불임 검사용 여성호르몬 5종에 대한 효소 화학발광 면역법 개발 = Development of enzymatic chemiluminescence immunization against five female hormones for infertility testing

국문 초록 (Abstract)

현재 난임 부부는 지속적으로 증가하고 있고, 난임 시술에 따른 비용도 상승하여 심각한 경제적 부담이 되고 있어, 이를 해결하기 위해 국가적 차원의 ‘난임부부 시술비 지원사업’이 이루어지고 있다. 최근 난임 부부에 대한 건강보험을 적용해 난임 부부들이 시술을 받을 때 드는 검사비, 마취비, 약제비 등 비용 부담을 건강보험에서 지원 되어, 건강보험이 적용되면서 검사비용에 대한 부담이 감소해 난임 검사 수가 증가하고 있어 본 기술의 개발이 반드시 필요하다고 할 수 있다. 여성 난임의 원인이 매우 다양하므로 그 원인을 찾기 위한 검사로 초음파검사, 호르몬검사, 자궁-난관 조영술, 성교후검사, 자궁내막검사 등을 시행하고 있다. 호르몬 검사는 여성 난임 진단을 위한 간단하고 효율적인 방법으로 간주되어 왔다.
난임 진단을 위한 호르몬 검사에 이용되는 5가지 호르몬은 Luteinizing hormone (LH), Follicle-stimulating hormone (FSH), Estradiol(E2), Progesterone, Anti-Mullerian hormone (AMH)으로 혈액 내에 존재하는 양을 측정하는 방식이다. 이에 본 기술 개발은 주요 여성호르몬 5가지를 Chemiluminescence enzyme immunoassay(CLEIA)측정 시스템을 통하여 측정한다. CLEIA 측정 시스템에 경우 ELISA 시스템과 마찬가지로 5종류의(Direct CLEIA, Indirect CLEIA, Sandwich CLEIA, Competitive CLEIA, Bridge type CLEIA) 시스템으로 구성 할 수 있으며, direct CLEIA와 indirect CLEIA는 측정 방식의 차이로 CLEIA를 구분하는 방식이며 감도 때문에 주로 indirect CLEIA 측정방식을 많이 사용한다. 5 가지 호르몬 중 LH, FSH 및 AMH는 sandwich CLEIA 분석법을 기반으로 하고 다른 호르몬인 E2 및 progesterone은 competitive CLEIA 분석법을 기반으로 하였다. 경쟁 반응을 위해, 서로 다른 용량의 E2 및 progesterone이 micro well plate의 호르몬 분석 물에 결합 된 고정 된 담체 단백질 (예 : 소 혈청 알부민)과 경쟁적으로 반응했다.
이 연구에서 개발된 CLEIA 시스템은 분석 감도 (2 ~ 5배 더 높음) 및 분석 시간 (60분 이내) 측면에서 상업용 비색 ELISA 키트보다 우수하여 빠르고 저렴한 불임 호르몬 검사가 가능하다. 각 호르몬에 대한 재현성은 분석 평가에서도 허용 되었다. (분석 간 및 분석 내 분산 계수는 각각 20 % 및 10 % 이내였다). 또한, 우리는 현재 이 분석 플랫폼을 자동 액체 처리 시스템과 결합하여 높은 처리량의 결과와 재현성을 높이고 있다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 3
• 1. 재료 = 3
• 2. Biotinylation of antibodies = 4
• 3. Sandwich CLEIA system = 4
• 4. Competitive CLEIA system = 5
• Ⅲ. 결과 = 6
• 1. AMH CLEIA system 선정 = 7
• 1) AMH 항체쌍 선정 = 7
• 2) AMH standard curve 선정 = 9
• 3) AMH sandwich CLEIA system 분석적 성능 시험자료 = 10
• 2. LH CLEIA system 선정 = 12
• 1) LH 항체쌍 선정 = 12
• 2) LH standard curve 작성 = 14
• 3) LH sandwich CLEIA system 분석적 성능 시험자료 = 14
• 4) LH 상용화 ELISA kit와 을지대학교 CLEIA system 상관 관계 분석 결과 = 16
• 3. FSH CLEIA system 선정 = 18
• 1) FSH 항체쌍 선정 = 18
• 2) FSH CLEIA system capture antibody 최적 고정화 농도 선정 = 20
• 3) FSH standard curve 작성 = 21
• 4) FSH sandwich CLEIA system 분석적 성능 시험자료 = 22
• 5) FSH 상용화 ELISA kit와 을지대학교 CLEIA system 상관관계 분석 결과 = 23
• 4. Progesterone CLEIA system = 24
• 1) Progesterone carrier protein-antigen 중합체 및 detection antibody 선정 = 24
• 2) Progesterone detection antibody 최적 농도 선정 = 25
• 3) Progesterone competitive CLEIA system 측정 범위 확인 = 27
• 4) Progesterone competitive CLEIA system 분석적 성능 시험자료 = 28
• 5) Progesterone 상용화 ELISA kit와 을지대학교 CLEIA system 상관관계 분석 결과 = 31
• 5. Estradiol CLEIA system 선정 = 32
• 1) Estradiol carrier protein-antigen 중합체 및 detection antibody선정 = 32
• 2) Estradiol-6-BSA conjugate 내에 free estradiol 농도 확인 = 33
• 3) Estradiol competitive CLEIA system 측정 범위 확인 = 34
• 4) Estradiol competitive CLEIA system 분석적 성능 시험자료 = 35
• 5) Estradiol 상용화 ELISA kit와 을지대학교 Estradiol CLEIA system 상관관계 = 37
• Ⅳ. 결론 = 38
• 참고문헌 = 40
• Abstract = 42