차세대 염기서열 분석을 이용한 세균성 점무늬병에 의한 고추 근권토양 미생물 군집 변화 연구 = Study on rhizosphere soil microbiome of red pepper (Capsicum annuum L.) with bacterial spot disease using Next Generation Sequencing (NGS)

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 토양과 고추에 세균성 점무늬병의 병원균인 Xanthomonas euvesicatoria 접종하여 점무늬병을 유발하고, 병징 발생, X. euvesicatoria 검출 및 병에 따른 엽록소 함량 변화를 통해서 점무늬병의 발생을 확인하였다. 또한, iSeq 100을 통한 차세대 염기서열분석과 생물정보학 tool인 Mothur를 사용하여, 세균성 점무늬병에 의한 근권토양 미생물군집의 변화를 확인하였다.
병원균을 고추 엽면에 접종한 PAD (병원균 미접종 A 토양 사용)와 PBD group (2주전 병원균 접종 B토양 사용)에서 반점, 황화 및 낙엽 등 점무늬병의 대표적인 병징이 발생하였으며, 병원균을 토양에만 접종한 PBC group과 토양 및 고추에 병원균을 접종하지 않은 PAC에서 점무늬병의 병징이 나타나지 않았다. 또한, X. euvesicatoria를 검출하기 위해, 종 특이성 primer set를 사용해 PCR을 한 결과, B soil, PAD 및 PBD group에서 뚜렷한 band 크기를 확인하였고, PBC group에서는 희미하게 나타났다. 반면에, A soil과 PAC group에서는 band가 나타나지 않았다. 점무늬병에 의한 엽록소 함량 변화를 확인하기 위해, 모든 시료의 엽록소 함량을 분석하였다. 그 결과, 병징이 나타나지 않은 PAC group의 chlorophyll-a, chlorophyll-b 및 total chlorophyll 함량이 유의하게 가장 높았으며, 점무늬병의 병징이 나타난 PAD 및 PBD group에서 유의적으로 낮은 함량을 나타냈다. 위의 결과에 따라, 토양에만 병원균을 접종한 PBC group은 병원균이 토양에서 식물로의 전이는 하지 못한 것으로 추정되며, PAD와 PBD group에서 세균성 점무늬병이 발병한 것을 확인하였다.
세균성 점무늬병에 의한 고추 근권토양 미생물 군집의 변화를 확인하고자, alpha-다양성, 미생물 군집 분포, beta-다양성, LEfSe분석을 시행하였다. alpha-다양성 분석 결과, Good’s coverage의 측정치는 0.922-0.933로 평균 0.927±0.004 값이 나왔으며, 약 92%의 OTU가 sequencing에 의해 제시됨을 의미하며, 이는 시료를 잘 대표한다고 볼 수 있다. 병징이 나타난 처리구(Disease group)와 대조구(Control group)간 alpha-다양성 지수를 비교 분석하였다. OTU 수, Chao 지수, Shannon 지수 및 inverse Simpson 지수는 유의적으로 처리구에서 낮은 결과를 나타냈다. 위 결과는 세균성 점무늬병이 미생물 다양성을 감소시키는 것을 나타낸다. 미생물 군집 분포 분석 결과 문 수준에서 Proteobacteria, Bacteria_unclassified, Actinobacteria 및 Candidatus Saccharibacteria 순으로 우점을 차지하고 있으며, 비교 분석한 결과, Candidatus Saccharibacteria, Verrucomicrobia, Chloroflexi, candidate_division_WPS-1 및 Gemmatimonadetes이 대조구와 처리구간 유의한 차이를 나타냈다. 속 수준에서 미생물 분포를 분석한 결과, 모든 근권 토양 시료에서 공통적으로 Bacteria_unclassified와 Candidatus Saccharibacteria_unclassified가 우점을 차지하였으며, 비교 분석한 결과 총 743종의 세균 속 중 Candidatus Saccharibacteria_unclassified를 포함한 50종의 미생물이 대조구와 처리구간 유의한 차이가 나타났다. 시료 간 다양성을 확인하기 위해, Yue & Clayton distance, Bray-Curtis distance 및 Jaccard distance를 사용하여, beta-다양성을 분석한 결과, Yue & Clayton distance와 Jaccard distance에서 대조구와 처리구간 유의한 차이가 나타났지만, Bray-Curtis distance에서는 유의적 차이가 나타나지 않았다. 각 distance를 바탕으로 비모수다차원 척도법(NMDS)과 주좌표법(PCoA)으로 도식한 결과, 대조구와 처리구간 클러스터를 형성하는 것을 확인하였다. 세균성 점무늬병이 발병한 처리구와 대조구간 유의적으로 차이가 있는 OTUs를 선별하기 위해 LEfSe 분석한 결과, 처리구에서 Rhodanobacter (OTU 1), Arachidicoccus (OTU 39), Candidatus Saccharibacteria (OTU 60, OTU 76) 및 Unclassified Xanthomonadales (OTU 76)이 나타났으며, 대조구에서는 Unclassified Subdivision3 (OTU 18, OTU 51), Unclassified Chitinophagaceae (OTU 20) 및 Unclassified Micropepsaceae (OTU 35)가 유의적으로 많이 분포하였다. 따라서 본 연구 결과는 세균성 점무늬병에 의한 고추 근권 미생물상이 변화하는 것을 의미하며, 식물병과 고추 근권 미생물 군집 간의 관계에 대한 생태학적 기초 연구 자료로써 활용될 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• I. 서 론 1
• II. 재료 및 방법 5
• 1. 고추 재배 및 실험 설계 5
• 1.1. 고추 및 병원균(Xanthomonas euvesicatoria) 5
• 1.2. 토양 aging 6
• 1.3. 고추 세균성 점무늬병 발병을 위한 병원균 접종 7
• 1.4. 시험구 조성 및 고추 재배 8
• 2. 토양 화학성 분석 및 잎 엽록소 함량 분석 10
• 2.1. 토양 시료 채취 및 고추 잎 채취 10
• 2.2. 토양 pH 및 전기 전도도 측정 11
• 2.3. 엽록소 추출 및 함량 측정 12
• 3. 분자생물학적 분석 13
• 3.1. DNA 추출 13
• 3.2. PCR을 이용한 토양 내 X. euvesicatoria 검출 14
• 3.3. 차세대 염기서열 분석 (NGS) 15
• 3.3.1. Library preparation 및 iSeq 100 run 15
• 3.3.2. Sequencing data Processing 21
• 3.3.3. OTU 기반 data 분석 23
• 4. 통계 분석 및 시각화 24
• III. 결과 및 고찰 25
• 1. X. euvesicatoria 에 의한 세균성 점무늬병 발병 25
• 1.1. 세균성 점무늬병의 병징 확인 25
• 1.2. 세균성 점무늬병에 따른 식물 병원균 X. euvesicatoria 검출 27
• 1.3. 세균성 점무늬병에 의한 엽록소 함량의 변화 29
• 2. 세균성 점무늬병에 의한 고추 근권토양 미생물군집의 변화 31
• 2.1. 고추 근권토양 미생물 군집의 alpha-다양성 분석 결과 34
• 2.2. 고추 근권토양 미생물 군집의 분포 및 비교 분석 42
• 2.2.1. Phylum(문) 수준의 고추 근권토양 미생물 군집의 분포 및 비교 42
• 2.2.2. Genus(속) 수준의 고추 근권토양 미생물 군집의 분포 및 비교 52
• 2.3. 고추 근권토양 미생물 군집의 beta-다양성 분석 결과 63
• 2.4. 고추 근권토양 미생물 군집의 LEfSe 분석 결과 66
• Ⅳ. 결 론 70
• Ⅴ. 참 고 문 헌 71
• 국 문 초 록 85