형광검색법을 이용한 환경오염물질의 상호작용에 관한 연구 = Use of CALUX bioassay for the interaction of environmental pollutants

국문 초록 (Abstract)

내분비계 장애물질 (endocrine disrupter)은 환경호르몬이라고도 하는데 이는 동물이나 사람의 몸속에서 천연 호르몬과 유사하게 작용해서 호르몬의 작용을 방해하거나 혼란시키는 물질을 총칭하는 말이다. 또한 지방조직과 결합하여 생태계의 오염을 증가시키고 먹이사슬을 통한 인체 내의 축적을 야기 시킨다.
Dioxin, Phthalate plasticizer, Hydroxylated polychlorinated biphenyls 등이 대표적인 내분비계 장애물질이며, 이들은 도시쓰레기 소각 시 또는 염소 등을 사용하는 산업공정에서 주로 발생될 수 있다 (Safe, 1995: Yang, 1995). 이 물질들은 생식 및 발생상의 장애, 발암성 면역 기능 억제, 간독성, 체중감소 및 급성 치사 등 생체에 심각한 피해를 야기하는 것으로 알려져 있다 (Colborn, 1995; Yang, 1999).
그 동안 다이옥신 등의 내분비계 장애물질의 측정에는 GC-MS, GC, HPLC와 같은 고가의 분석 장비가 사용되어 왔으나 이 장비의 이용은 많은 시간을 필요로 함과 동시에 수주의 시간이 필요하여 효율적이지 못하다. 이에 따라 우리 주변에 널리 펴져 있는 많은 양의 시료를 신속하게 측정하기에는 적합하지 않다 (Ziccardi et al., 2000). 또한 분석 장비를 이용한 방법은 오염물질의 개별적인 농도는 정확하게 측정할 수 있었으나 두 개 이상의 물질이 혼합되어 있는 경우 생체 내에서 나타날 수 있는 상승효과나 길항작용은 분별할 수 없다. 실제로 환경 중이나 식품 중의 시료에는 단일 물질로 오염된 경우는 드물며 대부분 여러 물질이 혼합 된 상태로 존재함으로 분석 장비만을 이용한 결과는 실질적인 인체 위해성을 과소 또는 과대평가 할 가능성이 있다 (Shelby et al., 1996; Gaido et al., 1997; Gray, 1997).
생체 검색법은 이미 잘 알려진 강력한 내분비계 장애물질이 세포에 반응하는 정도를 기준으로 하여 시료중의 내분비계 장애현상이 얼마나 있는가를 상대적으로 평가하는 상대적 평가 체계이다. 따라서 검색법의 바탕이 되는 세포의 특성에 따라 기준이 되는 다이옥신 등의 내분비계 장애물질의 대사 또는 작용의 차이가 나타날 수 있으므로 어떠한 세포 모델을 사용하느냐가 실질적인 인체 위해성 평가에 많은 영향을 줄 수 있다. 지금까지 생체 검색법에 사용하고 있는 암 세포 모델들은 내분비계 장애물질의 대사나 세포내 작용측면에서 정상적인 세포의 작용을 정확하게 반영 할 수 없는 단점을 가지고 있다. 그러므로 내분비계 장애물질의 표적이 되는 인체 장기조직으로부터 추출한 세포를 이용한 검색방법은 인체 표적장기의 특성을 최대한 반영할 수 있는 세포 체계로서 세포내 대사 등 세포의 특성이 고려되어 개선된 방법이라 할 수 있다.
본 연구에서는 HKY1.7 세포를 이용하여 다양한 농도의 TCDD (0.01 ~10 nM)에 노출 시켜 luciferase activity를 비교한 결과 용량-의존적인 증가를 보였으며, 5 nM에서 가장 높은 RLU 값을 나타내었고 10 nM에서 서서히 감소하였다. 이를 통해 환경 중에 존재하는 다양한 농도의 오염물질들을 TCDD 농도에 비교한 값으로 환산 할 수 있을 것으로 사료된다.
PCB-126과 PCB-169 (0.1~100 nM)를 각각 24시간 동안 처리하고 luciferase activity를 측정한 결과 PCB에 대해 용량-의존적인 증가를 보였기 때문에 TCDD 독성 등가 값을 이용하여 PCB의 위해성 정도를 예측 할 수 있었다.
본 연구에서는 낮은 농도의 TCDD에서는 PCB-126과 PCB-169의 용량에 따른 RLU 값의 상승을 확인 할 수 있었으나 높은 농도의 TCDD에서는 PCB-126과 PCB-169에 의한 luciferase 반응의 저해 현상을 확인 할 수 있었다. PCBs에 의한 RLU 값의 감소는 TCDD에 의해 결정되는 독성 등가 값이 PCB-126에 비해 낮은 PCB-169에서 더욱 뚜렷하게 나타났으며 이는 PCB-169가 AhR에 결합하는 능력은 비슷하나 상대적인 독성 정도가 낮기 때문인 것으로 사료된다. 또한 TCDD와 PCBs가 혼재하는 환경오염물질의 위해성을 평가하기 위해서는 TCDD와 PCBs의 순수한 양을 알 수 없으므로 실제적인 위해정도를 측정할 수 없다. 따라서 추출 단계에서의 TCDD와 PCBs 등의 순수분리 단계가 필요할 것으로 사료된다.
본 연구 결과는 유전자 재조합 기술로 firefly luciferase를 발현하는 인체 상피세포 모델을 이용하여 대표적인 환경오염 물질인 TCDD, PCBs 등과 같은 내분비계 장애물질의 보다 신속한 독성평가에 활용 될 수 있고 TCDD와 PCBs가 혼합되어 있는 시료에서는 TEF 값을 기반으로 한 total equivalency (TEQ)값을 확립하고 이를 토대로 한 측정법의 활용이 필요할 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) and Polychlorinated biphenyls (PCBs) are ubiquitous chemicals that draw public concern over the environmental contamination. Assessment of exposure from these chemicals is often difficult and inefficient due to the heavy cost and time-consuming process. The Chemically Activated LUciferase gene eXpression (CALUX) bioassay is a reporter gene mammalian cell bioassay that is nowadays often used as a rapid and inexpensive screening and semi-quantitative method for the analysis of TCDD and PCBs. CALUX bioassay has proven valuable for screening for and assessing toxic equivalents of dioxin-like compounds, because it detects all AhR ligands in a variety of sample matrices. Recently, the CALUX bioassay based on human epithelial cell origin, namely, HKY1.7, has been developed and showed an excellent detection efficiency. This study used the human cell bioassay to detect the interaction between the most potent AhR agonist, TCDD, and PCB congeners. While increase of RLU value over PCB exposure was dose-dependent in presence of low dose TCDD, the pattern of increase was significantly dampened in the presence of high dose TCDD. The results suggest that high concentration of TCDD in the sample may interfere with the actual response of PCB exposure and lead to the underestimation of PCB toxicity. Higher receptor affinity of TCDD over PCB congeners may dominate the AhR receptors in the cells and block the response of PCB exposure. The results further imply that, in the mixture samples, high concentration of TCDD may underestimate the true values of TEQ in the sample by lowering the sum of TEQ values from PCB exposure. This study demonstrated that presence of potent AhR agonist, TCDD, in the sample interferes with the toxic estimation from PCB exposure, suggesting that the presence of specific strong AhR agonists in the sample should be identified to take into account the competition over the same receptor sites and improve the assessment of environmental chemicals.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 연구 방법 4
• 1. Material 4
• 2. Determination of TEQ 4
• 3. HKY1.7 - transfected cell line 5
• 4. 세포배양 5
• 5. Chemical treatment 5
• 6. Measurement of luciferase activity 6
• 7. 96well plate luciferase activity 6
• 8. Date analysis 6
• Ⅲ. 결과 7
• 1. TCDD 농도에 따른 luciferase activity 7
• 2. PCB-126, PCB-169 농도에 따른 luciferase activity 7
• 3. TCDD와 PCB-126에 함께 노출된 경우의 luciferase activity 7
• 4. TCDD와 PCB-169에 함께 노출된 경우의 luciferase activity 7
• Ⅳ. 고찰 15
• 참고문헌 18