Development and application of in vitro transcribed mRNA based therapy

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Synthetic mRNA has been considered as a promising biotherapeutic agent for past decades. During SARS-CoV2 pandemic, the emergence of the mRNA vaccine increased interest in synthetic mRNA. In vitro transcribed (IVT) mRNA, called synthetic mRNA, has several advantages over conventional gene expression systems such as plasmid DNA. It can translate protein in cytoplasm by structurally resembling natural mRNA, and exhibit various protein expression patterns depending on how it is engineered. Another advantage is that synthetic mRNA enables fast, scalable, cost-effective production, allowing to the successful development of SARS-CoV2 mRNA vaccines at unprecedented speed in the history. Starting with SARS-CoV2 mRNA vaccines, IVT mRNA is expected to be used for various fields of gene therapies.
This study is about development of IVT mRNA synthesis methods and application for therapeutic protein expressions. This study is consisted of two parts. The first is to develop IVT mRNA synthesis methods capable of exhibiting sufficient protein expression efficacy by reducing innate immunogenicity. The second is to apply IVT mRNA to the expression of various therapeutic proteins based on the previously developed IVT mRNA synthesis method. In order to inhibit unfavorable innate immune response occurred by IVT mRNA, modified nucleosides and cellulose purification were used in this study. Next, IVT mRNA encoding the target protein sequence was synthesized according to the established synthesis methods. The target proteins were selected for three purposes. PDX1 and TAZ for type I diabetes mellitus, RUNX2 for osteoporosis, and p-22 FLIP and TRIM56 for chronic type B hepatitis were selected for therapeutic purposes. It was confirmed that all of the IVT mRNA were translated to the target proteins in vitro. Therefore, this study provides IVT mRNA synthesis method capable of expressing various target proteins.

국문 초록 (Abstract)

합성 mRNA는 지난 수십 년간 유망한 바이오의약품 원료로 여겨져 왔다. SARS-CoV2 팬데믹 기간 동안, mRNA 백신의 출현은 합성 mRNA에 대한 관심을 증가시켰다. 합성 mRNA라고 불리는 in vitro transcribed (IVT) mRNA는 플라스미드 DNA와 같은 전통적인 유전자 발현 시스템에 비해 몇 가지 이점이 있다. 자연 mRNA의 구조를 모방함으로써 세포질에서 단백질로 번역될 수 있으며, 조작 방법에 따라 다양한 단백질 발현 패턴을 보일 수도 있다. 합성 mRNA의 또 다른 장점은 역사상 전례 없는 속도로 SARS-CoV2 백신이 성공적으로 개발되도록 한 빠르고 비용 효율적인 대량 생산을 가능하게 한다는 것이다. SARS-CoV2 백신을 시작으로, IVT mRNA는 다양한 유전자 치료 분야에 사용될 것으로 기대된다.
본 연구에서는 치료용 단백질 발현을 위한 IVT mRNA 합성 방법을 연구하였다. 본 연구는 두 부분으로 구성되어 있다. 첫 번째는 선천적 면역원성을 감소시킴으로써 충분한 단백질 발현율을 나타낼 수 있는 IVT mRNA 합성방법 개발이다. 두 번째는 앞서 개발된 IVT mRNA 합성 방법을 바탕으로 IVT mRNA를 다양한 치료용 단백질 발현에 적용한 것이다. IVT mRNA에 의해 발생하는 선천 면역 반응을 억제하기 위해 변형된 뉴클레오사이드와 셀룰로스 정제가 본 연구에서 사용되었다. 다음으로, 표적 단백질 서열을 암호화하는 IVT mRNA를 확립된 방법에 따라 합성하였다. 표적 단백질은 세 가지 목적으로 선정되었다. 제 1형 당뇨병의 경우 PDX1과 TAZ, 골다공증의 경우 RUNX2, 그리고 B형 간염의 경우 p-22 FLIP과 TRIM45이 치료적 목적으로 선정되었다. 모든 IVT mRNA가 in vitro에서 표적 단백질로 번역된 것으로 확인되었다. 따라서, 본 연구는 다양한 치료용 단백질을 발현할 수 있는 IVT mRNA 합성 방법을 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 9
• II. Materials and Methods 11
• A. Transformation and preparation of plasmid DNA 11
• B. Amplification and addition of poly T tail by polymerase chain reaction (PCR) 11
• C. Synthesis of in vitro transcribed (IVT) mRNA 12
• D. Double-stranded mRNA removal by cellulose purification 13
• E. Cell culture 14
• F. IVT mRNA transfection 14
• G. Flow cytometry analysis 15
• H. MTT assay 15
• I. Western blot analysis 15
• J. Immunocytochemistry analysis 16
• K. Statistical analysis 17
• III. Results and Discussions 18
• 1. Development of IVT mRNA synthesis methods 18
• A. Preparation of RFP mRNA by in vitro transcription 20
• B. Estimation of RFP mRNA expression in HeLa cells after transfection of nucleoside-modified mRNA 22
• C. MTT assay of HeLa cells after transfection of IVT mRNA 26
• D. Estimation of RFP mRNA expression in HeLa cells after transfection of dsRNA-removed mRNA using cellulose 28
• 2. Application of IVT mRNA to therapeutic protein expression 30
• A. Preparation of PDX1 and TAZ mRNA by in vitro transcription 30
• B. Western blot analysis of PDX1 and TAZ IVT mRNA expression 32
• C. Immunocytochemistry analysis of PDX1 and TAZ IVT mRNA expression in HeLa cells 34
• D. Immunocytochemistry analysis of PDX1 and TAZ IVT mRNA expression in T-MSCs 37
• E. Preparation of RUNX2, p-22 FLIP and TRIM56 mRNA by in vitro transcription 41
• F. Immunocytochemistry analysis of RUNX2, p-22 FLIP and TRIM56 IVT mRNA expression in HeLa cells 43
• IV. Conclusion 46
• References 47
• ABSTRACT (in Korean) 51