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Long-Term Culture of Gonadal Primordial Germ Cells(gPGCs) for Genetic Manipulation in Chicken
Kim, Seon-Ku,Lee, Gil-Wang,Han, Jae-Yong,Hong, Yeong-Ho,Cho, Byung-Wook 密陽産業大學校 農業技術開發硏究所 1998 農業技術開發硏究所報 Vol.2 No.1
닭을 포함한 조류의 원시생식세포는 포유류의 원시생식세포와는 다르게 초기 배 발달 단계 중 extraembryonic 부위에 존재하면서 혈관계를 따라 원시생식기로 이동한다. 따라서 원시생식 세포의 분리 및 배양 그리고 게놈의 조작에 의한 수용체에로의 주입은 형질전환 닭 생산을 위한 매우 매력적인 과제라 할 수 있다. 비록 단기간 (5일정도) 배양에 대한 보고가 있으나, 닭의 embryonic stem cell (ES) 또는 PGC의 장기간 배양에 대한 보고는 거의 전무한 상태이다. Mouse의 경우 원시생식세포의 중식, 성장 그리고 분화는 여러 요인들에 의해 조정된다 LIF, IGF-1, SCF, bFGF, IL-11등과 같은 인자에 의한 닭 원시생식세포의 장기배양 결과 원시생식기의 stroma 세포를 feeder, layer로 사용하였으며, 약 3개월간 성공적으로 배양할 수 있었다. 배양 초기 1-2일을 전후해 세포의 수가 급감함을 관찰할 수 있었는데 이는 초기 세포 분리시 피해입은 세포등에 의한 원인이라 생각된다. 배양된 원시생식세포는 쥐의 ES 세포에 특이 적인 항체인 MC-480 (anti-SSEA-1)에 특이적으로 염색이되어 ES 세포의 특성을 가지면서 장기간 배양이 가능함을 입증하였다. 또한 배양 기간중 약 50%의 원시생식세포가 분열중임을 proliferation assay을 하여 입증하였으며, pCMV-GFP plasmid DNA을 전기충격 법을 이용하여 원시생식세포에 전이시켜 약 2달간 배양한 후 2.5일령의 수용체에 주입하여 부화시킨 다음 생식기, 간. 심장등으로부터 DNA을 추출한 다음 PCR을 수행한 결과 생식기에서는 모두 관찰이 가능하였고, 한 개체에서는 간과 심장에서도 발현이 되었다. 결론적으로 원시생식세포를 체외에서 성공적으로 장기간 배양이 가능하였으며, 유전자 전이에 의한 주입결과 수용체 생식기로 이동함을 확인하였다. 이러한 결과는 원시생식기세포의 장기 배양이 가능함으로써 체외에서의 유전적 조작이 가능하고 EG cell로서의 개발도 가능하여 형질전환 닭 생산에 많은 기여를 할 수 있을것으로 사료된다. Gonadal primordial germ cells (gPGCs) were isolated from the gonad of 6days old embryo and cultured in the presence of IGF-I, LIF IL-II SCF, and germ cells (gPGCs) were isolated from the gonad of 6 bFGF for 3 months without passage. The gPGCs started to form colonies composing about 10 gPGCs after 7 days of culture. The morpholegical and histochemical characteristics of gPGC cultured for 3 months remained same compared to those of gPGCs cultured for 6 days. The long-term cultured gPGCs expressed the murine ES cell specific epitopes, SSEA-1 PGC-specific antibody. The gPGC population showed capacity of proliferation during culture period. The gPGCs cultured for 3 weeks after tansfection were injected to the recipient embryos and the embryos were incubated for an additional 3.5 days or to hatching at 37 .The exogenous gene was detected in forty out of fifty recipient embryos gonads. PCR analysis of DNA from the hatched chicks showed that exogenous DNA was detected in the gonads and not in the liver or heart. These results indicated that the long-term cultured gPGCs can contribute to gonadal formation after transfer to embryo and be used as useful vector for the genetic manipulation to produce transgenic chicken.
Effects of Gamma-Irradiation on the Sterilization of Primordial Germ Cells in Quail
Kyung Je Park(박경제),Tae Min Kim(김태민),Hyung Chul Lee(이형철),Hyun-Jun Jang(장현준),Gwonhwa Song(송권화),Jae Yong Han(한재용) 韓國家禽學會 2010 韓國家禽學會誌 Vol.37 No.2
조류의 원시생식세포는 수용체 배자로의 주입을 통해서 생식선 카이메라 생산을 가능하게 하기 때문에 유전자 도입에 매우 효율적인 도구이다. 특히, 메추리는 성성숙이 빠르며 산란능력이 뛰어 나기 때문에 형질전환 조류 생산과 유전자 기능 연구에 매우 적합하다. 형질전환 조류 생산 효율을 높이기 위해서는 수용체 배자 내의 원시생식세포의 수를 줄이는 것이 필수적인 요소이지만, 아직까지 메추리에서 이러한 시도를 했다는 보고는 없다. 본 연구는 감마선 조사가 수용체 내의 원시생식세포의 수를 감소시킬 수 있는지 알아보았다. 먼저 0, 250, 500, 750, 1,000 rads 강도의 감마선을 갓산란된 메추리알에 조사 후 5일령 배자에서 기형 발생빈도를 측정하였고, 0과 500 rads에서 17일째 부화율을 검정하였다. 그리고 500 rad의 감마선을 산란된 알에 73초간 조사 후 5일간 배양시킨 뒤 원시생식세포의 수를 측정하였다. 그 결과, 1×10⁴개의 세포 당 원시생식세포의 수는 수컷은 107.75±3.96에서 80.30±4.34로, 암컷에서 99.56±3.22에서 81.67±3.72로 원시생식세포수가 감소되었다. 이상의 연구 결과는 감마선 조사가 수용체 배자내의 원시생식세포를 감소시킬 수 있고, 이를 형질 전환 기술에 접목시켜서 생식선 카이메라 효율을 높일 수 있는 가능성을 보여 주고 있다. Quail is a very useful animal model for studying vertebrate development because of its small body size and unique reproductive traits. This species is also ideal model for producing germline chimeras via transferring exogenous primordial germ cells (PGCs) into the recipient embryo. To increase the contribution efficiency of donor PGCs into recipients’ tissues, decreasing the population of endogenous PGCs has been rate-limiting factor. We therefore conducted this study to investigate if gamma (γ)-irradiation depletes endogenous PGCs in developing quail embryo. Firstly, freshly laid stage X quail embryos were irradiated with various output of γ-irradiation and its teratogenic effect on the embryo was evaluated. Although a dose-dependent increase in the number of embryo showing malformation was found as the output increased (0, 250, 500, 750, and 1,000 rads), only a maximum of 10.1% of embryos were abnormal in 1,000 rads. Immunocytochemical analysis using the QCR1 antibody, which is specific marker for quail PGCs, was conducted to analyze the effect of sterilization. As results, γ-rays at a dose-rate of 500 rads/73 sec onto undeveloped stage X embryo significantly reduced the number of germ cells to an average of 75.55 % and 82.03 % in male and female embryos, respectively. We conclude that γ-ray selectively targets PGCs while affects minimally to the somatic development in quail embryo. Our results will not only provide important data for germline chimera production but can be used for analyzing the effect of ionized rays on the differentiating germ cells in various stages during animal development.
Effects of Gamma-Irradiation on the Sterilization of Primordial Germ Cells in Quail
박경제,김태민,이형철,장현준,송권화,한재용,Park, Kyung-Je,Kim, Tae-Min,Lee, Hyung-Chul,Jang, Hyun-Jun,Song, Gwon-Hwa,Han, Jae-Yong The Korean Society of Poultry Science 2010 韓國家禽學會誌 Vol.37 No.2
조류의 원시생식세포는 수용체 배자로의 주입을 통해서 생식선 카이메라 생산을 가능하게 하기 때문에 유전자 도입에 매우 효율적인 도구이다. 특히, 메추리는 성성숙이 빠르며 산란능력이 뛰어 나기 때문에 형질전환 조류 생산과 유전자 기능 연구에 매우 적합하다. 형질전환 조류 생산 효율을 높이기 위해서는 수용체 배자 내의 원시생식세포의 수를 줄이는 것이 필수적인 요소이지만, 아직까지 메추리에서 이러한 시도를 했다는 보고는 없다. 본 연구는 감마선 조사가 수용체 내의 원시생식세포의 수를 감소시킬 수 있는지 알아보았다. 먼저 0, 250, 500, 750, 1,000 rads 강도의 감마선을 갓 산란된 메추리알에 조사 후 5일령 배자에서 기형 발생빈도를 측정하였고, 0과 500 rads에서 17일째 부화율을 검정하였다. 그리고 500 rad의 감마선을 산란된 알에 73초간 조사 후 5일간 배양시킨 뒤 원시생식세포의 수를 측정하였다. 그결과, $1{\times}10^4$개의 세포 당 원시생식세포의 수는 수컷은 $107.75{\pm}3.96$에서 $80.30{\pm}4.34$로, 암컷에서 $99.56{\pm}3.22$에서 $81.67{\pm}3.72$로 원시생식세포수가 감소되었다. 이상의 연구 결과는 감마선 조사가 수용체 배자내의 원시생식세포를 감소시킬 수 있고, 이를 형질 전환 기술에 접목시켜서 생식선 카이메라 효율을 높일 수 있는 가능성을 보여 주고 있다. Quail is a very useful animal model for studying vertebrate development because of its small body size and unique reproductive traits. This species is also ideal model for producing germline chimeras via transferring exogenous primordial germ cells (PGCs) into the recipient embryo. To increase the contribution efficiency of donor PGCs into recipients' tissues, decreasing the population of endogenous PGCs has been rate-limiting factor. We therefore conducted this study to investigate if gamma ($\gamma$)-irradiation depletes endogenous PGCs in developing quail embryo. Firstly, freshly laid stage X quail embryos were irradiated with various output of $\gamma$-irradiation and its teratogenic effect on the embryo was evaluated. Although a dose-dependent increase in the number of embryo showing malformation was found as the output increased (0, 250, 500, 750, and 1,000 rads), only a maximum of 10.1% of embryos were abnormal in 1,000 rads. Immunocytochemical analysis using the QCR1 antibody, which is specific marker for quail PGCs, was conducted to analyze the effect of sterilization. As results, $\gamma$-rays at a dose-rate of 500 rads/73 sec onto undeveloped stage X embryo significantly reduced the number of germ cells to an average of 75.55 % and 82.03 % in male and female embryos, respectively. We conclude that $\gamma$-ray selectively targets PGCs while affects minimally to the somatic development in quail embryo. Our results will not only provide important data for germline chimera production but can be used for analyzing the effect of ionized rays on the differentiating germ cells in various stages during animal development.
Production of interspecies germline chimera by germ cell transplantation
Seok Jin Kang,Jin Won Choi,Sun Young Kim,Kyung Je Park,Tae Min Kim,Young Mok Lee,Jeong Mook Lim,Jae Yong Han 한국가금학회 2008 한국가금학회 정기총회 및 학술발표회 Vol.25 No.-
본 연구는 이종간 생식세포 이식을 이용한 야생조류를 생산한 최초의 보고이다. 7일령 배자로부터 회수된 꿩 생식선 원시생식세포는 2.5일령 닭 배자의 혈관에 이식하였다. 생산된 카이메라에서 정상적인 꿩 유래의 생식세포가 spermatogenesis에 관여함을 꿩 정액 생산을 통해 확인하였고, 수컷 생식선 카이메라와 암컷 꿩의 번식을 통해 10마리의 꿩 자손을 생산하였다. 따라서 본 연구는 이종간 생식세포의 이식을 통해 야생조류의 생산을 가능하게 하였고, 이 기술은 멸종위기 조류의 복원에 적용될 수 있을 것이다.
번식생리 및 내분비 : 한국재래닭(오계) 원시생식세포의 완만동결과 급속동결의 비교
김성우 ( Sung Woo Kim ),고응규 ( Yeoung Gyu Ko ),변미정 ( Mi Jeong Byun ),도윤정 ( Yoon Jung Do ),한재용 ( Jae Yong Han ),김동훈 ( Dong Hun Kim ),성환후 ( Hwan Hoo Seong ),김현 ( Hyun Kim ) 한국동물자원과학회(구 한국축산학회) 2013 한국축산학회지 Vol.55 No.5
We sought to provide a method for freezing and preserving primordial germ cells, or an avian germ cell of a bird, as a material for developmental engineering or species preservation. The aim of this study was to compare the efficacy of slow freezing with a vitrification method for the cryopreservation of chicken primordial germ cells(PGCs). PGCs obtained from the germinal gonad of day 5.5-6 day(stage 28) cultured chick embryos, using the MACS method, were classified into two groups: slow freezing and vitrification. We examined the viability of PGCs after Cryopreservation. Four freezing methods were compared with each other, including the following: Method 1: The PGCs were frozen by a programmed freezer in a plastic straw, including 2.0M ethylene glycol(EG) as cryoprotective additive(slow freezing) Method 2: The PGCs were vitrified in a plastic straw, including 8.0 M EG, plus 7% polyvinylpyrrolidone(PVP)(rapid freezing). Method 3: The slow freezing was induced with a cryotube including 2.0 M EG Method 4: The PGCs were frozen in a cryotube including 10% dimethyl suloxide(DMSO)(rapid freezing). After freezing and thawing, survival rates of the frozen-thawed PGCs from Method 1 to 4were 76.4%, 70.6%, 80.5% and 78.1%(p<0.05), respectively. The slow freezing(-80℃ programmed freezer) method may provide better survival rates of frozen-thawed PGCs than the vitrification method for the cryopreservation of PGCs. Therefore, these systems may contribute to the cryopreservation of a rare avian species.
번식생리 및 내분비 : 한국재래닭(오계) 원시생식세포에 있어 동결방법의 개선이 융해 후생존율에 미치는 영향
김현 ( Hyun Kim ),김동훈 ( Dong Hun Kim ),한재용 ( Jae Yong Han ),최성복 ( Sung Bok Choi ),고응규 ( Yeoung Gyu Ko ),도윤정 ( Yoon Jung Do ),성환후 ( Hwan Hoo Seong ),김성우 ( Sung Woo Kim ) 한국동물자원과학회(구 한국축산학회) 2013 한국축산학회지 Vol.55 No.5
This study was conducted to establish methods for preserving chicken primordial germ cells(PGCs) for long-term storage in liquid nitrogen and for developmental engineering or preservation of species. The purpose of this study is to clarify the effects of fetal bovine serum(FBS) or chicken serum(CS) treatment on the viability of cryopreserved PGCs from Korean Native Chicken (Ogye). PGCs separated from a germinal gonad of an early embryo at day 5.5-6(stage 28) were suspended in a freezing medium containing freezing and protective agents(dimethyl sulfoxide(DMSO), ethylene glycol(EG) and glycerol). The values from 0, 5, 10, and 15 % DMSO plus FBS treatment were 21.6, 30.36, 36.42, 50.39, and 48.36 %, respectively. The viability of PGCs after freeze-thawing was significantly higher for 10% EG plus FBS treatment than for 10% EG+FCS treatment(p<0.05) (64.36% vs. 50.66%). This study establishes a method for preserving chicken PGC that enables systematic storage and labeling of cryopreserved PGC in liquid nitrogen at a germplasm repository and an ease of entry into a database. In the future, the importance for this new technology is that poultry lines can be conserved while work is being conducted to improve the production of germline chimeras.