Tris(2,2-bipyridine)ruthenium(II) [Ru(bpy)_(3)^(2+)] 전기화학발광(ECL)을 이용한 Amine류의 HPLC 검출 = Tris(2,2-bipyridine)ruthenium(II) [Ru(bpy)_(3)^(2+)] electrogenerated chemiluminescence detection of amines in HPLC

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 Tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)[Ru(bpy)_(3)^(2+)] 전기화학발광(ECL)을 HPLC의 검출방법으로 사용하여 amine기를 포함한 생체활성을 갖는 신경전달물질성 약물을 선택적으로 분리 및 검출하고 응용하고자 하였다. Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL은 반응성이 있는 산화상태의 Ru(bpy)_(3)^(3+)가 분석물과 반응하여 화학발광을 발생하고 이때 발생하는 빛의 양은 분석물의 농도에 비례하게 된다. 따라서 본 연구에서는 Ru(bpy)_(3)^(2+) 착물을 이용한 ECL 방법으로 2차 및 3차 amine류, 즉 beta-blocker와 phenothiazine 유도체들에 대해 특별한 유도체화 과정을 거치지 않고, Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL을 이용해 고감도로 검출하기 위한 실험을 진행하였고, 이를 흐름주입분석(FIA) 장치와 HPLC의 검출방법으로 이용하였다. Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL과 HPLC의 결합을 위해 후-컬럼 혼합 방법(post-column mixing method)을 적용시켰고, 흐름셀(flow cell)에 전극을 구성하여 Ru(bpy)_(3)^(2+) 용액이 반응 용기로 이동되어 오면, 전극에 가해진 1.3 V의 전압에 의해 즉시 Ru(bpy)_(3)^(3+)로 산화되도록 장치를 고안하였다. 이 흐름은 컬럼(column)을 통해 분리된 시료와 반응하여 610 nm의 오렌지 빛을 발생시키는데 이를 PMT(photo multiplier tube)로 검출하였다. Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL은 시료의 농도, 흐름계의 유속, pH, 유기용매 등에 민감하게 영향을 받으므로, 좋은 ECL 감도를 얻기 위해서는 이런 조건들을 최적화하는 과정이 필요하다. 실험적으로 결정된 최적화된 조건하에서, Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL을 이용 시, beta-blocker의 경우, pH 9.0에서 수 μM까지 검출이 가능했으며, 인뇨(human urine)나 조제약의 매질 하에서도 특별한 전처리 과정을 거치지 않고, 검출이 가능함을 확인할 수 있었다. Phenothiazine 유도체의 대해서도 30 %(v/v) acetonitrile을 포함한 pH 6.0의 phosphate 완충용액을 이동상으로 하였을 때 HPLC에서 30분 안에 5가지 분석물이 분리되었고, 약 0.3~2.1 μM 농도 사이의 검출한계 값을 가졌으며, 생체 시료에 적용하여서도 단순한 크로마토그램과 함께 검출이 가능했다.
또한, 더욱 효율적이고 향상된 ECL 검출을 위한 연구의 일환으로 전극 표면을 V_(2)O_(5)-Nafion 복합물막으로 변형(modification)시키고 ECL 시료를 고정화시켜 phenothiazine의 HPLC-ECL에 적용시킨 결과, 기존의 Nafion이나 Nafion-silica 복합물을 이용하여 Ru(bpy)_(3)^(2+)를 고정시킨 방법에 비해 훨씬 안정적이고 효율적인 결과를 얻을 수 있었다.
본 연구를 통해 HPLC-Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL을 이용해 2, 3차 alkylamine류를 선택적으로 고감도 검출을 할 수 있었으며, 이러한 과정을 통해 개발된 ECL 검출법은 생체활성물질을 고감도로 검출하는 것을 가능하게 하며, 약물의 모니터링이나 생체 내 약물의 오용도 검사 및 여러 생명공학 분야에서 매우 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

A highly selective and sensitive method has been developed for the determination of amine-containing bioactive compounds using Ru(bpy)_(3)^(2+) electrogenerated chemiluminescence (ECL) detection.
In this work, Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL was used to sensitively detect secondary and tertiary amines such as beta-blockers and phenothiazine derivatives for HPLC and FIA. A technique for the in-situ generation of Ru(bpy)_(3)^(3+) at an electrode surface was used and applied as a post-column reaction detector in HPLC. For this method, separated analytes are mixed at a mixing tee with a Ru(bpy)_(3)^(2+) stream and the combined solution is then delivered to the detection cell. On the electrode surface of flow cell, Ru(bpy)_(3)^(2+) is oxidized to Ru(bpy)_(3)^(3+) by applied potential of 1.3 V, which reacts with the analyte and then emits the light of 610 nm.
Several optimized ECL conditions were experimentally determined because ECL intensity was affected by pH, concentration and flow rate of CL reagent. Under the optimal conditions, the detection limit for beta-blockers is pmol level with S/N of 3 and the determination of beta-blockers in pharmaceutical preparations and human urine samples was possible without specific sample preparation. Phenothiazine derivatives were separated on a HPLC using mobile phase of 50 mM phosphate buffer(pH 6) and acetonitrile (70:30 v/v) in 30 min and had the detection limits of about 0.3 ~ 2.0 μM with S/N of 3 by the present method. In addition, the determination of phenothiazine derivatives in human urine samples was performed by HPLCECL.
The ECL sensor of Ru(bpy)_(3)^(2+) immobilized in V_(2)O_(5)-Nafion composite film was applied to HPLC-ECL detection of phenothiazine derivatives. It is found that the sensor of Ru(bpy)_(3)^(2+) immobilized in V_(2)O_(5)-Nafion composite film has good stability and allows the sensitive and effective detection of phenothiazines in HPLC system.

목차 (Table of Contents)

• 차례 = i
• List of Figures = ⅴ
• List of Tables = ⅷ
• 국문요약 = ⅸ
• 제1장 서론 = 1
• 제2장 이론 = 6
• 제1절 Ru(bpy)_(3)^(2+) 전기화학발광 = 6
• 1.1 화학발광 = 6
• 1.2 Ru(bpy)_(3)^(2+) 전기화학발광 = 7
• 1.3 전극 표면 위의 Ru(bpy)_(3)^(2+) 고정화 = 12
• 제2절 흐름계에서의 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL = 17
• 2.1 흐름계에서의 Ru(bpy)_(3)^(3+)의 생성 방식 = 17
• 2.1.1 External generation 방식 = 17
• 2.1.2 In-situ/solution 방식과 In-situ/immobilized 방식 = 18
• 2.2 흐름셀의 부피와 흐름 속도 = 21
• 제3절 HPLC에서의 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL = 23
• 3.1 HPLC에서의 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL = 23
• 3.2 HPLC에서의 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL 검출 방식 = 24
• 3.2.1 후-컬럼 혼합 방식 = 24
• 3.2.2 이동상에 포함된 Ru(bpy)_(3)^(2+) 방식 = 26
• 제3장 실험 = 28
• 제1절 측정 기기 및 실험 기구 = 28
• 제2절 시료와 이동상 = 32
• 제3절 실험 방법 = 35
• 3.1 Beta-blocker의 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL = 35
• 3.1.1 pH의 효과 = 35
• 3.1.2 유속과 Ru(bpy)_(3)^(2+) 농도의 효과 = 35
• 3.1.3 검정곡선 및 검출한계 = 36
• 3.1.4 조제약에서 metoprolrol과 atenolol의 결정 = 37
• 3.1.5 HPLC-Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL을 이용한 인뇨에서 beta- blocker의 분리 및 검출 = 37
• 3.1.6 HPLC를 이용한 beta-blocker의 분리 조건 결정 = 37
• 3.2 Phenothiazine 유도체의 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL = 38
• 3.2.1 pH의 효과 = 38
• 3.2.2 HPLC를 이용한 phenothiazine 유도체 혼합물의 분리조건 = 38
• 3.2.3 HPLC-Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL 검출의 최적화 = 39
• 3.2.4 검정곡선 및 검출한계 = 39
• 3.2.5 Phenothiazine 표준물들이 첨가된 인뇨 시료의 준비 = 39
• 3.2.6 V_(2)O_(5)-Nafion 복합물을 이용한 Ru(bpy)_(3)^(2+)의 고정화 및 HPLC-ECL 장치에의 적용 = 40
• 제4장 결과 및 고찰 = 42
• 제1절 Beta-blocker의 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL = 42
• 1.1 Beta-blocker의 상대적 ECL 세기 비교 = 42
• 1.2 pH의 효과 = 44
• 1.3 유속과 Ru(bpy)_(3)^(2+) 농도의 효과 = 46
• 1.3.1 Ru(bpy)_(3)^(2+) 용액 유속의 효과 = 46
• 1.3.2 Ru(bpy)_(3)^(2+) 용액 농도의 효과 = 46
• 1.4 검정곡선 및 검출한계 = 52
• 1.5 조제약에서 metoprolol과 atenolol의 결정 = 54
• 1.6 HPLC- Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL을 이용한 인뇨에서 beta-blocker의 분리 및 검출 = 57
• 제2절 Phenothiazine 유도체의 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL = 62
• 2.1 pH의 효과 = 62
• 2.2 Phenothiazine 유도체들의 상대적 ECL 세기 비교 = 64
• 2.3 HPLC를 이용한 phenothiazine 유도체 혼합물의 분리 조건 결정 = 66
• 2.4 Ru(bpy)_(3)^(2+) 용액의 유속과 농도의 효과 = 67
• 2.4.1 Ru(bpy)_(3)^(2+) 용액 유속의 효과 = 67
• 2.4.2 Ru(bpy)_(3)^(2+) 용액 농도의 효과 = 69
• 2.5 검정곡선 및 검출한계 = 72
• 2.6 HPLC- Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL을 이용한 인뇨에서 phenothiazine 유도체의 검출 = 76
• 2.7 V_(2)O_(5)-Nafion복합물을 이용한 Ru(bpy)_(3)^(2+)의 고정화 및 HPLC-ECL 장치에의 적용 = 78
• 2.7.1 Ru(bpy)_(3)^(2+)/V_(2)O_(5)-Nafion 막의 형성 = 78
• 2.7.2 이동상에 의한 고정화된 막의 ECL 세기 변화 = 80
• 2.7.3 HPLC-ECL에서 Ru(bpy)_(3)^(2+)/V_(2)O_(5)-Nafion 막의 안정화 = 82
• 2.7.4 Ru(bpy)_(3)^(2+)/V_(2)O_(5)-Nafion 막을 이용한 phenothiazine 유도체의 HPLC-ECL = 84
• 2.7.5 고정화된 Ru(bpy)_(3)^(2+) ECL 에서 phenothiazine 유도체들의 검출한계 = 86
• 제5장 결론 = 89
• 참고문헌 = 91
• 영문요약 = 94