Roles of cholesterol during C. elegans larval development : transcriptional regulation by daf-9, daf-12, and daf-16 = 예쁜꼬마선충에서 콜레스테롤이 유충성장에 미치는 영향 연구 : daf-9, daf-12, daf-16의 전사조절

국문 초록 (Abstract)

C. elegans를 포함한 선충은 성장을 위해 영양체로써 스테롤이 필수적인 요소임에도 불구하고 생체내에서 콜레스테롤을 합성할 수 없다. C. elegans는 콜레스테롤이 결핍된 조건에서 dauer와 유사한 larvae 형성을 보여주지만, 이러한 과정 동안의 dauer formation (daf) 유전자들의 관계는 여전히 불명확하다. 이 과정에서 daf-9, daf-12, daf-16 사이의 유전학적 관계를 밝히기 위해 콜레스테롤 결핍 조건에서 이 유전자들의 mRNA 발현량을 측정하였다. DAF-9 (cytochrome P450)은 호르몬 수용체인 DAF-12의 ligand를 생성한다. DAF-16은 daf-2/insulin-like 신호 전달계의 중요한 인자이다. 우리는 콜레스테롤 결핍 조건에서 daf-9, daf-12, daf-16의 mRNA 발현량이 증가한다는 사실을 밝혀냈다. 또한 콜레스테롤 결핍 조건은 DAF-16 nuclear localization을 유도하고, DAF-12와 DAF-9의 활성에 따라 촉진되거나 억제된다. 우리는 또한 FOXO 전사 인자인 DAF-16이 daf-12의 mRNA 발현을 촉진하고 daf-9의 mRNA 발현을 억제하는 반면 DAF-9은 daf-12 mRNA 발현을 억제한다는 사실을 밝혀냈다. 콜레스테롤 결핍 조건에서 유도되는 유충시기에 성장이 멈추는 현상은 DAF-12와 DAF-16에 의해 촉진되고, DAF-9에 의해 억제된다. daf-9 돌연변이에서 나타나는 larval 성장의 정지는 daf-12 RNAi에 의해 억제되므로 DAF-12는 DAF-9의 downstream에 위치한다. 위와 같은 결과는 콜레스테롤 결핍 조건에서 laval 성장을 조절하는 콜레스테롤 신호 전달계를 매개로 daf-9, daf-12, daf-16 사이에 순환적인 상호 조절이 이루어진다는 사실을 알 수 있다. 반면에, 콜레스테롤 결핍에 의한 DAF-16 translocation은 sod-3의 발현이나 life span의 증가를 유도하지 않았다. 콜레스테롤 결핍에 의한 일반적인 건강하지 못한 상태나 다른 스트레스의 유발이 아마도 longevity에 대한 DAF-16 translocation의 영향을 저해했을 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Nematodes including free-living C. elegans require sterol for their growth as a nutritional source because C. elegans is unable to biosynthesize sterol de novo. C. elegans shows dauer-like larvae formation upon cholesterol starvation (CS), but the genetic epistasis among abnormal dauer formation (daf) genes during the process remains unclear. To clarify the genetic interactions among daf-9, daf-12, and daf-16 in this process, mRNA levels of these genes upon CS were measured. DAF-9, a cytochrome P450, produces a ligand for DAF-12, a hormone receptor. DAF-16 is a key factor in the daf-2/insulin-like signaling. We found that CS increased the mRNA levels of daf-9, daf-12, and daf-16. CS also induced DAF-16 nuclear localization, which was positively and negatively regulated by DAF-12 and DAF-9 activities, respectively. We also found that DAF-16, a FOXO transcription factor, enhanced the mRNA levels of daf-12 but suppressed that of daf-9, whereas DAF-9 regulated daf-12 mRNA level negatively. Concomitantly, CS-induced larval arrest was regulated positively by DAF-12 and DAF-16, but negatively by DAF-9. The effect of daf-9 mutant on the larval arrest was suppressed by daf-12 RNAi, placing DAF-12 downstream of DAF-9. These results altogether suggest that circulatory mutual regulation among daf-9, daf-12, and daf-16 at the expression level mediates cholesterol signal to control larval development upon CS. On the other hand, DAF-16 translocation upon CS did not induce sod-3 expression or extend life span. General sickness or other stresses caused by CS might have hindered the effect of DAF-16 translocation on longevity.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction = 1
• Ⅱ. Materials and Methods = 6
• 1. Nematode strains and general methods = 6
• 2. Analysis of brood size, embryonic lethality, and percent development = 7
• 3. Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) = 8
• 4. Fluorescence Microscopy Determination of DAF-16 Nuclear Translocation = 11
• 5. Life span measurement = 12
• 6. RNA interference analysis = 13
• 7. Generation of Transgenic Lines Containing daf-9::GFP or daf-12::GFP Transgene in daf-16(mu86) = 14
• 8. Quantitation of daf-9::GFP and daf-12::GFP expression level = 15
• Ⅲ. Results = 17
• 1. Cholesterol feeding is required for the normal growth and reproduction of C. elegans = 17
• 2. DAF-16 nuclear localization upon cholesterol starvation = 19
• 3. Cholesterol is required for normal life span = 22
• 4. DAF-12 promotes while DAF-9 represses DAF-16 translocation and larval arrest upon cholesterol starvation = 23
• 5. Expressions of daf-9, daf-12, and daf-16 are mutually regulated by their activities = 28
• 6. daf-2 signaling inputs to cholesterol starvation signaling through DAF-12 or DAF-16 = 30
• Ⅳ. Discussion = 32
• Ⅴ. Summary = 39
• Ⅵ. Reference = 67
• Abstract in Korean = 73