ACP-PCR 기법을 이용한 복제 수송아지 폐 조직 특이발현유전자 발굴 = Identification of Differentially Expressed Genes in Clone's Lung Tissue using Annealing Control Primer (ACP)-PCR

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 생후 6개월째에 폐 관련 질환으로 사망한 체세포 복제 수송아지 한경 100호의 병리학적 사망원인인 소합포성 폐렴과 아카노박테리아성 폐렴이 진단되어 직접적인 폐사의 사인이 호흡기질환 이외에 유전적인 부분에서의 원인을 분석하기 위하여 실시하였다.
복제 수송아지 한경 100호의 폐와 동일한 연령의 정상 수송아지의 폐를 이용하여 두 조직 간에 다르게 발현하는 유전자 (differentially expressed gene, DEG)를 발굴하고 그 유전자의 특성을 확인하기 위하여 annealing control primer (ACP)-PCR, cloning, sequencing, quantitative real-time PCR 및 semi-quantitative RT-PCR을 실시하였다.
본 연구를 통하여 얻은 결과는 아래와 같다.
1. Annealing control primer-PCR 기법을 이용하여 복제 및 정상 수송아지의 폐에서 총 46개의 DEG를 발굴하였다.
2. 발굴된 46개의 DEG들 중에서 12개의 복제소 특이발현 유전자를 확인하여 각 유전자의 특성을 확인하고자 염기서열 분석을 실시하였다.
3. 염기서열 분석을 통하여 유전자의 특성을 확인한 결과 복제 수송아지 한경 100호가 한우임이 확인되었으며, 또한 소의 구강, 폐 또는 비강 상피암 (palate, lung, and nasal epithelium carcinoma associated (PLUNC) 관련 유전자를 발굴하여 한경 100호의 사망원인이 감염성 폐렴 이외에 유전자 발현 이상에 따른 폐의 기능 이상일 가능성을 확인하였다.
4. 소 구강, 폐 또는 비강 상피암 관련 유전자를 정량 분석한 결과 복제 수송아지 폐 조직에서만 특이적으로 발현하는 것을 확인하였다.
이상의 연구 결과를 살펴보면 생후 6개월째에 감염성 폐질환으로 사망한 한경 100호의 경우 앞에서 언급한 병리학적 소견 이외에도 PLUNC 유전자의 과 발현에 의한 폐 기능의 이상이 사망원인의 중요한 한 요인이 될 수 있었음을 확인하였으며, 이 유전자의 유전적 특성에 대한 추가적인 연구가 이루어질 경우 복제동물 생산에 유용한 자료가 될 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The cloned Hanwoo male calf of Hankyong #100 was died by the result of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) and arcanobacterial pneumonia at 6-month old. This study was performed to determine the causes of the clone's death in genetical aspects in addition to the pathological diagnosis.
To identify and analyze the characteristics of the differentially expressed genes (DEGs) in cloned or normal lung tissue, annealing control primer (ACP)-PCR, cloning, sequencing, quantitative real-time PCR, and semi-quantitative RT-PCR were performed.
The results obtained from this study were as follows:
1. Total 46 DEGs were identified from lung tissues of both calves using ACP-PCR.
2. Among 46 DEGs, 12 DEGs were expressed specifically in Hankyong #100. These DEGs were identified, cloned and sequenced to analyze the characteristics.
3. According to sequencing and BLAST search, it was confirmed that the clone was Hanwoo and the gene of palate, lung, and nasal epithelium carcinoma associated (PLUNC, NM_174426) was overexpressed in lung tissue of Hankyong #100.
4. We confirmed that the gene identified was expressed specifically in lung tissue of Hankyong #100 using semi-quantitative RT-PCR
Based on these results, it can be postulated that Hankyong #100 may be died by the disfunction of lung associated with the overexpression of the PLUNC gene as well as a infection of BRSV and arcanobacterial pneumonia. Further studies are needed to understand the functions and characteristics of this gene in cloned animals.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT
• List of Tables = ⅰ
• List of Figures = ⅲ
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 4
• 1. 공시재료 = 4
• 2. 병리분석 = 5
• 3. RNA 추출 = 5
• 4. cDNA 합성 = 6
• 5. Differentially Expressed Gene (DEG) Cloning = 7
• 6. Sequence Analysis = 8
• 1) 전기영동 = 8
• 2) 재증폭 = 8
• 3) 전기영동 및 산물추출 = 9
• 4) 염기서열분석 = 9
• 7. BLAST Sequence Analysis = 10
• 8. Quantitative Real-Time RT-PCR = 10
• 9. Semi-Quantitative RT-PCR = 11
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 13
• 1. 체세포 복제 송아지 생산 = 13
• 2. 병리적 검사 = 13
• 3. Differentially Expressed Genes = 15
• 4. 염기서열에 의한 특이발현 유전자 특성 구분 = 25
• 5. Quantitative Real-Time-PCR Analysis = 41
• 6. Semiquantitative RT-PCR Analysis = 44
• Ⅴ. 요약 = 49
• 참고 문헌 = 51