the type of immunotherapy works as a checkpoint inhibitor, blocking a signal that prevents activation of T cells from attacking the cancer. Most immunomodulatory anticancer drugs including nivolumab have IgG4 backbone which has low affinity for complement and various FcγRs. However, IgG4 still has a measurable affinity for FcγRIII, so given the high drug concentrations used in therapy, the possibility of target cell ADCC cannot be completely eliminated. Therefore, a method for removing immunogenicity of the IgG4 is highly demanded. Glyco-Delete (GD) technology is an ADCC removal platform for antibody drugs. Via glycosylation enzymes regulation to leave only one GlcNAc glycan stump, not only reduce the affinity for FcγRIII, but also provide the uniformity of antibody which is important factor for manufacturing. In this study, GD CHO cells and GD plant systems were produced by controlling the glycosylation process of CHO cells and plant and nivolumab was used for template to prove the usefulness of GD platform. By producing nivolumab with IgG1 and IgG4 backbone in CHO cell system, we measured the affinity for PD1 and the blocking activity of PD1 signaling to check whether the GD cause any change in affinity and blocking activity of PD1 signaling. Glycan uniformity and immunogenicity were also confirmed the improved characteristics of GD nivolumab. Furthermore, by using the GD-plant system, plant-nivolumab was produced and its functions were evaluated. This study demonstrates that GD platform of CHO cells and plant provides reduced ADCC activity to nivolumab without altering PD1inhibiting activity. GD engineering can be contributed to as a bio-better platform for various target-masking antibodies.