천연유래물질의 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 조절 효과 연구 = Effects of natural products on the regulation of melanogenesis in B16F10 melanoma cell

국문 초록 (Abstract)

Part II
은행잎 추출물의 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제 효과

은행잎 추출물(Ginkgo biloba leaf extract, GLE)은 다양한 생물학적 효과를 보여주며, 스킨케어 제품 제조에 있어서 주요 성분으로 사용되고 있다. GLE와 이로부터 정제된 몇 가지의 화합물은 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나, GLE에 의한 멜라닌 생성 억제의 분자 메커니즘에 대한 보고는 거의 없다. 본 연구에서는 은행잎의 수성 에탄올 추출물의 멜라닌 생성억제 효과와 이와 관련된 분자 메커니즘을 조사했다.
B16F10 멜라닌 세포를 0.1 nM α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH)로 멜라닌 합성을 유도하고, 다양한 농도의 GLE (0–100 μg/mL)로 처리한 후. 세포 증식, 총 멜라닌 함량, 세포 반응 산소 종(reactive oxygen species, ROS) 함량 및 세포 티로시나제(tyrosinase )활성에 대한 영향을 분석하였다. THC 작용의 메커니즘을 밝히기 위해 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), 티로시나아제, 티로시나제 관련 단백질 1(TYRP1)의 세포 발현 정도와 Akt, glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), β-catenin의 인산화 정도를 분석했다.
GLE는 B16F10 세포에 세포독성을 유발하지 않으면서 α-MSH 유도 멜라닌 생성과 ROS 생성을 억제했다. GLE는 티로시나아제 효소 활성을 감소시켰고, MITF, 티로시나제, TYRP1의 단백질 발현 수준을 감소시켰다. 이 결과는 GLE가 멜라닌 생성에 작용하는 단백질, 즉 MITF, 티로시나아제 및 TYRP1의 발현을 저하시킴으로써 B16F10 세포에서 α-MSH 유도 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 시사한다. 이들 멜라닌 생성 단백질 발현 저하는 GLE에 의한 Akt 억제를 통해 활성화되는 GSK3β가 β-catenin을 인산화시키고, 그 결과로 proteasome에 의한 β-catenin 분해 증가에 의한 것으로 보인다. 더불어, GLE의 항산화 활성도 산화스트레스를 동반하는 멜라닌 생성의 억제에 일정 역할을 할 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Part II
Inhibitory effect of Ginkgo biloba leaf extract on melanogenesis in B16F10 melanoma cells

Ginkgo biloba leaf extract (GLE) shows diverse biological efects, and it is used as an ingredient in some skincare products. GLE and a few purifed compounds are known to inhibit melanogenesis. However, there are very few reports on the molecular mechanisms underlying the regulation of melanogenesis by GLE. We investigated the anti-melanogenic efect of a GLE, an aqueous ethanol extract of Ginkgo biloba leaves, and the molecular mechanisms involved.
B16F10 murine melanoma cells were treated with various concentrations of GLE (0–100 μg/mL), together with 0.1 nM α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), which was used to induce melanogenesis. Cell proliferation, total melanin content, cellular reactive oxygen species (ROS) content, and cellular tyrosinase activity were measured. The cellular levels of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase, and tyrosinase-related protein 1 (TYRP1), and the phosphorylation levels of Akt, glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), and β-catenin were analyzed.
GLE inhibited α-MSH-induced melanogenesis and ROS generation, without causing cytotoxicity. GLE decreased cellular tyrosinase activity and the levels of MITF, tyrosinase, and TYRP1. GLE decreased the phosphorylation of Akt (Ser473) and GSK3β (Ser9) and increased the phosphorylation of β-catenin (Ser33/37/Thr41).
Our results suggest that GLE can inhibit α-MSH-induced melanogenesis in B16F10 cells by downregulating the expression of melanogenic proteins, i.e., MITF, tyrosinase, and TYRP1. The downregulation of melanogenic protein expression appears to result from stimulating β-catenin degradation, which is induced by phosphorylation by GSK3β that is activated via inhibition of Akt. GLE’s antioxidant activity can also play a role in its anti-melanogenic efect.

국문 초록 (Abstract)

Part I
Tetrahydrocurcumin의 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제 효과

Tetrahydrocurcumin(THC)은 몇몇 피부 미백 크림의 성분으로 사용되어 오고 있으나, THC가 어떻게 멜라닌 생성을 조절하는지에 대한 메커니즘은 잘 연구되어 있지 않다. 따라서 본 논문에서는 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 THC의 멜라닌 생성 조절 메커니즘을 연구하였다. B16F10 세포에 0.1 nM α-melanocyte 자극 호르몬(α-MSH)에 의한 멜라닌 생성을 유도하고, 다양한 농도의 THC (0-30 μg/mL)로 처리한 후, 총 멜라닌 생성량, 세포 내 티로시나아제(tyrosinase) 효소 활성, 멜라닌 생성과정에 관련된 단백질인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 1 (TYRP1) 및 신호전달 단백질인 Akt, glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), β-catenin의 단백질 발현량을 분석하고. 세포의 형태 변화를 관찰하였다.
THC 처리된 세포에서는 α-MSH로만 처리된 대조군 세포에 비해 총 멜라닌 생성량이 THC 농도 의존적으로 감소하였다. 세포배양액으로의 멜라닌 분비가 거의 나타나지 않는 초기 멜라닌 생성 단계에는 THC 처리된 세포에서 대조군에 비해 현저한 티로시나아제(tyrosinase)의 효소 활성 감소와 함께 세포 내의 티로시나아제 및 MITF 단백질 발현량의 감소가 관찰되었다. 반면에, 대조군 세포에서 멜라닌 분비가 활발히 나타나는 후기 단계에는 THC 처리된 세포에서 대조군에 비해 더 많은 양의 티로시나아제(tyrosinase) 및 TYRP1의 단백질이 측정되었다. 또한, THC 처리는 Akt와 GSK3β 단백질의 인산화 및 β-카테닌 함량의 감소를 유발했다. THC는 B16F10 melanoma 세포의 형태도 크게 변화시켰다. 즉, THC 처리에 의해 세포의 길이가 길어지고 수지상 구조가 손실되었다.
결론적으로, THC는 MITF와 티로시나제 단백질 발현을 억제하고 티로시나제 효소 활성을 감소시킴으로써 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도되는 멜라닌 합성을 억제하고, 또한 수지상 구조의 상실을 수반하는 세포 형태 변화를 초래해 멜라노솜의 분비를 억제하여 각질 세포로의 멜라닌 전달을 감소시킴으로써 피부 미백 효과를 나타낼 수 있으며, 이러한 THC의 항 멜라닌 효과는 THC가 Akt와 GSK3β의 단백질 인산화를 감소시켜 GSK3β를 활성화하고, 그 결과 β-카테닌 단백질의 감소를 초래해 β-카테닌 신호의 억제하는 메커니즘을 통해 일어나는 것으로 보인다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Part I
Inhibitory effect of Tetrahydrocurcumin on melanogenesis in B16F10 melanoma cells

Tetrahydrocurcumin (THC) has been used as an ingredient in various skin whitening cosmetics, but the mechanisms for how THC regulates melanogenesis have not been well studied. Therefore, in this dissertation, the mechanisms related to the melanogenesis according to THC-treatment using B16F10 melanoma cells have been investigated.
B16F10 cells were treated with various concentrations of THC in the range of 0 to 30 μg/mL in the presence of 0.1 nM α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH). The B16F10 cells were induced to produce melanin by α-MSH, and then total melanin production; intracellular tyrosinase enzyme activity; and amount of melanogenic proteins, i.e., microphthalmia-associated transcription factor (MITF), levels of tyrosinase and tyrosinase-related protein 1 (TYRP1), and signaling proteins, i.e, Akt, glycogen synthase kinase 3β(GSK3β), and β-catenin, were analyzed and discussed. Change in cell morphology, particularly dendrite structure, was also observed and discussed.
Treatment with THC resulted in significant and dose-dependent reduction in total melanin content compared to control cells treated with only α-MSH. Early melanogenesis stage, in which melanin secretion to cell culture was rarely seen, THC-treatment caused decreases in the enzyme activity of tyrosinase and the levels of tyrosinase and MITF proteins. On the other hand, in the later stages of melanogenesis, in which melanin secretion was evidently exhibited in control cells, highly increases in the intracellular levels of tyrosinase and TYRP1, the melanosomal proteins, were observed in THC-treated cells. Furthermore, THC-treatment caused decreases in phosphorylation of Akt and GSK3β and β-catenin content. THC-treatment also changed the cell morphology of B16F10 cells significantly. That is, the length of the cells was prolonged and the dendritic structure was lost by THC treatment.
In conclusion, this study demonstrated that THC-treatment inhibited α-MSH-induced melanin synthesis in B16F10 cells by downregulating MITF and tyrosinase proteins and decreasing tyrosinase activity. It can also lead to skin whitening effects by inhibiting melanin transfer to keratin cells, which appears to be associated with cell morphology alteration accompanying a loss of dendritic structure. THC treatment of B16F10 melanoma cells led to decrease in the phosphorylation of Akt and GSK3β and the content of β-catenin, suggesting involvement of GSK3β activation and subsequent attenuation of β-catenin signaling in the effect of inhibiting melanogenesis of THC.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Effects of natural products on the regulation of melanogenesis in B16F10 melanoma cell

Natural substances such as tetrahydrocurcumin (THC) and ginkgo biloba leaf extract (GLE) are used as ingredients for skin whitening in some cosmetic products. However, very little is known about the mechanisms for how they regulate melanogenesis. In this dissertation, the effects of THC and GLE on the regulation of melanogenesis and the molecular mechanisms involved are studied using B16F10 melanoma cells.
B16F10 cells were treated with various concentrations of THC (0 - 30 μg/mL) and GLE (0 - 100 μg/mL) in the presence of 0.1 nM α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), which was used to induce melanogenesis. Then total melanin production, intracellular tyrosinase activity, and the amount of melanogenic proteins, i.e., microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase, and tyrosinase-related protein 1 (TYRP1), in cells were measured. And the amount and phosphorylation of signaling proteins, i.e, Akt, glycogen synthase kinase 3β(GSK3β), and β-catenin, were analyzed. The change in cell morphology, particularly dendrite structure, was also observed.
Treatment with THC resulted in significant and dose-dependent reduction in total melanin content compared to control cells treated with only α-MSH. At the early melanogenesis stage, which is accompanied by very little melanin secretion to cell culture medium, THC-treatment caused decreases in the tyrosinase activity and the level of tyrosinase and MITF proteins. On the other hand, at the later stage of melanogenesis, at which an evident melanin secretion was shown in control cells, significantly increased levels of tyrosinase and TYRP1, the melanosomal proteins, were observed in THC-treated cells. THC-treatment caused decreases in phosphorylation of Akt and GSK3β and the content of β-catenin. THC-treatment also caused alterations in cell morphology, that is, the elongation of cells and the loss of dendritic structure. GLE also inhibited α-MSH-induced melanogenesis and decreased ROS generation, without causing cytotoxicity. GLE decreased cellular tyrosinase activity and the levels of MITF, tyrosinase, and TYRP1. GLE decreased the phosphorylation of Akt (Ser473) and GSK3β (Ser9) and increased the phosphorylation of β-catenin (Ser33/37/Thr41).
In conclusion, this study demonstrated that both THC and GLE inhibited α-MSH-induced melanogenesis in B16F10 cells by decreasing the activities of enzymes involved in melanin synthesis through downregulation of MITF and melanogenic proteins, such as tyrosinase and TYRP1. THC caused cell morphology alteration, particularly the loss of dendritic structure, which could cause the inhibition of melanosome transfer to keratinocytes. The anti-melanogenic effects of THC and GLE appeared be associated with the decrease in phosphorylation of Akt and GSK3β, and the increase in β-catenin phosphorylation by GSK3β and the subsequent degradation of β-catenin by proteasome, causing attenuation of β-catenin signaling. GLE's antioxidant activity may also contribute to its anti-melanogenic effect.

국문 초록 (Abstract)

천연유래물질의 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 조절 효과 연구

천연유래물질인 Tetrahydrocurcumin(THC)과 은행잎 추출물(Ginkgo biloba leaf extract, GLE)는 일부 화장품에서 피부 미백을 위한 성분으로 사용되고는 있으나, 이들이 어떻게 멜라닌 생성을 조절하는지에 대한 메커니즘은 잘 연구되어 있지 않다. 본 논문에서는 B16F10 melanoma세포를 이용하여 THC와 GLE의 멜라닌 생성 억제효과를 확인하고, 그 작용 기전을 연구하였다.
B16F10 세포에 0.1 nM α-melanocyte 자극 호르몬(α-MSH)에 의한 멜라닌 생성을 유도하고, 다양한 농도의 THC (0–30 μg/mL)와 GLE (0–100 μg/mL)로 처리한 후, 총 멜라닌 생성량, 세포 내 티로시나아제(Tyrosinase) 효소 활성, 멜라닌 생성에 관련된 단백질인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 1 (TYRP1) 및 신호전달 단백질인 Akt, glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), β-catenin의 단백질 발현량을 분석하고, 세포의 형태 변화를 관찰하였다.
THC 처리된 세포에서는 α-MSH로만 처리된 대조군 세포에 비해 총 멜라닌 생성량이 THC 농도 의존적으로 감소하였다. 초기 멜라닌 생성 단계에는 THC 처리된 세포에서 현저한 티로시나아제(Tyrosinase)의 효소 활성 감소와 함께 세포 내의 티로시나아제 및 MITF 단백질 발현량의 감소가 관찰되었다. 반면에, 후기 멜라닌 생성 단계는 대조군 세포에서 멜라닌 분비가 활발히 나타나는 단계인데, 이 때는 THC 처리된 세포 내에서 대조군에 비해 더 많은 양의 티로시나아제(Tyrosinase) 및 TYRP1의 단백질이 측정되었으며, 세포의 형태도 크게 변화되었다. 즉, THC 처리에 의해 세포의 길이가 길어지고 수지상 구조가 손실되었다. THC 처리는 신호전달 과정에 작용하는 Akt와 GSK3β 단백질의 인산화 및 β-카테닌 함량의 감소를 유발했다. GLE는 세포독성을 유발하지 않으면서 α-MSH에 의해 유도되는 멜라닌 생성과 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제했다. GLE도 또한 티로시나아제 효소 활성 감소와 멜라닌 생성 관련 단백질인 MITF, 티로시나제, TYRP1의 단백질 발현을 감소시켰으며, Akt와 GSK3β 단백질의 인산화를 감소시키고 β-카테닌 인산화 증가를 유발했다.
결론적으로, THC와 GLE는 전사인자인 MITF와 멜라닌 합성에 작용하는 단백질인 티로시나제 및 TYRP1의 단백질 발현을 억제하여 멜라닌 합성에 작용하는 효소 활성을 감소시킴으로써 B16F10 세포에서 멜라닌 합성을 억제하고, 특히 THC는 또한 수지상 구조의 상실을 수반하는 세포 형태 변화를 초래해 멜라노좀의 분비를 억제하여 각질세포로의 멜라닌 전달을 감소시킴으로써 피부 미백 효과를 나타낼 수 있는 것으로 보인다. 이러한 THC와 GLE의 항 멜라닌 효과는 Akt와 GSK3β의 단백질 인산화를 감소시켜 GSK3β를 활성화하고, 그 결과 β-카테닌 단백질의 인산화 증가와 그에 따른 β-카테닌 단백질의 proteasome에 의한 분해를 초래해 β-카테닌 신호를 억제하고 ROS의 생성을 억제하는 메커니즘을 통해 일어나는 것으로 보인다.

목차 (Table of Contents)

• Part I 1
• 국문초록 (Part I) 2
• 제1장 서론 4
• 1.1 연구의 필요성 4
• 1.2 연구목적 9
• 제2장 실험기구 및 실험방법 10
• 2.1 시약 10
• 2.2 기구 12
• 2.3 실험방법 13
• 2.3.1 B16F10 세포주의 배양 13
• 2.3.2 THC 및 α-MSH의 처리 14
• 2.3.3 세포의 생장률 측정(MTT assay) 16
• 2.3.4 멜라닌 함량의 측정 17
• 2.3.5 티로시나아제(Tyrosinase)활성 측정 18
• 2.3.6 웨스턴 블랏(Western blot) 20
• 2.3.7 결과의 통계처리 23
• 제3장 연구결과 24
• 3.1 THC가 B16F10 melanoma세포주의 생장에 미치는 영향 24
• 3.2 THC가 B16F10 melanoma세포의 멜라닌 생성에 미치는 영향 26
• 3.3 THC가 B16F10 melanoma세포의 형태에 미치는 영향 29
• 3.4 THC가 B16F10 melanoma세포의 티로시나아제(Tyrosinase) 활성에 미치는 영향 30
• 3.5 THC가 B16F10 melanoma세포의 멜라닌을 생성하는 관련된 단백질 발현에 미치는 영향 33
• 3.6 THC가 B16F10 melanoma 세포의 Akt/GSK3β/β-catenin 신호 전달에 미치는 영향 37
• 제4장 고찰 39
• 제5장 결론 44
• ABSTRACT (Part I) 45
• Part II
• 국 문 초 록 (Part II) 48
• 제1장 서론 50
• 1.1 연구의 필요성 50
• 1.2 연구목적 54
• 제2장 실험기구 및 실험방법 55
• 2.1 시약 55
• 2.2 기구 57
• 2.3 실험방법 58
• 2.3.1 B16F10 세포주의 배양 58
• 2.3.2 은행잎 추출물(GLE) 제조 59
• 2.3.3 은행잎 추출물 및 α-MSH의 처리 59
• 2.3.4 세포의 생장률 측정(MTT assay) 61
• 2.3.5 멜라닌 함량의 측정 62
• 2.3.6 티로시나아제(Tyrosinase) 활성 측정 63
• 2.3.7 웨스턴 블랏 (Western blot) 65
• 2.3.8 ROS 측정 68
• 2.3.9 결과의 통계 처리 69
• 제3장 연구결과 70
• 3.1 GLE가 B16F10 melanoma세포주의 생장에 미치는 영향 70
• 3.2 GLE가 B16F10 melanoma세포의 멜라닌 생성에 미치는 영향 72
• 3.3 GLE가 B16F10 melanoma 세포의 티로시나아제 활성에 미치는 영향 74
• 3.4 GLE가 B16F10 melanoma세포의 멜라닌을 생성하는 관련된 단백질 발현에 미치는 영향 76
• 3.5 GLE가 B16F10 melanoma 세포의 Akt/GSK3β/β-catenin 신호 전달에 미치는 영향 78
• 3.6 GLE가 B16F10 melanoma 세포의 ROS 생성에 미치는 영향 80
• 제4장 고찰 82
• 제5장 결론 86
• 참고문헌 88
• ABSTRACT (Part II) 95
• ABSTRACT 97