Identification and functional analysis of novel egr-1 interacting proteins : Earl growth response-1 (egr-1) 결합단백질의 발굴과 그 작용에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

혈관신생은 생식, 발생 및 상처치유와 같은 정상적인 생리작용에서 활성화된다. 그러나 혈관신생을 일으키는 인자들의 조절이 파괴되면서 당뇨병성망막증, 류마티스 등의 혈관신생 관련질환을 일으키게 된다. 특히 고형암은 대표적인 혈관신생 질환이며, 혈관신생은 고형암에 산소와 영양분을 공급하여 성장을 촉진하고 외부조직으로의 전이를 유발하게 된다.
저산소상태는 지름이 1 cm 이상인 고형암의 내부에서 관찰되며 혈관신생인자의 발현을 유도하는 체내촉진인자로 알려져 있고 이 상태에서 발현이 증가하는 혈관신생인자로는 VEGF, PDGF 그리고 IGF-Ⅱ등이 있다.
Egr-1 전사인자는 성장인자, shear stress, 유레아 및 저산소증과 같은 다양한 스트레스에 의해 그 발현이 증가되는 단백질로 알려져 있다. 특히 IGF-Ⅱ와 같은 혈관신생인자의 촉진자에 결합하여 유전자 전사활성을 촉진시킴으로서 혈관신생을 유발하는 것으로 알려져 있다. Egr-1은 몇몇 결합 단백질에 의해 그 활성이 조절되기도 하는데, 현재까지는 활성촉진 단백질로서 CBP/p300, 저해 단백질로서 NAB1, NAB2 등이 알려져 있다.
따라서 저산소증에 의해 증가된 Egr-1 전사인자가 혈관신생인자인 IGF-Ⅱ의 촉진자에 결합하여 IGF-Ⅱ 단백질의 발현을 증가시켜, 결국은 혈관신생작용을 유발할 것으로 추측되고 있다.
본 연구에서는 혈관신생을 유발하는 시작지점에 있는 Egr-1 전사인자의 새로운 결합단백질을 찾기위해 GAL4 시스템과 마우스 embryo 17-day cDNA library를 이용한 yeast two-hybrid 스크리닝을 실시하였다. 이때, 생쥐 단백질의 분해에 관여하는 proteasome component C8 (PRC8)이 검색되었고, 이들의 결합은 GST pull-down assay와 coimmunoprecipitation assay에 의해 재확인되었다. 또한, Egr-1 전사인자는 PRC8에 의해 그 발현이 억제되었고, proteasome 저해제인 MG132에 의해 발현억제가 회복됨을 볼 수 있었다. 또한 Egr-1의 전사활성도 PRC8에 의해 저해됨을 관찰할 수 있었다. 뿐만 아니라, Egr-1 전사인자가 multiubiquitination 되는 것을 in vivo와 in vitro에서 모두 증명하였다. 이러한 결과는 Egr-1이 ubiquitination이 되고 난 후 proteasome complex에 의해 분해되며, 이 과정에서 PRC8이 관여할 것으로 보인다. 이 결과는 Egr-1 단백질의 분해에 관해 처음으로 그 작용을 규명한 것이다.
두 번째 스크리닝으로 LexA system과 Hela cell cDNA library를 이용한 yeast two-hybrid를 실시하였다. 본 스크리닝으로부터 Egr-1의 새로운 결합단백질로서 human ubiquitin conjugating enzyme (hUBC9)과 protein inhibitor of activated STAT (PIASy)가 발견되었다. 특히, hUBC9의 경우 그 결합정도를 in vitro와 in vivo 모두에서 재확인 하였다. hUBC9/PIASy은 특정단백질의 sumoylation에 관여하는 단백질이다. 따라서 본 연구에서는 Egr-1의 sumoylation domain search를하여 N-terminal 부분에 2군데의 sumoylation 될 수 있는 도메인을 발견하였고, 이는 in vitro sumoylation assay에 의해 다시 한번 검증하였다. Sumoylation은 앞서 언급한 ubiquitination과 비교될 수 있는 중요한 단백질 modification으로서 단백질 분해억제, 핵내로의 단백질 이동 변화, 전사활성 조절 등의 작용을 가지는 modification이다.
따라서 Egr-1 전사인자는 단백질 분해에 관련되는 PRC8과 sumoylation에 관여하는 hUBC9/PIASy와 함께 결합할 수 있다는 것이 확인되었다. 이와 같은 결과에 의해 Egr-1 단백질의 분해와 조절작용에 관여하는 새로운 Egr-1 결합단백질을 발견하였고, Egr-1의 단백질 안정성과 그 기능을 조절하는 새로운 기작을 제시하였다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• Ⅰ. INTRODUCTION = 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS
• Materials = 13
• Strains, plasmids and DNA manipulation = 13
• Two-hybrid library screening and evaluation of protein-protein interactions = 14
• Cell culture and hypoxic condition = 14
• GST-pull down assay = 16
• Coimmunoprecipitation = 16
• Western blot analysis = 17
• RT-PCR and primers = 17
• Luciferase assay = 18
• In vivo ubiquitination assay = 18
• Covalent conjugate formation assay = 19
• In vitro SUMO-1 conjugation assay = 20
• Ⅲ. RESULTS
• Egr-1 interacts with the PRC8 through the C-terminal region = 21
• Egr-1 interacts with PRC8 in vitro and in vivo = 25
• Association of Egr-1 with PRC8 causes its degradation through the proteasome
• pathway = 28
• PRC8 destabilizes Egr-1 = 31
• Effects of PRC8 on the transcriptional activity of Egr-1 = 34
• Egr-1 is multiubiquitinated = 34
• Egr-1 of hypoxia on the degradation of Egr-1 protein = 37
• Egr-1 also interacts with hUBC9 through the C-terminal region = 40
• Egr-1 interacts with Egr-1 in vitro and in vivo = 45
• Sumoylation of Egr-1 = 48
• Ⅳ. DISCUSSION = 52
• Ⅴ. SUMMARY = 66
• REFERENCES = 68
• ABSTRACT(in Korean) = 87
• ACKNOWLEDGEMENTS