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- 저자 : 배동훈 ( Hee Kyoung Park (검색결과 4 건)
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Han, Hye Jeong,Kim, Jin Man,Park, Hee Kyoung,Bai, Dong Hoon,Yu, Ju Hyun 한국산업미생물학회 1992 한국미생물·생명공학회지 Vol.20 No.6
알칼리내성 Bacillus sp. YA-14 유래의 pectate lyase 유전자를 함유한 재조합균주로부터 affinity method, CM-cellose column chromatography와 gel filtration을 통해 효소를 정제하였으며 정제효소의 수율은 10.2%, 정제도는 258배였다. 효소의 최적활성 pH는 10.0이었고 pH 4.0∼10.0까지의 범위에서 안정성이 있었으며,최적활성온도는 60℃이고 50℃ 까지 열안정성이 있으며 SDS-PAGE에 의해 추정된 분자량은 43 Kda이었다. 아미노산 조성 분석 결과 polar, basic 아미노산의 함량이 높고 특히 Ser, Gly, Tyr의 함량이 높았으며, 정제효소의 N-terminal은 Ala-Asp-Leu-Gly-His-Gln-Thr의 아미노산 서열이었다. Pectate lyase produced by recombinant strain containing pectate lyase gene from alkalitolerant Bacillus sp. YA-14 was successively purified with 257.6 purification folds and a 10.2% yields by the affinity method, CM-cellulose column chromatography followed by gel filtration on Sephadex G-100 column. The optimal pH and temperature for pectate lyase activity were 10.0 and 60℃, respectively. The enzyme was stable between pH 4.0 and 10.0, and up to 50℃. The molecular weight of this enzyme was estimated to be 43,000 daltons by SDS-PAGE. Amino acid analysis showed that the enzyme contained more polar and basic amino acids, especially serine, glycine and tyrosine, than that of various pectate lyase from other strains. The N-terminal amino acid sequence was Ala-Asp-Leu-Gly-His-Gln-Thr.
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Bacillus sp. YA-14의 Xylanase 와 β- Xylosidase유전자의 재조합
나규흠,김지만,박희경,배동훈,유주현 한국산업미생물학회 1990 한국미생물·생명공학회지 Vol.18 No.2
토양으로부터 분리한 알카리내성 Bacillus sp. YA-14의 xylanase 유전자를 포함하고 있는 재조합 plasmid pYDC21의 EcoRI site에 β-xylosidase 유전자를 함유한 plasmid pYXL22의 5.7kb DNA 단편을 삽입시킴으로써 xylanase와 β-xylosidase 유전자가 동시에 연결된 약 13kb의 재조합 plasmid pYDK43을 제조하였다. Xylanase와 β-xylosidase를 동시에 생산하는 재조합 균주 E. coli HB101(pYDX43)이 기질인 xylan으로부터 직접 xylose까지 분해하는 것을 TLC상에서 확인하였다. E. coli HB101(pYDX43)이 생산하는 xylanase의 경우 공여균주인 Bacillus sp. YA-14보다 효소생산이 약 30% 증가하였으나 β-xylosidase의 경우 2.5배 감소하였다. A recombinant plasmid, pYDX43, was consturcted by inserting 5.7kb EcoRI DNA fragment of pYXL22 containing β-xylosidase gene into EcoRI site of pYDC21 which was carrying encoding xylanase gene. The end-product of xylan hydrolysis with crude cell extract of E. coli HB101 harboring pYDX43 was found to be xylose by TLC analysis. The productivity of xylanase with E. coli HB101(pYDX43) was 1.3 times higher than that with Bacillus sp. YA-14, but the synthesis of β-xylosidase was rather 2.5 times lower.
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호알칼리성 Bacillus sp.가 생산하는 Bacteriolytic Enzyme을 이용한 Bacillus subtilis의 형질전환
유주현,이인숙,옥승호,박희경,염도영,배동훈 한국산업미생물학회 1993 한국미생물·생명공학회지 Vol.21 No.5
호알칼리성 Bacillus sp. YJ-451이 생산하는 bacteriolytic enzyme은 Bacillus subtilis 원형질체 형질전환에 사용되고 있는 세포벽 용해효소 lysozyme과 그 작용기작이 서로 다른 endopeptidase로 peptidoglycan peptide subunit의 L-alanine과 D-glutarnic acid 사이를 절단한다. 이 lytic enzyme을 이용하여 B. subtilis의 원형질체 형질전환에 대한 조건을 검토하였다. 대수기 말기까지 생육시킨 균체에 lytic enzyme을 5×10exp(2) U/㎖ 농도로 37℃ 에서 pH 6.5로 90분간 처리하였을 때 원형질체 형성이 가장 잘 되었다. 원형질체 형성을 위한 완충용액내의 osmotic stabilizer인 sucrose는 0.5 M 농도가 가장 적당하였으며 0.8% agar가 첨가된 pH 7.3의 DM-3 재생배지에서 37℃ 로 재생시켰을 때 재생율이 가장 높았다. 형질전환 빈도는 30%(w/v) PEG 6000으로 2분간 처리하였을 때 최고의 형질전환 빈도를 나타내었다. B. subtilis 형질전환에 사용된 pUB110의 농도에 따른 형질전환율은 직선적으로 비례하는 양상을 보였으며, lytic enzyme을 사용하여 형질전환하였을 경우 lysozyme을 사용한 경우보다 형질전환 빈도는 다소 낮았으나 재생시간은 약 30시간 이상 빠르게 일어나 신속한 형질전환에 유리하였다. The extracellular bacteriolytic enzyme from alkalophilic Bacillus sp. YJ-451 was endopeptidase which hydrolyzes the peptide bond at the amino group of D-glutamic acid in the peptidoglycan. Protoplast transformation system of B. subtilis by the lytic enzyme that differs, in mechanisms, from lysozyme which was used to transformation of B. subtilis was investigated. High protoplast yield was obtained from cells cultured in PAB at the late logarithmic growth phase. Protoplasts of B. subtilis were obtained at best efficiency by treatment with 5×10exp(2) U/㎖ lytic enzyme in the pH 6.5 of SMMP buffer containing 0.5 M sucrose. Cell wall was regenerated efficiently on DM-3 (pH 7.3) medium containing 0.8% agar. Under the best condition for protoplast formation and regeneration the highest transformation efficiency was achieved with 30% (w/v) PEG (M.W. 6000) treatment for 2 min. The transformation efficiency according to plasmid DNA concentration showed a linear relationship to DNA amounts. The transformation frequency by lytic enzyme was lower than lysozyme, but the regeneration time of the one was more rapid by 30 hr than the other.
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