말라리아 백신 소재의 면역학적 유용성 평가 방법 연구 = A study on the evaluation methods for determining immunological significance of malaria vaccine material

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Merozoite surface protein 1 (MSP1), a well-known target antigen for protective immune responses against asexual blood-stage malaria, yet effective vaccines constructed on MSP1 N terminal have not been developed so far compared to the well-known MSP1 C terminal region. Using an in silico approach, we predicted the immunogenicity of the N-terminal (462 aa) region of MSP1 from Plasmodium yoelii (PyMSP1). Recombinant protein was generated using pET21b(+) and purified for further use. In an in vivo study, humoral responses were determined, and after nine weeks, immunized mice were challenged with 104 parasites. At day 9, PyMSP1 N showed significantly decreased parasitemia and a 20% weight difference in Plasmodium yoelii - infected mice and PyMSP1 N immunized mice with 100% survival. In addition, we observed IgG1 and IgG2a responses to the antigen in the serum of mice immunized with PyMSP1 N, and determined that this antigen activates CD4+ T cell. In vitro, a 40% boost in the CD86c+ population was observed in PyMSP1 N compared to the negative control, confirming antigen stimulation by FACS. Cytokine ELISA was performed by the co-culture of stimulated DCs and T cells. These results suggest that PyMSP1 N activates CD4+ T cells. Conclusively, the immunological significance of PyMSP1 N terminal region suggest that the PyMSP1 N terminal region exhibited Th1 and Th2 type immune responses and has a potential as vaccine material.

국문 초록 (Abstract)

Merozoite surface protein 1 (MSP1)은 무성 혈액 단계 말라리아에 대한 보호 면역 반응을 위한 표적 항원으로 확인되었지만 잘 알려진 MSP1 C 말단 영역에 비해 MSP1 N 말단을 기반으로 하는 효과적인 백신은 지금까지 개발되지 않았다. In silico 접근법을 사용하여 우리는 Plasmodium yoelii 에서 MSP1 (PyMSP1)의 N 말단 (462 aa) 영역의 면역원성을 예측하였다. pET21b(+)를 사용하여 재조합 단백질을 만들고 추가 사용을 위해 정제하였다. 생체내 연구에서 체액성 반응이 확인되었으며, 면역 시작 9 주 후 면역화된 쥐에 104 개의 기생충으로 감염시켰다. 9 일째에 PyMSP1 N 은 Plasmodium yoeli 감염 마우스와 PyMSP1 N 면역화된 마우스에서 기생충혈증이 유의하게 감소하고 체중 차이가 20% 증가하여 100% 생존율을 보여주었다. 또한, PyMSP1 N 으로 면역화된 마우스의 혈청에서 항원에 대한 IgG1 및 IgG2a 반응을 관찰하였다. 시험관 내에서, 음성 대조군과 비교하여 PyMSP1 N 에서 CD86c+ 집단의 40% 증가가 관찰되었으며, 이는 FACS 를 통해 항원 자극을 확인시켜 줍니다. Cytokine ELISA 는 항원으로 인해 자극된 DC 와 T 세포의 공동 배양 후 수행되었다. 결과는 PyMSP1 N 이 CD4+ T 세포를 활성화한다는 것을 시사합니다. 결론적으로, PyMSP1 N 말단 영역의 면역학적 중요성은 PyMSP1 N 말단 영역이 CD4+ T cell 의 Th1 및 Th2 유형의 면역 반응을 나타내며 백신 물질로서의 잠재력을 가지고 있음을 시사합니다.

목차 (Table of Contents)

• INTRODUCTION 1
• MATERIALS AND METHODS 6
• 1. In silico epitope predictions of Plasmodium yoelii MSP1 N and C terminals 6
• 2. Cloning and recombinant expression of PyMSP1 N and C terminals 7
• 3. SDS-PAGE and western blot of recombinant PyMSP1 N and C proteins 9
• 4. Immunization of recombinant antigen PyMSP1 N and PyMSP1 C 10
• 5. Plasmodium yoelii 17XNL parasite challenge and evaluation of vaccine material
• efficacy . 11
• 6. Measurement of PyMSP1 N and PyMSP1 C antigens specific humoral responses
• IgG, IgG1 and IgG2a 11
• 7. Co-culture bone marrow derived dendritic cells (BMDC) and T cell. 12
• 8. Cytokine ELISA. 14
• 9. Statistical analysis . 14
• RESULTS 15
• 1. In silico T cell epitopes analysis of Plasmodium yoelii merozoite surface protein 1 N
• and C terminals 15
• 2. SDS-PAGE and western blot confirms the recombinantly expressed PyMSP1 N and
• C purified antigens . 21
• 3. Mice immunized with PyMSP1 N and PyMSP1 C antigens exhibited robust IgG1
• type antibody responses 24
• 4. PyMSP1 N antigen lowered the parasitemia without affecting survival 26
• 5. PyMSP1 N stimulates DCs and T cells 28
• 6. PyMSP1 N antigen strongly induces CD4+ IFN-γ cytokines 32
• DISCUSSION 35