감염성 병원균 검출을 위한 PCR-유도 SERS 증폭기술

국문 초록 (Abstract)

패혈증은 병원균에 의한 감염으로 유발된 염증 반응이 전신으로 번져 전신에 이상 증세가 나타나는 상태를 의미한다. 이는 특히 면역력이 떨어지는 신생아와 유아, 노년층에서 빈번하게 발생하며 사망률 또한 높은 위험한 질병이다. 적절한 치료를 위해서는 감염 초기의 원인균 식별과 적절한 항생제 투여가 중요하지만, 항생제 내성균의 출현과 현재 사용중인 진단 기술들이 가지는 한계들로 인해 빠르고 정확한 치료가 어려운 실정이다. 현재까지는 혈액배양을 통한 감염 여부 확인 후 증식된 검체에서 단백질, 핵산 등의 바이오마커 검사를 통해 원인균을 식별하는 방법이 지배적이지만 전체 과정에 오랜 시간이 소요되며 패혈증은 초기 치료가 지연될수록 사망률이 빠르게 증가하기 때문에 보다 신속하고 정확한 새로운 진단 기술이 요구되고 있다.
표면 강화 라만 분광법 (SERS)은 다중 검출 능력과 높은 감도에 대한 잠재력으로 인해 화학 물질 및 생물학적 분석물을 모니터링하는 데 널리 사용되는 기술이다. 최근에는 감염성 질환 및 종양 모니터링을 위한 각종 질병 관련 핵산 바이오마커 분석에도 활용되고 있다. SERS의 다중 검출능에도 불구하고 결과의 재현성은 현장에서 사용을 어렵게 만드는 잠재적인 위협 중 하나이다. 일반적으로 환자의 희귀 돌연변이 및 초기 감염 상태와 같은 고도로 복잡한 생물학적 시료 내의 낮은 표적 농도에 의해 재현성의 저하가 발생한다.
본 연구에서는 핵산 모니터링에 대한 검출 감도를 향상시키기 위해 SERS를 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)과 통합하여 다양한 질병 관련 병원체를 다중적이고 민감하게 동시에 검출할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다. 이를 위하여 Raman dye를 포함한 dumbbell 구조의 DNA probe (Dumbbell probe)를 제작하였으며, PCR에 의한 타겟 유전자 증폭 과정 중에 dumbbell probe의 구조가 일부 절단되어 SERS 신호를 발생시키도록 하였다. 결론적으로 PCR의 타겟 유전자 증폭이 dumbbell probe의 구조적 변화를 유발하여 SERS 신호의 증폭으로 이어질 수 있다. 연구에서 사용된 primer와 probe의 서열은 패혈증을 유발하는 원인균들을 대상으로 설계되었으며, 실험을 통하여 본 기술의 유효성을 검증하고자 하였다. 이를 통해 본 연구에서 개발한 PCR-SERS 연계 기술이 혈액과 타액과 같은 복잡한 생물학적 시료의 희귀 병원체를 다중적이며 민감한 방식으로 모니터링하는 데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) has become a technique that is widely used for the monitoring chemicals and biological analytes due to its potential of multiplexing ability and sensitivity. More recently, it has been also used to analyze various disease-related nucleic acid biomarkers for the monitoring infectious disease and tumor. Even though its multiplexing ability, result-reproducibility is one of potential threat which makes difficulty of using in the field. Normally it happens according to the low target concentration within highly complex biological samples such as rare mutation and early stage infection status in patients. In this study, in order to improve the sensitivity of detection for monitoring nucleic acids, SERS was integrated with polymerase chain reaction (PCR) to amplify target-specific nucleic acid that triggers SERS amplification sequentially. Based on this, we attempted to develop a technology that capable to simultaneously detect various disease-related pathogens in a multiplexed and sensitive manner. To increase the sensitivity and selectivity of detection, silver and gold hybrid star-shaped nanoparticles (Ag-Au HNPs) were synthesized and nucleic acid Raman probe were immobilized on the Au-Ag HNPs. Basically PCR amplifies pathogen-specific SERS residues and amplified sequences trigger conformational change of target-specific Raman probes by complementary interaction. As a model system, primers and probes are designed against sepsis-causing bacteria and PCR-based target sequence amplification were initiated SERS signal enhancement. We believe this platform technology can be used for monitoring rare-pathogens from complex biological samples such as blood and saliva in a multiplexed and sensitive manner.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서 론--------------------------------------------------------------------------------------1
• 제 2 장 감염성 병원균 검출을 위한 PCR-유도 SERS 증폭기술------------------------------19
• 2.1 실험 기구------------------------------------------------------------------------------------19
• 2.2 실험 방법------------------------------------------------------------------------------------21
• 2.2.1 Spherical gold nanoparticle 합성----------------------------------------------------21
• 2.2.2 Star-shaped gold nanoparticle 합성------------------------------------------------21
• 2.2.3 Silver coated gold nanostar particle 합성------------------------------------------21
• 2.2.4 SERS probe 제작------------------------------------------------------------------------22
• 2.2.5 박테리아 배양 및 DNA 추출------------------------------------------------------------23
• 2.2.6 중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction)------------------------------------24
• 2.2.7 DNA 전기영동 (DNA gel electrophoresis)------------------------------------------24
• 2.2.8 라만 신호 측정---------------------------------------------------------------------------25
• 2.3 실험 결과------------------------------------------------------------------------------------26
• 2.3.1 Synthetic target을 이용한 SERS probe 조건 최적화-------------------------------26
• 2.3.2 K.pneumoniae 유전자 증폭에 의해 유도되는 dumbbell probe의 구조 변화 확인-----------36
• 2.3.3 S.aureus 유전자 증폭에 의해 유도되는 dumbbell probe의 구조 변화 확인-------------------46
• 2.3.4 PCR-유도된 SERS 신호 확인----------------------------------------------------------55
• 제 3 장 결론 및 토의---------------------------------------------------------------------------67
• 참 고 문 헌--------------------------------------------------------------------------------------71
• ABSTRACT-------------------------------------------------------------------------------------79