재조합 대장균에 의한 Cholic acid로부터 12-Oxo-chenodeoxycholic acid와 7, 12-Dioxo-lithocholic acid의 제조 = Preparation of 12-Oxo-chenodeoxycholic acid and 7, 12-Dioxo-lithocholic acid from Cholic acid by Recombinant E. coli

국문 초록 (Abstract)

Ursodeoxycholic acid는 1970년 의약품으로 개발되어 국내에서는 우루사, 해외에서는 Actigall, Arsacol, Ursosan Ursofalk 등의 제품명으로 판매되고 있다. 현재 ursodeoxycholic acid의 산업적인 제조는 cholic acid를 출발물질로 사용하여 총 7 단계의 합성 공정을 거쳐 생산하고 있다. 그러나 ursodeoxycholic acid의 화학적 합성은 입체와 위치 선택성이 확실치 않아 불순물이 함께 생성되고 CrO3와 메탄올, pyridine 같은 독성 물질들을 사용하여 이를 해결하기 위해 생물전환 공정의 개발이 절실히 요구된다.
본 연구에서는 ursodeoxycholic acid 합성에 중요한 중간물질인 12-oxo-chenodeoxycholic acid와 7, 12-dioxo-lithocholic acid를 cholic acid로부터 recombinant E. coli을 이용하여 생물전환에 의해 제조하고자 하였다.
따라서 본 연구에서는 첫째, 12-oxo-chenodeoxycholic acid를 제조하고자 Clostridium chauvoei ATCC 29733의 12α-hydroxysteroid dehydrogenases에 대한 유전자를 gene amplication 하였다. 이후 이를 pET-21b(+) vector에 삽입하고 host로 E. coli BL21 (DE3)에 transformation한 후 선별된 균주를 사용하여 protein sequence 확인, 12α-hydroxysteroid dehydrogenases 단백질 발현 확인, IPTG induction 여부, NADPH 생성에 의한 enzyme activity 측정 등을 통해 효소의 발현 여부를 확인하였다.
둘째, recombinant E. coli를 whole cell로 사용하기 위한 생물전환 조건 확립을 위해 반응온도, pH, 반응시간에 따른 산물의 변화 등을 TLC와 HPLC로 분석하였다. 생물전환 반응조건은 35℃, pH 7.5이 최적의 조건이었으며 48 시간 반응 시 기질인 8000 μg/ml cholic acid가 100% 생물전환 됨을 확인하였다.
셋째, recombinant E. coli는 유전자 조작에 의해 생성되는 12α-hydroxysteroid dehydrogenase와 wild 균주 내에 존재하는 효소인 7α-hydroxysteroid dehydrogenase가 공동으로 생산됨에 의해 7-oxo-deoxycholic acid와 12-oxo-chenodeoxycholic acid 그리고 7, 12-dioxo-lithocholic acid가 함께 생성됨을 확인하였으며 이들 물질의 생물반응시간에 따른 생성량과 생성비율을 검토하였다. Recombinant E. coli에 의한 8000 μg/ml cholic acid를 48 시간 생물전환후 HPLC로 분석한 결과, 24 시간 반응 시 7, 12-dioxo-lithocholic acid가 64.9%, 12-oxo-chenodeoxycholic acid가 33.9%, 이외의 부산물이 2% 미만이었다. 48 시간 반응 시 생성비율은 7, 12-dioxo-lithocholic acid가 85.4%, 12-oxo-chenodeoxycholic acid가 13.5%, 그 밖의 부산물은 2% 미만이었다. 이 반응으로 생성된 7, 12-dioxo-lithocholic acid는 ursodeoxycholic acid에 필요한 새로운 경로의 중간물질로 앞으로 그 산업적 이용이 기대된다.
넷째, whole cell의 반복적인 사용을 위해 보조인자인 NAD+, NADP+를 첨가한 후 생물전환 반응의 재활성화를 검토한 결과, NAD+ 혹은 NADP+의 첨가 시 생물전환 반응이 재활성되었다. 2차 반응 이후 생물전환 반응산물의 급격한 감소는 whole cell내의 효소반응 보조인자인 NAD+ 혹은 NADP+ 고갈에 의한 것으로 확인되었다. 따라서 whole cell의 반응 사용횟수를 증가시키기 위해서는 균체 내의 NAD+ 혹은 NADP+의 재생을 고려해야 할 것으로 판단되었다.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• LIST OF FIGURES
• 국문요약
• 제 1 장 서 론 1
• 제 1 절 Ursodeoxycholic acid 1
• 1.1. Ursodeoxycholic acid 1
• 1.2. Ursodeoxycholic acid의 생합성 과정 3
• 1.3. Ursodeoxycholic acid의 체내 순환과정 5
• 1.4. Ursodeoxycholic acid의 생리적 기능 6
• 1.5. Ursodeoxycholic acid의 작용기작 7
• 1.6. Ursodeoxycholic acid의 화학적 합성 과정 8
• 제 2 절 Ursodeoxycholic acid의 생물전환 10
• 2.1. Ursodeoxycholic acid의 생물전환 10
• 2.2. 새로운 ursodeoxycholic acid 생산 방법 12
• 제 3 절 Hydroxysteroid dehydrogenase 14
• 3.1. Hydroxysteroid dehydrogenase 14
• 3.2. 12α-hydroxysteroid dehydrogenase 17
• 제 4 절 Hydroxysteroid dehydrogenases의 보조인자 18
• 4.1. Hydroxysteroid dehydrogenases의 보조인자 18
• 제 5 절 연구 목적 19
• 제 2 장 본 론 21
• 제 1 절 실험 재료 및 방법 21
• 1.1. 실험 재료 21
• 1.1.1. 시료, 표준품 및 시약 21
• 1.1.2. 사용 균주 및 배지 22
• 1.2. 분석 방법 23
• 1.2.1. 12-oxo-chenodeoxycholic acid와 7,12-dioxo-lithocholic acid의 TLC 분석 23
• 1.2.2. 12-oxo-chenodeoxycholic acid와 7,12-dioxo-lithocholic acid의 HPLC 분석 24
• 1.2.3. 7, 12-dioxo-lithocholic acid의 구조 분석 24
• 1.3. 실험 방법 26
• 1.3.1. 균주의 배양 26
• 1.3.2. 완충 용액(buffer)의 제조 26
• 1.3.3. 효소 반응 27
• 1.3.4. Protein assay (Bradford assay) 27
• 1.3.5. Gel electrophoresis 27
• 1.3.6. Enzyme assay 28
• 1.3.7. Clostridium chauvoei ATCC 29733으로부터 12α-hydroxysteroid dehydrogenase 유전자 분리 28
• 1.3.8. 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통한 12α-hydroxysteroiddehydrogenase의 gene amplication 29
• 1.3.9. Cloning 30
• 제 2 절 실험 결과 33
• 2.1. 12α-hydroxysteroid dehydrogenase생산 recombinant E. coli의 제조 33
• 2.1.1. 12α-hydroxysteroid dehydrogenase의 gene amplication 33
• 2.1.2. 12α-hydroxysteroid dehydrogenase의 gene sequence 확인 35
• 2.1.3. IPTG induction에 의한 12α-hydroxysteroid dehydrogenase 의 생성여부 확인 37
• 2.1.4. 12a-hydroxysteroid dehydrogenase enzyme activity 39
• 2.1.5. Wild E. coli와 recombinant E. coli의 생물전환 생성물 비교 41
• 2.2. 생물전환 반응 조건의 확립 44
• 2.2.1. 반응온도에 따른 12-oxo-chenodeoxycholic acid와 7, 12-dioxo-lithocholic acid의 생성량 비 교 44
• 2.2.2. 반응pH에 따른 12-oxo-chenodeoxycholic acid와 7, 12-dioxo-lithocholic acid의 생성량 비교 46
• 2.2.3. 반응시간에 따른 12-oxo-chenodeoxycholic acid와 7, 12-dioxo-lithocholic acid의 생성량 비교 47
• 2.2.4. 균체 내의 재사용에 따른 생성물 비교 50
• 2.2.5. 보조인자(NAD+, NADP+)에 따른 생성량 비교 51
• 2.2.6. 1H NMR에 의한 생물전환 생성물질의 구조분석 52
• 제 3 장 결 론 56
• REFERENCES 58
• ABSTRACT 66