병풍쌈(Cacalia firma Komar) 추출물의 항산화 활성과 세포독성에 관한 연구 = Antioxidant Activity and Cytotoxicity of the Extracts from Cacalia firma Komar.

국문 초록 (Abstract)

강원도 지역의 백두대간에서 채취한 것을 구입한 병풍쌈을 70% 에탈올로 추출하여 얻은 추출물로부터 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 층으로 분획하여 5가지의 분획물을 얻었다. 이렇게 얻어진 병풍쌈 분획물에 대한 항산화 활성, 다양한 인간 암세포에 대한 세포독성 효과를 MTT assay를 통하여 알아보았고, Salmonella typhimurium TA98과 TA100 균주를 사용한 Ames test를 이용하여 돌연변이원성 및 항돌연변이원성을 검토하였으며 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. Gallic acid를 이용해 표준 검량선을 작성하여 이로부터 병풍쌈 추출물에 존 재하는 총 페놀 화합물 함량을 측정하였으며, 실험 결과 분획물 1mg에 포함 되 어 있는 페놀화합물은 클로로포름, 물, 부탄올, 에틸아세테이트 분획물에서 각각 87.2μg, 105.3μg, 137.4μg, 141.2μg으로 나타났다.
2. 병풍쌈 분획물의 수소전자공여능은 50 μg/mL의 농도에서 물 분획물 33.8 μg/mL, 클로로폴름 분획물 35.2 μg/mL, 부탄올 분획물 74.6 μg/mL, 에틸아세테 이트 분획물 90.5 μg/mL으로 나타났다. ABTS radical에 대한 항산화 활성을 측 정한 결과, 10 μg/mL의 농도에서 물, 클로로포름, 부탄올, 에틸아세테이트 분획 물이 각각 11.4 μg/mL, 17.1 μg/mL, 55.8 μg/mL, 84.3 μg/mL으로 나타났다. 또 한 FRAP법을 이용한 환원력을 측정한 결과, 100 μg/mL의 농도에서 물 분획물 31.5 μg/mL, 클로로포름 분획물 32.9 μg/mL, 부탄올 분획물 64.8 μg/mL, 에틸아 세테이트 분획물 89.9 μg/mL으로 나타났으며, 각각의 실험 결과 에틸아세테이트 분획물의 항산화 활성이 가장 높은 것으로 나타났다.
3. 전자스핀공명분광기(ESR)을 이용해 hydroxyl, superoxide, galvinoxyl radical과 tert-butyl hydroperoxide radical에 대한 효과를 측정하였다. Hydroxyl과 superoxide radical의 측정 결과 100 μg/mL의 농도에서 물 분 획물 27.7%, 34.8%, 부탄올 분획물 40.1%, 55.8%, 에틸아세테이트 분획물이 71.9%, 73.8%의 소거활성을 나타냈으며, galvinoxyl radical의 경우 300 μg/mL의 농도에서 물, 부탄올, 에틸아세테이트 분획물이 각각 60.8%, 74.3%, 90.2%의 소거활성을 보였다. 또한 tert-butyl hydroperoxide는 30 μg/mL의 농도에서 물 분획물 60.1%, 부탄올 분획물 73.5%, 에틸아세테이트 분획물 85.8%의 소거활성을 보였으며, 전자스핀공명분광기를 이용한 각각의 radical 소거활성을 측정한 결과, 에틸아세테이트 분획물에서 70% 이상의 소거활성이 나타났다.
4. PC12에 H2O2를 처리해 세포사멸을 유발했을 때, 병풍쌈 에틸아세테이트 분 획물의 세포내 산화적 스트레스에 대한 억제효과를 알아보았다. 병풍쌈 에 틸아세테이트 분획물 100 μg/mL의 농도에서 85% 이상의 세포가 생존하는 것을 확인하여 시료 최대 농도로 정하여 실험하였으며, 400 μM H2O2 단독 처리했을 때 45.3%의 세포 생존율을 나타냈지만 100 μg/mL의 시료를 처리 하자 세포 생존율이 72.2%까지 상승하는 것으로 나타났다.
5. DNA 전기영동을 이용하여 병풍쌈 분획물 농도별 hydroxyl radical에 의해 유도된 DNA strand breaking에 미치는 효과를 알아보기 위해 2.5 mM H2O2와 250 μM의 FeSO4를 사용하여 hydroxyl radical을 유발하였다. 병풍 쌈 에틸아세테이트 분획물 25 μg/mL을 처리했을 때 대조군으로 사용한 동 일한 농도의 (-)-epicatechin에 의한 DNA damage 보호효과와 유사하게 나 타났다.
6. Hep3B, A549, AGS, HeLa를 이용하여 암세포에 대한 생육억제 효과를 살펴 본 결과 에틸아세테이트 분획물의 농도 1 mg/mL에서 Hep3B는 87.1%, A549는 76.3%, AGS는 72.6%의 암세포 생존 억제 효과를 나타내었다. 그러 나 HeLa의 경우 모든 분획물에서 45% 이하의 억제효과를 보여 다른 암세포들에 비해 비교적 낮은 암세포 성장 억제 효과가 있음을 나타내었다. 반면 인간 정상 간세포인 chang에 대한 세포독성을 확인한 결과 시료농도 1 mg/mL에서 모든 분획물이 30% 이하의 억제 효과를 나타내어 시료 자체 의 독성은 없는 것을 확인할 수 있었다.
7. Salmonella typhimurium TA98과 TA100 균주를 이용한 Ames test 결과 병 풍쌈 분획물 자체의 돌연변이원성은 없었으며, 직접변이원인 4NQO(0.15 μg/plate)에 대한 시료 최고농도인 200 μg/mL에서 TA98과 TA100 모두 에 틸아세테이트 분획물의 돌연변이 생성 억제효과가 가장 높은 것으로 나타났 으며, 각각 70.3%와 76.4%의 억제효과를 나타냈다. 또한 TA100 균주에 대한 직접변이원 MNNG(0.4 μg/plate)의 돌연변이 생성 억제효과를 측정한 결과 시료농도 200 μg/plate의 에틸아세테이트 분획물에서 72.1%의 억제 효 과를 보였다.
이상의 연구 결과에서와 같이 병풍쌈 분획물의 항산화 효과를 확인하였고, 암세포 생육억제 효과와 더불어 항돌연변이 활성을 검토함으로써 병풍쌈의 이용에 대한 기초적인 자료를 제공함이며, 특히 병풍쌈 에틸아세테이트 분획물에서 항산화 활성과 항암 및 항돌연변이 효과가 높게 나타났으므로 단일 활성 물질의 분리를 통한 유효성분을 규명하고 천연 항산화제, 항암제와 같은 의약품과 함께 건강기능식품 등의 이용가치를 높일 수 있는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study was carried out to investigate antioxidant, antimutagenic, cytotoxicity in human cell lines, and anticancer effects of Cacalia firma Komar. The extract of Cacalia firma Komar was fractionated to hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol and water. Methods used in this experiment were electron donating ability, ABTS radical scavenging, reducing power, hydroxyl · superoxide · galvinoxyl · tert-butyl hydroperoxide radical scavenging by electron spin resonance, protective effect of OH-induced DNA damage, MTT assay and Ames test. The results are summarized as follows:
Cacalia firma Komar contained polyphenol compound as 87.2 μg, 105.3 μg, 137.4 μg and 141.2 μg by chloroform, aqueous, butanol and ethyl acetate fraction. The inhibition of DPPH and ABTS radical scavenging activity and reducing power by the ethyl acetate fraction was 90.5%, 84.3% and 89.4% respectively(50 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL). The level of hydroxyl, superoxide and galvinoxyl radical scavenging in the ethyl acetate fraction was 71.0%, 73.8% and 90.2% respectively(100 μg/mL, 100 μg/mL, 300 μg/mL). The tert-butyl hydroperoxide scavenging activities in the ethyl acetate fraction of 30 μg/mL were 85.8%. Oxidative stresses by hydroperoxide(H2O2) were prevented by treatment with ethyl acetate fraction(10 ～ 100 μg/mL). The results of protective effect showed ethyl acetate fraction at 25 μg/mL on OH-induced DNA breaking in calf DNA.
Anticancer effects of each fraction against cancer cell lines including human hepatocellular carcinoma (Hep3B), human lung carcinoma (A549), human stomach adenocarcinoma (AGS), human cervical adenocarcinoma (HeLa) and normal liver cell (Chang) were investigated. The results showed that growth inhibition of the cancer cells in medium containing Cacalia firma Komar fraction were gradually inhibited to a significant degree in proportion to the increase of the extract concentration. The treatment of the ethyl acetate fraction from Cacalia firma Komar 1 mg/mL showed the highest growth inhibition with 87.1%, 76.3%, and 72.6% against Hep3B, A549 and AGS cells, respectively. Whereas, the growth inhibition against HeLa cell expressed below 45% in the same sample concentration(1 mg/mL). In addition, ethyl acetate fraction did not show any cytotoxicity against Chang cell.
In the Ames test, mutagenicity was not observed in all samples. Most of the samples showed high antimutagenic effects against mutation induced by MNNG and 4NQO. Ethyl acetate fraction(200 μg/plate) showed approximately 70.3% inhibitory effect on the mutagenesis induced by 4NQO against S. typhimurium TA98, whereas 76.4% and 72.1% inhibitions were observed on the mutagenesis induced by 4NQO and MNNG against S. thyphimurium TA100.
As a enhanced antioxidant, anticancer and antimutagenic effects were observed from Cacalia firma Komar extracts. Thus, the fraction of Cacalia firma Komar can be predicted for the possibility of prevention, cure and care of the diseases. Also our results indicated that Cacalia firma Komar have biological activity and functional materials. Therefore, we expect to conduct further experiment such as identifying its structures.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 연구사 = 4
• Ⅲ. 재료 및 방법 = 9
• 1 실험재료 = 9
• 1) 시료 = 9
• 2) 시약 = 9
• 3) 기기 = 10
• 2 실험방법 = 11
• 1) 시료의 조제 = 11
• 2) 항산화 활성 = 13
• (1) 병풍취 추출물의 페놀 화합물 측정 = 13
• (2) 수소전자공여능에 의한 항산화 활성 측정 = 13
• (3) ABTS radical에 의한 항산화 활성 측정 = 13
• (4) 환원력 측정 = 14
• (5) ESR에 의한 Hydroxyl radical 측정 = 14
• (6) ESR에 의한 Superoxide radical 측정 = 15
• (7) ESR에 의한 Galvinoxyl radical 측정 = 15
• (8) ESR에 의한 tert-butyl hydroperoxide 측정 = 15
• (9) 세포내 산화적 스트레스에 대한 억제효과 측정 = 15
• (10) Hydroxyl radical 유발에 의한 DNA damage 보호효과 측정 = 16
• 3) 세포 생육에 미치는 분획물의 영향 검색 = 17
• (1) 세포주 및 세포 생육배지 = 17
• (2) 암세포 성장 억제효과 = 17
• 4) Ames test를 이용한 돌연변이원성 유발 및 항돌연변이 활성 측정 = 18
• (1) 균주 = 18
• (2) 균주의 유전형질 확인 = 20
• (3) 균주의 보관 및 배양 = 21
• (4) 돌연변이원성 실험 = 26
• (5) 항돌연변이원성 실험 = 26
• 5) 통계처리 = 27
• Ⅳ. 결과 및 고찰 = 28
• 1. 항산화 활성 = 28
• 1) 병풍취 추출물의 페놀 화합물 = 28
• 2) 수소전자공여능에 의한 항산화 활성 = 30
• 3) ABTS radical에 의한 항산화 활성 = 32
• 4) 환원력 측정 = 34
• 5) ESR에 의한 Hydroxyl radical = 36
• 6) ESR에 의한 Superoxide radical = 39
• 7) ESR에 의한 Galvinoxyl radical = 42
• 8) ESR에 의한 tert-butyl hydroperoxide = 45
• 9) 세포내 산화적 스트레스에 대한 억제효과 = 48
• 10) Hydroxyl radical 유발에 의한 DAN damage 보호효과 = 50
• 3.세포 생육에 미치는 분획물의 영향 = 53
• 1) MTT assay를 이용한 암세포 성장 억제효과 측정 = 53
• 4.Amestest를 이용한 돌연변이원성 유발 및 항돌연변이 활성 = 60
• 1) 돌연변이원성 실험 = 60
• 2) 항돌연변이원성 실험 = 60
• Ⅴ. 결론 = 66
• Ⅵ. 참고문헌 = 69
• Abstract = 78