편두통 조절물질 개발을 위한 multielectrode array 장치를 이용한 새로운 in vitro 검색계 연구

이철원 경희대학교 동서의학대학원 2016 국내박사

본 논문에서는 편두통현상을 조절하는 생리활성물질을 검색하는 새로운 검 색계를 개발하는데 그 목적이 있다. 편두통은 여러 가지 요인으로 인하여 이를 치료하는 약물을 발겨하는데 매우 어려운 점이 있다. 여러문헌을 참고하여 가장 빈번하게 일어나는 편두통을 실험적으로 가장 잘 나타나는 현상인 spreading depolarization (SD)을 골랐다. 그리 하여 SD 현상을 검색계의 목표현상으로 삼았다. SD 현상을 동물 모델어서 야기 시키기 위해서 뇌해마절편양생 법을 사용하였다. 또한, 뇌해마의 거의 전 부분의 전기 생리학적 변화를 기록할 수 있는 multielectrode array 장 치를 사용하였다. SD 현상은 1M의 KCl을 포함하는 인공적으로 만든 뇌척 수액 (artificial cerebrospinal fluid, aCSF)을 흘려보내어 얻어내었다. 한 편, 이러한 검색계가 작동하는지를 검사하기위해서 편두통을 감소시키는 대 표적인 약물인 praol을 처리하여 검색계를 시험해 보았다. 결과적으로, pranol의 처리에 따라 명확하게 검색계가 변화를 잡아내었을뿐 아니라 pranol처리의 최적의 농도도 분별할 수 있어서 매우 고부적이었다. 결론적으로, 이 새로운 in vitro 편두통 검색계가 향 후 편두통을 완화시키고 치료하는 새로운 생리활성물질을 찾아내는데 일조하는 데 사용 되기를 바란다. In this study, a novel efficient screening system to find bioactive materials against migraine, It was well known to have difficulties in finding a curing medicine for migraine. because the causes were various.With literature studies, most frequent event during migraine was spreading depolarization (SD). For this reason, SD was selected as a key feature to target. To make SD feature in animal experimental model, an organotypic hippocampal brain slice model was chosen. Moreover, a multielectrode array system was used for multichannel electrode to record not only a small most of all area of it. With KCl contained saline treatment, SD feature was generated and the recording was successfully. To verify the system, a typical attenuating medicine for migraine, pranol, was engaged to test the system. As the result, the system could clearly reveal the effect of pranol and furthermore it could represent a optimum treatment concentration of it. In conclusion, this novel in vitro expeimental system for screening bioactive materials against migraine might be useful for pharmaceutical application.

악성종양에 사용되는 천연물약재의 항암효과에 대한 대체보완의학적 문헌고찰

오선민 경희대학교 동서의학대학원 2016 국내석사

본 연구에서는 본초에 관한 각종 문헌을 대상으로 선발된 418종의 천연약재를 1차적으로 항암활성 작용기전에 부합하는 암 종류로 분류하였으며, 2차적으로는 천연약재의 생리활성 물질 및 유효성분 등을 연구하였다. 총 418종류로 선발된 천연약재 중에서 111종류(26.55%)가 항암생리물질이 존재하는 것으로 조사되었으며, 폐암에 관련된 천연약재는 13종류(3.10%)로 가장많았고, 간암은 8종류(1.90%), 유방암은 7종류(1.67%), 자궁경부암, 백혈병, 전립선암, 위암은 5종류(1.20%)였으며, 대장암, 난소암, 고형암 등이 각각 4종류(0.95%)로 나타났다. 2014년 현재 우리나라 3대 사망원인은 암(악성신생물), 심장질환, 뇌혈관 질환으로 나타나고 있으며, 2004년 이후로 매년 사망원인 1위는 암으로 조사되고 있다. 그러나 암에 대한 현대의학은 꾸준하게 발전되고 있음에도 불구하고 서구 사회에서의 보완대체의학은 문화적, 교육적, 사회적 배경에 따라 다양한 형태로 발전되고 있으며, 이용 또한 급속하게 증가하고 있다. 또한 현대의학의 체계적 한계와 암 치료에서 발생하는 다양한 부작용에 대한 반발에서 우리나라에서도 보완대체의학의 존재감이 새롭게 조명되고 있으나 과학적 근거가 부족한 민간요법의 부작용 실태도 심각한 상황이다. 따라서 보완대체의학 차원에서 본 연구는 2차 암으로의 전이를 예방할 수 있는 식이요법과 기능성 식품으로서의 천연약재 활용에 과학적 기초자료를 제공하고자 한다.

Neural activity modulation and network analysis using low-intensity ultrasonic stimulation in rat hippocampal slice culture

김현범 경희대학교 동서의학대학원 2016 국내박사

Background: Ultrasound is a promising neural stimulation modality, but an incomplete understanding of its range and mechanism of effect limits its therapeutic application. Also Multielectrode arrays (MEAs) have been used to understand electrophysiological network dynamics by recording real-time activity in groups of cells. The extent to which the collection of such data enables hypothesis testing on the level of circuits and networks depends largely on the sophistication of the analyses applied. Objective/hypothesis: I investigated the modulation of spontaneous hippocampal spike activity by ultrasound at a lower acoustic intensity and longer timescale than has been previously attempted, hypothesizing that spiking would change conditionally upon the availability of glutamate receptors. And I studied the systemic temporal variations of endogenous signaling within an organotypic hippocampal network following theta-burst stimulation (TBS) to the Schaffer collateral-commissural pathways. The recovered current source density (CSD) information from the raw grid of extracellular potentials by using a Gaussian interpolation method increases spatial resolution and avoids border artifacts by numerical differentials. Methods: Using a 60-channel multi-electrode array (MEA), I measured spontaneous spiking across organotypic rat hippocampal slice cultures (N=28) for three minutes each before, during, and after stimulation with low-intensity unfocused pulsed or sham ultrasound (spatial-peak pulse average intensity 780 μW/cm2) preperfused with either aCSF, 300 μM kynurenic acid (KA), or 0.5 μM TTX at 3 mL/min. Spike rates were normalized and compared across stimulation type and period, subregion, threshold level, and/or perfusion condition using repeated-measures ANOVA and generalized linear mixed models. Comparison with Existing Method(s): Previous MEA work on plasticity in hippocampal evoked potentials has focused on synchronicity across the hippocampus within isolated subregions. Such analyses ignore the complex relationships among diverse components of the hippocampal circuitry, thus failing to capture network-level behaviors integral to understanding hippocampal function. Results: Normalized three-minute spike counts for large but not mid-sized, small, or total spikes increased after but not during ultrasound relative to sham stimulation. This result was recapitulated in subregions CA1 and DG and replicated in a separate experiment for all spike size groups in slices pretreated with aCSF but not KA or TTX. Increases in normalized eighteen-second total, mid-sized, and large spike counts peaked predominantly 1.5 minutes following ultrasound stimulation. I compared total sink and source currents in DG, CA3, and CA1; calculated accumulated correlation coefficients to compare pre- with post-stimulation CSD dynamics in each region; and reconstructed functional connectivity maps for regional cross-correlations with respect to temporal CSD variations. The functional connectivity maps for potential correlations pre- and post-TBS were compared to investigate the neural network as a whole, revealing differences post-TBS. Conclusion(s): low-intensity ultrasound setup exerted delayed glutamate receptor-dependent, region- and amplitude-specific influences on spontaneous spike rates across the hippocampus, expanding the range of known parameters at which ultrasound may be used for neural activity modulation. And the proposed method of recovering current source density to examine whole-hippocampal function is sensitive to experimental manipulation and is worth further examination in the context of network-level analyses of neural signaling. 배경: 초음파는 유용한 신경 자극 수단이지만, 그에 대한 활용범위와 치료효과에 대한 이해는 초음파의 메커니즘에 대한 연구 부족으로 인해 널리 사용되어지지 못하고 있다. 또한 Multielectrode arrays (MEAs)는 뉴런과 뉴런 사이의 실시간 활동 전위를 기록하여 뉴런들의 전기 생리학적인 관계를 이해하기 위해 주로 이용 된다. 그럼에도 불구하고 이러한 데이터는 기능적 회로 및 네트워크 수준의 분석이 복잡함으로 인해 많은 부분 활용되어지지 못하고 있다. 목적 및 가설: 낮은 강도의 초음파에 의해 자연발생적인 해마의 전기활동의 변화를 조사하고 이전의 연구들 보다 긴 시간 동안의 변화를 관찰함으로 초음파에 의해 유도되는 활동전위의 변화가 글루타메이트 수용체의 가용성에 따라 조건부로 변화되는 것을 알게 되었다. 또한 강한 전기자극(TBS)상황에서 해마의 네트워크 내에서 생성되는 전기적 신호의 변화를 연구하고 그에 대한 수학적 해석을 MEA에 적용하여 뉴런들간의 관계해석을 통해 신호의 공간적 시간적 변화를 연구 하였다. 방법: 60 채널 Multielectrode arrays (MEAs)를 사용하여, 쥐의 해마 조직에서의 자발적인 스파이크를 측정 (N = 28) 총 9분동안 unfocused 저 자극 초음파를(피크 펄스 평균 강도 780 μW / cm2) 사용하고, 300μM kynurenic acid (KA)와 0.5μM tetrodotoxin (TTX) 를 처리하여 비교 관찰 하였다. 기존 방법 과의 비교: 기존 MEA의 연구는 해마의 가소성 중에서도 각각의 하위 영역들간의 독립된 관계에 대한 신경신호의 해석이 주를 이루었다. 이런 분석들은 해마의 구성하는 뉴런과 뉴런의 기능적 관계에 대한 이해를 하는데 부족한 점이 많았다. 이에 수학적 방법(CSD by using a Gaussian process)을 적용하여 기존의 단순한 수치해석이 아닌 네트워크 수준에서의 상호관계의 변화를 관찰하고 기능적 분석을 하였다. 결과: 초음파 자극 동안 전체적으로 스파이크가 증가하지만 초음파 자극 후에 더욱더 동기화된 스파이크의 증가를 관찰할 수 있었다. 이 결과는 해마의 하위 영역의 CA1과 DG에서 효과적으로 나타났다. KA 와 TTX를 해마에 전처리 후 같은 실험을 하였을 때는 그 효과가 줄어드는 것을 관찰하였다. 정규화해서 18초동안의 소,중,대형의 스파이크 증가는 1.5분 에 정점을 이룬다. 또한 네트워크 분석에서는 DG, CA3 및 CA1의 총 싱크 와 소스 전류를 비교하고 자극 후 각 해마의 CSD 비교 축적 된 상관 계수를 계산하고 시간적 CSD 변화에 대한 지역들 간 상관 관계에 대한 기능적 연결 맵을 재구성 하였다. 전위의 상관 관계에 대한 기능적 연결 맵은 자극(TBS) 전후의 차이를 드러내는 전체 신경망을 표현하고 비교 분석 하였다. 결론: 저 자극 초음파 (피크 펄스 평균 강도 780 μW / cm2)가 신경 활동 조절에 이용될 수 있는 근거를 실험적으로 증명하고, 해마 전 영역에 걸쳐 자연발생적 스파이크가 글루타메이트 수용체 의존적이며 지연 현상이 있다는 것을 처음 관찰 하였다. 그에 반해 저 자극 초음파가 해마영역별 차이와 스파이크 크기에는 영향을 주지 못하는 것을 관찰 하였다. 그리고 전체 해마의 기능을 알아내는데 유용한 수학적 방법(CSD by using a Gaussian process)을 적용하여 MEA의 실험에 좀 더 실질적인 신경 활동을 네트워크 수준에서 분석함으로 인해 뉴런들간의 신호들의 변화를 신경생리학적 해석과 기능적 분석이 용이 하게 되었다.

Development of a MEA-based screening method using rat hippocampal slice culture; Application for learning and memory enhancing materials

Jung-A Shin 경희대학교 2009 국내석사

흰쥐 해마의 장기기억강화 현상에 대한 연구는 여러 가지 방법으로 연구되고 있다. 장기기억강화 현상을 연구하는 in vivo 방법은 정밀한 데이터를 얻을 수 없으며, 널리 이용되고 있는 patch-clamp 방법은 실험하기 어렵고 세포나 조직에 상처를 입힌다는 단점이 있다. 그래서 본 연구에서는 위의 장점을 지닌 다중채널전극기를 이용하여 세 가지 약물에 대한 ex-vivo 스크리닝을 하였다. 첫 번째 약물은 G9에서 보여지듯이 장기기억강화 현상을 증가시켰다. 이는 학습과 기억이 더 오래 지속될 수 있음을 의미한다. 두 번째 약물은 장기기억강화를 감소시켰는데 이는 자극 후 반응 속도에 따라 두 가지 양상으로 분류할 수 있다. ESP-102의 결과는 자극 후 반응이 느려 NMDA 차단제로 여겨지며 이러한 NMDA 차단제 효과는 신경회복 기능과 동시에 학습과 시냅스 가소성의 결핍을 회복시킬 수 있을 것으로 사고된다. 이와는 다르게 자극 후 반응이 빠르게 나타난 loganin의 경우에는 반응이 빠른 GABA 차단제로 생각할 수 있다. 또한 GABA 차단제의 경우 장기기억강화 현상보다 장기기억억제 현상이 나타난다고 보고되어 있다. 이러한 결과만으로 단순히 해석하는 것보다는 추후 동물모델의 행동학적 연구 결과에서 반영되는지를 확인해야 할 것이다. 다만 본 연구의 장점은 행동학적 연구 방법을 시행하기 이전에 다중채널전극기를 이용하여 보다 빠르고 정밀하게 약물의 작용기전에 대한 특성을 파악할 수 있을 것이다.

아토피 피부염에 대한 자초, 어성초, 부평초를 함유한 복합추출물의 개선효과에 대한 연구

한세영 경희대학교 대학원 2021 국내박사

Atopic dermatitis (AD) is a chronic inflammatory skin disease with skin barrier dysfunction, eczematous lesions, severe itching, and abnormal immune responses. Lithospermum erythrorhizon (LE), Houttuynia cordata (HC), Spirodela polyrhiza (SP) are used in traditional medicine in Asia and have known that have anti-atopic effects in previous studies. However, these extracts had toxicity that causes severe side effects on the liver. The aim of this study was to evaluate the effect of a mixture of three kinds of extracts on 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB)-induced atopic dermatitis in BALB/c mice. We investigated the therapeutic efficacy of LE, HC, SP, LE + HC + SP mixture to see whether a mixture could decrease the toxicity and have a synergistic effect. BALB/c nude mice were challenged with DNCB on their back skin to induce atopic dermatitis-like lesion and orally administrated with LE, HC, SP, LE + HC + SP mixture 30mg/kg for 20 days at the same time. We evaluated the hepatotoxicity of extracts, dermatitis severity, histopathological changes. In addition, the level of immunoglobulin E (IgE) in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). AD-induced back skin morphological change was notably reduced by extracts treatment. The mixture treatment was especially more effective in inhibiting an increase in the thickness of the epidermis and the number of mast cells compared with each extract group. Moreover, the mixture treatment was inhibited IgE release compared with each extract group. Our results suggest that the mixture could be a more effective therapeutic agent for the treatment of AD. 아토피성 피부염 (AD)은 피부장벽 기능장애, 습진성 병변, 심한 가려움증 및 비정상적인 면역 반응을 동반한 만성 염증성 피부 질환이다. 자초 (Lithospermum erythrorhizon, LE), 어성초 (Houttuynia cordata, HC), 부평초 (Spirodela polyrhiza, SP)는 아시아권의 전통 의학에서 사용되고 있고, 이전 연구에서 항 아토피 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 허브 추출물은 간을 비롯한 장기에 심각한 부작용을 일으키는 독성이 있다고 알려져 있다. 본 연구의 목적은 BALB/c 누드마우스에 DNCB로 유발된 아토피 피부염에 대한 3가지 혼합 추출물의 효과를 평가하는 것이다. LE, HC, SP, LE + HC + SP 복합물의 치료 효능을 조사하여 복합물이 독성을 감소시키고 더불어 시너지 효과를 낼 수 있는지를 알아내고자 하였다. BALB/c 누드마우스의 등 피부에 DNCB를 도포하여 아토피성 피부염과 같은 병변을 유도하고 LE, HC, SP, LE + HC + SP 복합물 30 mg/kg을 동시에 20일 동안 경구 투여하였다. 그 후, 추출물의 간독성, 각 그룹간의 피부염 중증도, 조직 병리학적 변화를 평가하였다. 또한, 혈청 내 면역 글로불린 E (IgE) 의 수준은 효소결합면역흡착분석법 (ELISA) 으로 측정하였다. 아토피성 피부염으로 인한 등 피부의 형태 변화는 추출물 처리에 의해 현저하게 감소하였다. 복합물 군은 각 단일 추출물 군에 비해 표피의 두께가 감소하였고, 또한, 비만 세포 수의 증가를 억제하는데 더 효과적이었다. 더욱이 복합물 군은 각 단일 추출물 군에 비해 IgE 방출이 더 억제되었으며, 어성초와 부평초의 독성을 감소시키는 효과를 확인했다. 위의 결과들은 LE + HC + SP 복합물이 단일 추출물보다 아토피성 피부염 치료에 더 효과적인 치료제가 될 수 있음을 시사한다.

(The) neuroprotective effect of Kuibi-tang and it's components against dexamethasone treatment on hippocampal slice

손민숙 경희대학교 2010 국내박사

Object : we investigated the neuroprotective effect of KBT and its components against DXM-induced cell death on hippocampus. Moreover, one of the components of KBT, Zingiberis Rhizoma accounts for the most contents. Therefore, 6-shogaol, which is an active compound of Zingiberis Rhizoma and has well known to possess neuroprotective effect, was evaluated in the same of experimental conditions of KBT and its components Result: KBT enhances memory and increases cell proliferation in DG of the rat hippocampus.These findings have supported our results that demonstrated the protective effect of KBT on DXM-induced cell death. Furthermore, the present study also investigated the inhibitory effect of each herbal medicines of KBT on DXM-induced cell death in OHSC. We observed a significant suppression in DXM-induced neuronal cell death in OHSC by most of medicinal herbs composing KBT except for 5 herbal medicines. AGR, HR, ZSS, PR and JF particularly inhibited cell. AGR possesses a variety of pharmacological effects including immunoregulation, antioxidation, anti-tumor, anti-irradiation injury, and promotion of hematopoiesis and has been reported to protect from amyloid β-peptide-induced neurotoxicity. and experimental immunological colon injury in rat. This study suggests that the inhibitory effects of KBT on DXM-induced cell death in OHSC appeared via combined synergy effect of these herbal medicines with various pharmacological activities. In conclusion, our results show that treatment with KBT and its compositions not only improves learning and memory but also increases the proliferation of neuronal cells in the DG and CA3 regions of the hippocampus. 목적; 스트레스에 의한 뇌손상에 대해 보호효과가 좋은 처방을 찾아내어 스트레스에 유의한 치료법을 찾고 나아가 인지 능력 개선과 기억능력 개선의 효능이 있는 약물을 탐색하고자 한다. 방법; 기관형적 해마 절편 배양에서 귀비탕, 황련해독탕 그리고 총명탕을 처리한 후 덱사메타손으로 유발한 스트레스성 뇌세포 손상에 대한 보호효과가 있는지 살펴보기 위해 propidium iodide(PI) 염색을 통해 세포손상 정도를 관찰하였다. 관찰결과 유의하게 보호효과가 있는 것으로 밝혀진 귀비탕에 대햐여 농도별로 처리하였을 때 농도에 의존하여 보호 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 처방 각각의 구성 약재들의 기전을 탐색하기 위해 PI 염색을 통해 세포 손상을 관찰하고, 유의성있게 세포손상에 대한 보호효과를 보인 구성약재들의 동물모델에서 관찰하게 되었다. 또한, western blot 분석을 수행하여 이러한 약재들이 신경세포내의 작용 목표 반응을 단백질 수준에서 확인하였다. 결과; 기관형적 해마 절편 배양에서 황련해독탕, 귀비탕, 총명탕, 귀비탕의 구성약재, 그리고 생강의 유효성분인 6-쇼가올을 처리하여 덱사메타손으로 유발한 스트레스성 뇌세포 손상에 대한 보호효과를 살펴보았다. 동물실험에서는 기관형적 해파 절편배양에서 유의적인 효과를 나타낸 귀비탕, 백복신, 산조인, 생강 그리고 6-쇼가올을 경구투여 한 후 1시간 후에 덱사메타손을 복강주사 하였다. 1. PI 염색 각각의 처방과 덱사메타손을 처리하였을 때 덱사메타손 단독 처리한 군보다 귀비탕과 총명탕군은 통계적으로 유의하게 세포사멸이 적게 나타났다. 귀비탕의 구성약재와 덱사메타손을 함께 처리하였을 때 72시간 결과 후에 덱사메타손 단독 처리한 군보다 백복신, 산조인 군에서 통계적으로 유의하게 세포사멸이 적었다. 또한 생강과 생강의 유효 성분으로 알려진 6-쇼가올의 처리는 미세한 농도에서 세포사멸이 적은 것으로 나타났다. 2. 동물모델 Ex-vivo에서 유의적인 효능을 나타낸 백복신, 산조인, 귀비탕, 생강 그리고 6-쇼가올은 동물 모델의 뇌 해마 조직을 H&E stain 결과 DG와 CA3 부위에서 덱사메타손 단독으로 처리하였을 때 뚜렷한 chromatin 응축을 감소시켰다. 3. Western blot 귀비탕, 백복신, 산조인, 생강 그리고 6-쇼가올 군에서 MR, Hsp 70, 그리고 NeuN의 발현양상을 살펴본 결과 Hsp 70의 발현에는 의미 있는 결과를 보이지 보이지 않았고, MR의 경우 덱사메타손 단독으로 처리한 군에서 증가된 양상을 보이는 반면 구성물질의 처리와 귀비탕 처리에서는 그 증가가 감소되는 경향을 보였다. 이에 반대로 NeuN의 경우에 덱사메타손 단독으로 처리한 군에서 감소하는 경향을 나타내는데 반해, 각 구성물질과 귀비탕의 경우 덱사메타손 단독으로 처리한 군에 비해 증가하는 경향을 나타내었다.

Effects of nerve growth factor (NGF) on neuronal activity in the cultured organotypic rat hippocampal slice

양세라 경희대학교 2009 국내석사

The neurotrophins implicated in the acute regulation of synaptic plasticity and an essential role for p75NTR in supporting NGF-triggered TrkA signaling pathways mediating neuronal survival in hippocampal neurons (Hao et al., 1999; Culmsee et al., 2002). In this study, it was investigated that NGF-induced spatiotemporal neuronal activity changes in rat organotypic cultured hippocampal slice using MEA system. Therefore, we provide evidence that NGF may work LTP like effect via two receptors in a different manner in the cultured rat hippocampal slice.First, it was investigated the effect of NGF on neuronal activity using MEA system. NGF rapidly increased fEPSP activity and sustained synaptic potentiated activity like LTP after wash out. Next, it was investigated neuronal activity by treatment Trk receptor blocker and p75 receptor antibody to determine which pathway does NGF action. K252a, as a specific inhibitor of the action of NGF, has been used many experiment (Shinichi Koizumi et al., 1988). When treated of NGF together with K252a, the Trk receptor blocker, it was not blocked NGF-induced neuronal activity increment, but blocked synaptic potentiated LTP-like effect after wash out. Previously, K252a was reported to suppressed LTP induction and synaptic activity (Adriana et al., 2006; Martina et al., 2001), so this result show that K252a may block NGF-mediated LTP-like effect. In contrast with, when treated NGF together with anti-p75 antibody, it was completely inhibited both NGF-induced neuronal activity increase and LTP-like effect. Furthermore, it was investigated expression of TrkA receptor and p75 receptor in cultured slice by Western bolt analysis. TrkA receptor was readily detected 110 kDa band but p75 receptor was indistinctly detected 75 kDa band in cultured 0 day and 14 days tissues. This result indicated that there are expressed both TrkA receptor and p75 receptor in cultured rat organotypic hippocampal slice and NGF works through these receptors. As a result, there are two receptors in our experimental rat organotypic hippocampal slice and each blocker may inhibit NGF effect in a different manner. Furthermore, other studies showed that two receptors interact each other simultaneously or successive progress. In other words, this report used organotypic cultured hippocampal slice that similar actual in vivo condition and these observations show that NGF may work LTP like effect via two receptors. This observation is given understanding of NGF action in neurons. Neurotrophin (NT)은 발달중인 뇌에서뿐만 아니라 성인의 뇌에서도 신경세포의 생존 및 분화, 시냅스의 신경전달에 중요한 역할을 하는 단백질로서, 그것의 종류에는 Nerve growth factor (NGF), Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4/5 (NT-4/5) 가 있다. 뉴로트로핀는 세포 표면에 위치한 두 종류의 수용체 즉, Trk 수용체와 p75 수용체에 결합하여 그 작용을 나타낸다. Nerve growth factor (NGF)는 제일 처음 발견된 뉴로트로핀으로 CNS와 PNS에서 신경 세포의 생존, 분화, 유지에 중요한 역할을 한다. CNS에서 NGF는 신경 영양적인 역할을 하고, 신경 퇴행성 질병이나 연령에 따른 신경 손상 등에 있어서 보호작용을 한다. NGF의 작용은 세포 표면에 위치한 TrkA 수용체와 p75 수용체의 두 가지 NGF 수용체에 의해 발현된다고 알려져 있다. TrkA 수용체를 통한 반응은 Ras, mitogen-activated protein kinase (MAPK), phoshoinositol-3- phosp hate-kinase 등의 활성을 통하여 신경세포의 생존과 분화가 일어난다고 알려져 있다. 그리고 p75 수용체를 통한 NGF의 작용에서는 Death domain을 통해 신경세포가 사멸된다고 알려져 있지만, p75 수용체를 통한 작용은 TrkA 수용체와 함께 신경 세포 사멸과 생존의 조절에 관련된다는 연구 결과도 있어, 더 많은 연구가 필요하다. 또한 NGF가 다양한 조건에서 칼슘 채널에 작용하여 매우 빠른 시간 내에 세포 내부로 칼슘 유입을 증가시키고, 신경전달물질의 분비량을 증가시킨다는 보고가 있다. 본 연구에서는 정상조직과 유사한 구조와 연결성을 가진 배양된 기관형성적 해마 절편에서 NGF가 시냅스의 활동성에 어떠한 영향을 주는지, 그리고 그것이 TrkA 수용체와 p75 수용체 중 어떠한 경로를 통하여 이루어지는지를 Multi-electrode arrary (MEA) system을 이용하여 관찰하였다. NGF는 MEA상에서 시냅스의 활동성을 측정하는 동안 200 ng/ml의 농도로 30분 동안 처리되었으며, 처리되는 동안 neuronal activity 증가 효과를 보였고, 시냅스 강화를 하여 wash 후에도 증가된 activity가 그대로 유지되어 마치 LTP와 같은 효과를 나타내었다. 그 후 이러한 NGF의 작용이 NGF 수용체와 어떻게 작용하여 이루어지는가를 알아보기 위해서 NGF의 수용체에 대한 실험을 수행하였다. 이것은 NGF가 결합하는 두 수용체들의 작용을 억제함으로써 확인하였는데, Trk 수용체 억제제인 k252a를 동시에 처리해주었을 경우에는 NGF에 의한 작용이 완벽히 억제되지 않았으나, 반면에 p75 수용체의 항체를 동시에 처리해준 경우에는 NGF의 작용이 억제되어 나타나지 않는 것을 관찰하였다. 다시 말해서, Trk 수용체 억제제인 k252a를 처리한 경우에는 NGF 처리 시간 동안 나타났던 neuronal activity 증가는 막지 못하였으나, wash후의 시냅스 강화에 의한 효과는 억제하는 것을 관찰할 수 있었다. 이것은 선행된 다른 연구들에서 k252a가 LTP 유도를 억제한다거나 synaptic activity를 억제한다는 결과들로 미루어 볼 때 NGF에 의한 LTP-like한 효과를 억제한 것으로 보인다. 또한 k252a는 TrkA receptor뿐만 아니라 다른 Trk receptor family 모두와 작용을 하기 때문에 다른 member들에도 영향을 준 것으로 생각된다. 반면에 p75 antibody를 처리한 경우에는, 이것이 p75 수용체를 block함으로써 NGF에 의한 neuronal activity 증가와 LTP-like한 효과를 모두 억제하는 것으로 관찰되었다. 그리고 실험에 사용한 해마 절편 시료에서 NGF 수용체들의 발현을 Western blotting 방법으로 관찰하였는데, 배양 0일과 14일의 해마 절편에서 TrkA 수용체와 p75 수용체의 단백질 발현을 관찰한 결과, TrkA 수용체는 110 kDa 에서 쉽게 관찰되었지만 p75 수용체는 75 kDa 에서 약간 희미하게 관찰되었다. 따라서 본 실험에서 관찰된 배양된 기관형적 해마 절편에는 NGF 수용체인 TkrA와 p75 수용체가 존재하며, NGF에 의한 neuronal activity 증가와 LTP-like한 시냅스 강화에는 NGF의 두 가지 수용체가 각기 다른 시간차이를 두고 작용을 하는 것을 알 수 있었다. 처음 neuronal activity 증가에는 p75 수용체가 좀더 특이적으로 관여를 하고, 후에 시냅스 강화가 일어나서 LTP-like한 작용에서는 Trk 수용체가 중요하게 작용하는 것으로 생각된다. 이러한 해마의 시냅스의 활동성에 대한 NGF의 작용의 연구결과는 앞으로 Neurotrophin의 신경 활동성 역할에 대한 연구적인 뒷받침이 될 것이다.

포름알데히드(HCHO) 측정용 전기화학센서의 일산화탄소(CO) 간섭

김미리 한국방송통신대학교 대학원 2018 국내석사

실내공기 오염의 대표적인 물질인 HCHO(포름알데히드)의 측정을 위하여 지난 20년 동안 여러 가지 방법을 사용하여 왔으나 HCHO의 노출정보를 실시간으로 제공받기 어려웠다. 이러한 문제를 해결하기 위한 노력으로 우수한 선택성의 소형 전기 화학 센서가 1980년대 중반에 개발되어 다양한 독성가스를 검출 할 수 있게 되었다. 전기화학센서는 목표가스와 반응하여 가스 농도에 비례하는 전기신호를 생성함으로써 작동한다. 이러한 측정기술은 지난 10년 동안 장치의 소형화에 크게 기여하였고 현재는 측정기술의 진보로 실시간 정보를 이용할 수 있는 감지 계측기가 보편화 되어 있다. 그러나 전기화학센서는 타 가스에 대한 간섭이나 기타 환경 조건에 민감하게 반응하는 단점이 있으므로 측정의 정확도가 의심되어왔다. 본 연구에서는 전기화학식 가스 센서를 이용하여 HCHO를 측정할 때 자연적인 현상으로 발생하는 CO(일산화탄소)의 간섭(干涉)에 대한 데이터를 확보하여 동일한 센서를 이용하여 HCHO 성분을 측정할 경우 정확한 보정치(補正値)를 고시(告示)하여 측정의 신뢰도를 높이고자한다. 실험방법으로는 전기화학식 HCHO 가스 센서에 일정한 농도의 CO 가스를 노출시켜 간섭량을 확인하고, HCHO 가스와 CO 가스가 혼합된 상황에서의 간섭량을 측정하였다. 두 실험의 결과 간섭량이 21%로 일치함을 확인하였다. 그러므로 동일한 센서를 이용하여 HCHO를 측정할 경우 CO 가스도 같이 측정하여 그 간섭량에 대한 보정치를 적용하여야 할 것이다.

Electrophysiological study of JBPOS0101 on status epilepticus using a multi-electrode array system

황은상 경희대학교 대학원 2019 국내박사

간질 중첩증은 간질발작이 5분 이상 지속되거나 5분 이내에 2회 이상의 발작증상이 중첩되어 발생하는 것을 일컫는다. 이런 형태의 간질은 회복이 일어날 시간적 여유를 주지 않고 연속적으로 일어나 뇌 손상 및 사망에 이르기가 쉬워 신경학적인 응급 상태로 분류된다. 많은 연구들이 이를 극복하고자 많은 약물들이 이용되고 있으나 간질 중첩증 후기 단계에서 이러한 약물들에 대해 내성이 나타나 치료에 어려움을 겪고 있다. 이 연구에서는 필로카르핀을 이용하여 organotypic 조직 배양을 이용하여 해마에서 간질 중첩증을 유도하고 새로운 항경련제 후보인 JBPOS0101의 약효를 연구하였다. 또한 glutamatergic / GABAergic 수용체의 길항제 및 작용제를 이용하여 JBPOS0101의 타깃 메커니즘을 조사하였다. 먼저, 배양된 해마 조직을 multi-electrode system으로 옮겨온 후 고농도의 포타슘을 함유한 인공뇌척수액을 흘려주고 필로카르핀을 후에 처리하여 간질 중첩증을 유도한 뒤 JBPOS0101를 처리하였다. JBPOS0101은 필로카르핀으로 인해 증가한 spike의 수를 감소시켰으며 이는 농도가 높아짐에 따라 더 효과적이었다. 다음으로 타깃 메커니즘을 밝히기 위해 동일하게 해마 조직을 옮긴 후 인공뇌척수액에 각 수용체에 대한 작용제와 길항제를 JBPOS0101와 함께 또는 따로 처리하였다. 결과적으로 JBPOS0101은 metabotropic glutamate receptor (mGluR)의 subtype인 mGluR1와 mGluR7에 대한 길항제로서 mGluR4에 대한 작용제로서 역할을 하였다. 이러한 결과들은 지금까지의 약물들과 다르게JBPOS0101이 mGluR 시스템을 조절함으로써 간질 중첩증에 따른 spike의 크기 및 빈도를 조절한다는 것을 암시하며, 약물 내성을 가진 간질에 대하여 현존하는 약물들을 대체할 수 있는 좋은 후보 물질로 사려된다. Status epilepticus (SE) is a single epileptic seizure lasting more than 5 minutes or two or more seizures within a five-minute period without the person returning to normal between them. SE represents the most severe form of epilepsy. Several chemicals are used to make SE model to test drugs that overcome SE. Pilocarpine is a potent muscarinic agonist and used popularly to generate SE and also temporal lobe epilepsy. Therefore pilocarpine-induced SE model is used a potent antiepileptic drug screening test. In this study, it was investigated whether JBPOS0101 has effects on SE using cultured organotypic hippocampal slices by treating pilocarpine in multielectrode array (MEA) system. An MEA can be defined as a two-dimensional arrangement of multiple electrodes. It has been widely used in long-term extracellular recording of electrophysiological activity from neuronal networks and slice tissues, and has served as a test platform for screening drugs. In addition, for the further study related with mechanism of JBPOS0101, several targets (mGluR 1, 4, 5, 7) related with seizure was selected and tested the functional role of JBPOS0101 as an agonist or an antagonist to the targets. JBPOS0101 showed dramatically decreased the number of spikes in both low level and high level. JBPOS0101 has a high possibility as a drug that overcome drug resistance of SE. Also, JBPOS0101 functions as antagonist to mGluR1 but doesn’t have any effects on mGluR5, and in case of type III mGluR, it functions as agonist to mGluR4 and antagonist to mGluR7. These results suggested JBPOS0101’s specific target mechanism and play an important role as a clue to invent new drugs to overcome SE later.

축산악취 방지를 위한 분무용 환경개선제 효과 연구

이영순 한국방송통신대학교 대학원 2022 국내석사

Objectives : While civil petitions related to the livestock malodor are increasing year after year, livestock farmers are widely using spray-typed environmental improvement materials as an alternative to solve them. There is, however, a lack of data to determine the effectiveness of the product to improve malodor. Accordingly, this study aimed to investigate the effectiveness of spray-typed environmental improvement materials being distributed in Korea. Methods : In this study, after spraying the environmental improvement agent into the swine excreta, the change in the concentration of NH₃and H2S was measured, which has a high level of malodor contribution and emission concentration among livestock odors. The experiment was conducted by dividing it into two conditions: one with light and the other without light. The two experiments differed in experimental conditions such as whether light was irradiated, the blending ratio of sows’ excreta, and the incubator standard. Experiment 1 was conducted under the condition without light, and three environmental improvement products (EV, ML, GY) such as effective microorganisms or livestock malodor prevention materials were selected and sprayed on the excreta which is a mixture of feces and urine at a ratio of 1:1 obtained from sows, and then the results were evaluated. Experiment 2 was conducted under the condition with light, and three environmental improvement products (LC, ML, GY) were sprayed on the excreta which is a mixture of feces and urine at a ratio of emission source composition obtained from sows, and then the results were evaluated. In addition, in case of experiment 2, the effect of the environmental improvement materials concentration was additionally compared and evaluated. Results : In experiment 1, as a result of observation for 24 hours, the amount of NH₃and H2S generated increased in both the control (C) and the group where the environmental improvement materials were sprayed (E). As a result of spraying the environmental improvement materials once every three days for 24 days, it was confirmed that NH₃was reduced 100% on the end of the experiment when ML was sprayed, and it had the highest effect on H2S reduction, which means ML had a malodor reduction effect. EV was effective only in some groups of both NH₃and H2S, and GY was shown to have a reduction effect in NH3, and H2S was more effective than C until the 21st day, but on the 24th day the amount of occurrence was higher than that of C, which confirmed that the relationship between the occurrence of malodor and the spraying period should be identified in advance. In experiment 2, as a result of observation for 24 hours, the amount of H2S generated was less in E than in C (<.001), and the amount of NH3 generated from E increased alike C, which confirmed that there was no effect. In 34th day’s observation, it was confirmed that regarding both NH3 and H2S, E was more effective than C, and the effect of ML was the highest. (<.001) In experiment 3, as a result of the experiment by materials concentration, ML showed a similar effect at all concentrations, and it was confirmed that the effect was slightly higher when used twice more than the recommended amount in both LC and GY. In this study, it was confirmed in all experiments with various methods that materials that showed more continuous efficacy than C were ML, and both NH3, and H2S were effective regardless of the mixed ratio and duration. In two materials, LC and GY, however, when sprayed repeatedly for a long period of time according to the usage instructions, the amount of NH3, and H2S generated was not continuously effective, but decreased after 30 days, so it can be verified that the treatment of environmental improvement materials reduce NH3, and H2S. In addition, it was confirmed that the effect was shown in products using Bacillus sp and Lactobacillus sp, which are frequently used among environmental improvement materials. Conclusions : This study shows that various research data are required to select environmental improvement materials according to the breeding type and excretory nature of each livestock farm, and it is necessary to develop an appropriate recommended amounts and accurate usage method and to study the economic feasibility with accordance to the effect. Keywords: Spray-typed Environmental Improvement Materials, Prevention of Livestock Malodor, Concentration of NH₃and H2S 연구배경 : 축산악취 민원이 해를 거듭하며 증가하고 있으며, 축산농가에서 이를 해결하기 위한 대안으로 분무용 환경개선제를 널리 사용하고 있다. 그러나 악취개선을 위한 제품에 따른 효과를 규명한 자료는 부족한 실정이다. 이에 국내 유통 중인 분무용 환경개선제의 효과를 규명하고자 본 연구를 수행하였다. 연구방법 : 본 연구에서는 양돈분뇨에 환경개선제를 분무한 후 축사악취 중 악취기여도와 배출 농도가 높은 NH3와 h2s의 발생농도 변화를 측정하였다. 실험은 무광조건과 유광조건의 두 가지로 구분하여 수행되었는데, 두 실험은 빛의 조사 여부, 모돈 분뇨의 배합비율, 인큐베이터 규격 등 실험조건에 차이가 있었다. 무광조건인 실험1은 유용미생물 및 축산악취 방지용 제재와 같은 환경개선제 3종(EV, ML, GY)을 선별한 후 모돈에서 분리 채취한 분과 뇨를 1:1로 혼합한 분뇨에 분무하여 평가하였다. 유광조건인 실험2도 환경개선제 3종(LC, ML, GY)을 모돈에서 분리 채취한 분과 뇨를 배출원 조성비로 혼합한 분뇨에 분무하여 평가하였다. 실험2의 경우 추가적으로 환경개선제 농도에 따른 효과를 비교 평가하였다. 연구결과 : 실험1에서 24시간 관찰결과 대조군과 마찬가지로 환경개선제를 분무한 처리군에서 NH₃와 H2S의 발생량이 증가하였다. 24일 동안 3일에 1회 환경개선제를 분무한 결과 ML은 실험종료 일에 NH3 100% 저감효능을 보였으며 H2S 또한 가장 높은 효과를 나타내어 ML을 처리한 경우 효과가 있는 것으로 확인되었다. EV는 NH3와 H2S 모두 일부 구간에서만 효과가 나타났고, GY에서 NH3는 저감효능이 나타났고, H2S는 21일까지 대조군보다 효과가 있었으나 24일엔 대조군보다 발생량이 높아 분뇨의 발생과 분무 기간과의 관계를 파악하여 분무해야 할 것으로 확인되었다. 실험2에서 24시간 관찰결과 H2S 발생량은 대조군보다 처리군에서 H2S 발생량이 적게 나타났으며(<.001) NH3 발생량은 대조군과 같이 증가하여 효과가 없는 것으로 확인되었다. 34일 관찰에서 NH3와 H2S 모두 처리군에서 대조군보다 효과가 있는 것으로 확인되었고, ML의 효과가 가장 높은 것으로 확인되었다.(<.001) 실험3에서 제품의 농도별로 실험한 결과 ML은 모든 농도에서 비슷한 효과가 나타났고 LC와 GY 두 제품에서 권장량보다 2배를 사용하였을 때 효과가 조금 더 높은 것으로 확인되었다. 본 연구에서 다양한 방법의 모든 실험에서 대조군과 환경개선제 처리와 비교하여 대조군보다 지속적인 효능을 나타낸 제품은 ML로서 분뇨의 성상과 기간에 관계없이 NH3와 H2S 모두 효능이 있음이 확인되었으나, LC와 GY 두 제품들에서는 사용방법에 따라 장기간 반복 분무했을 때 NH3와 H2S의 발생량이 지속적인 효과는 없었으나 30일 이후 감소한 것이 확인되어 환경개선제 처리로 인하여 발생량의 저감효능을 확인할 수 있었다. 또한, 환경개선제 중 사용빈도가 높은 Bacillus sp와 Lactobacillus sp를 사용한 제품에서 효과가 나타난 것으로 확인되었다. 결론 : 본 연구결과 각 농장의 사육형태와 분뇨의 성상에 따라 맞는 환경개선제 선정을 위하여 환경개선제의 다양한 연구결과 자료가 요구되며, 적정한 권장량과 정확한 사용방법을 개발하고, 효과에 따른 경제성에 대한 연구도 필요하다고 판단된다.