Molecular Mechanisms of Oxidative Stress-Induced Viral and Cellular Responses

표철웅 고려대학교 생명공학원[실은 대학원] 2009 국내박사

Reactive oxygen species, a collective term which includes various oxygen species that result from reactions between oxygen and free radicals are continuously generated in living cells and their concentration is exquisitely regulated by diverse antioxidants, a phenomenon called reduction/oxidation (redox) balance. Since disturbance of redox system causes potential alteration of cellular metabolism, it is generally termed "oxidative stress". Oxidative stress is caused by various stresses, chronic fatigue, malnutrition and viral infection, etc. HIV infection is a representative case which induced intracellular oxidative stress through a significant decrease of plasma cystine and cysteine level and triggers a consequence of the immune disturbance, as depletion of CD4+ T cells. The aim of this study is to address effects of oxidative stress both on host and virus, focusing on their gene regulation. First, it has been found that introduction of a HIV viral protein, Tat, into Jurkat T cells was shown to produce an increased level of intracellular ROS. Because HIV expression is precisely regulated through its LTR promoter, LTR-mediated reporter gene system was used to demonstrate oxidative-stress induced HIV gene regulation. Strong induction of HIV gene under an oxidative condition was suggested that a host transcription factor, NF-kappa B is a major inducer against oxidative stress. Through various experiments, it could be concluded that NF-kappa B activation was regulated by posttranslational events, not de novo transcriptional induction, including phosphorylation and acetylation by oxidants. In turn, it acted as a key regulator of HIV gene expression. On the other hand, stimulation of the Jurkat T cells with hydrogen peroxide was found to induce considerable cell death and the protein kinase, PKR was involved with ROS-mediated Jurkat T cell death. In the early phase of stimulation, oxidants increased IFN_(-γ) level and mediated activation of JAK-STAT signal pathway, which caused transcriptional induction of PKR. Finally, siRNA-mediated inhibition of IFN_(-γ) or PKR expression significantly downregulated H₂O₂-mediated apoptotic cell death. These results indicated that oxidative stress induces PKR expression essentially via the IFN_(-γ) activation signal, and causes apoptosis in Jurkat T cells. In another cell response to oxidative stress, to avoid from the various damages induced by oxidative stress, cells select a cell cycle arrest via regulation of cyclin-proteins. On H₂O₂ treatment, cyclin D1 was rapidly declined through an endoplasmic reticulum (ER)-stress and this drop of cyclin D1 was closely correlated with phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 alpha (eIF2-alpha). This depletion of cyclin D1 induced G1, G2/M arrest and a prolonged arrest resulted in the progression of cell death and which was partially involved with p53 activation. Therefore, these results demonstrate that ROS-induced phosphorylation of eIF2 alpha is associated with cells cycle control by depletion of cyclin D1. Taken together, these evidences are helpful to understand the link between virus-mediated immune disturbances. Also they will serve a clinical value in term of preventing the oxidative stress-mediated diseases progression and recurrence. 본 논문에서는, 이 같은 산화적 스트레스가 바이러스와 숙주세포 양쪽 모두에게 미치는 영향을 살펴보고자 하였다. 이 같은 바이러스로부터 유도된 산화적 스트레스를 확인하고자, 특성 바이러스 단백질의 과량 발현 혹은 도입이 세포 내 활성산소의 축적을 일으키는지를 일차적으로 확인하였으며, 역으로 일정 농도의 활성 산소 하에서, 바이러스의 발현이 조절되는지를 조사하였다. HIV의 경우, 그 발현이 바이러스의 LTR (Long Terminal Repeat)에 의해 조절되는바, LTR에 의해 조절되는 리포터 (Reporter) 벡터 시스템을 이용하여, 그 발현이 농도에 따라 점진적으로 증가되는 것을 밝혀내었다. 특히, 이 같은 발현증가에 있어서, 바이러스가 숙주의 전사 인자인 NF_(-Κ)B를 활용하는 것을 확인하였으며, 이를 위해서, NF_(-Κ)B 단백질의 phosphorylation과 acetylation과 같은 post-translational control이 주 메커니즘 임을 밝혀내었다. 반면, 산화적 스트레스는 숙주세포의 세포 사멸을 유도하는 것으로 보고 되고 있는데, 특히, HIV의 주 감염대상인 T cell의 경우, 산화적 스트레스에 의한 현저한 사멸효과를 보여주었다. 본 실험에서는, 이 같은 사멸반응 과정에 있어서, PKR (double stranded RNA-dependent protein kinase) 인자가 관여됨을 확인하였다. 특히, 산화적 스트레스에 의한 초기 반응에서 PKR 발현증가가, IFN_(-γ)(Interferon gamma)에 의한 JAK (Janus kinase) 활성화를 통해 이뤄진다는 것을 확인하였으며, IFN_(-γ) 와 PKR을 대상으로 한 siRNA 간섭효과를 통해서, 세포의 사멸작용이 억제되는 것을 확인하였다. Cystein과 같은 항산화 전구물질이 적은 HIV 비감염 개체의 경우, T cell 면역세포의 숫적 감소가 관찰된다는 학계의 보고에 비춰볼 때, 이 같은 기작의 이해는 HIV에 의한 면역 결핍증상과 같은 면역세포의 감소가, 바이러스에 의한 산화적 스트레스에 근본적 원인을 두고 있음을 예측할 수 있게 한다. 또한, 산화적 스트레스는 세포 주기의 변화를 유도케 하는데, 이 변화를 통해 스트레스로 인한 damage를 완화시키거나, 혹은 세포사멸을 유도케 한다. 실제 산화적 스트레스 하에서 HEK293 세포는 G2/M arrest를 유도하는 것으로 확인되었는데, 이러한 arrest 현상에서 cyclin D1의 양이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 이 같은 감소에는 eIF2 인자의 인산화가 연계되어 있는 것으로 보여지며, 이는 산화적 스트레스가 세포의 단백질 합성을 조절함으로써, 세포주기를 조절한다는 것을 예상케 한다. 이 같은 결과들은, 바이러스를 포함한 여러 스트레스 인자에 의한 세포의 능동적인 반응을 이해하게 함으로서, 바이러스 감염과 확산에 대한 대처 방안을 마련하고, 그 밖의 산화적 스트레스 하 발생되는 의한 암, 노화, 신경퇴화 등과 같은 질환들의 근원적 메커니즘 이해에 기여할 것으로 보인다.

A Study on Homeostatic Maintenance of Retinal Pigment Epithelium against Oxidative Stress with an Emphasis on Roles of Autophagy and Keratin 8

백아름 건국대학교 대학원 2017 국내박사

Cellular homeostasis maintains the intracellular environment against intra-, and/or extracellular stress. Autophagy, which is an important process to maintain the cellular homeostasis, degrades damaged organelles, unnecessary or dysfunctional proteins under cellular stress conditions such as starvation or oxidative damage. Senescence is caused by accumulation of cell damages due to loss of homeostasis under long-term exposure of stressful stimuli. Loss of homeostasis and accumulated cellular damage caused by autophagy disorder are known to lead to age-related disorders, such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Age-related macular degeneration (AMD), which causes the vision loss among people age 50 and older, is a disease that damages the macula in the central portion of the retina. Accumulation of detrimental metabolic products such as intracellular lipofuscin and extracellular drusen is possibly caused by imbalance between production of damaged cellular components and degradation. Early stage of AMD is established by atrophy delineated by retinal pigment epithelium (RPE) thinning or depigmentation that precede geographic atrophy. In advanced stages of AMD, geographic atrophy of RPE and/or development of new blood vessels (choroidal neovascularization, CNV) result in death of photoreceptors and central vision loss; the first is called dry type AMD and the second is called wet type AMD. The wet type AMD is characterized by an abnormal growth of new blood vessels that often causes leakage of blood and fluid. On the other hand, dry type AMD is characterized by accumulation of the extracellular waste products (i.e. drusen) in a layer of the retina. Because main therapeutic target for wet type AMD treatment is a vascular endothelial growth factor (VEGF), anti-VEGF agents have been used as a standard treatment for CNV. However, there is no currently proven effective treatment for dry type AMD, which accounts for nearly 90% of AMD patients. Although extensive research efforts have focused on understanding the basic of dry type AMD, pathogenesis of AMD remains to be elucidated. In this study, I investigated the molecular pathogenesis of AMD through the maintenance of RPE under oxidative stress condition in terms of cellular homeostasis with an emphasis on roles of autophagy and intermediate cytoskeleton, Keratin 8 (KRT8). Keratin 8 has been selected as AMD pathogenesis marker protein from the previous proteomics study based on AMD patients’ aqueous humoral samples. In the first chapter, I investigated roles of autophagy on the cellular homeostasis in RPE under oxidative stress. Human RPE cells undergo mechanistic target of rapamycin (mTOR)-mediated autophagy pathway to protect RPE from apoptotic cell death under reactive oxygen species (ROS) stress conditions. Importantly, RPE cells under ROS stress condition enhances expression of KRT8 along with autophagy induction. Keratin 8 was observed to facilitate autophagosome-lysosome fusion in RPE cells under oxidative stress. In the second chapter, role of KRT8 has been investigated on RPE homeostasis under ROS condition in terms of epithelial-mesenchymal transition (EMT). I found that phosphorylation of KRT8 induces RPE degeneration through pathologic EMT of RPE cells under oxidative stress. KRT8 is perinuclear reorganized through phosphorylation by extracellular signal-regulated kinases (ERK) under oxidative stress condition. Perinuclear reorganization of phosphorylated KRT8 leads to increase of cell migration and induction of EMT. I demonstrated that inhibition of KRT8 phosphorylation and its subsequent perinuclear reorganization by ERK inhibitor, PD98059, suppresses oxidative stress-induced cell degeneration both in vitro and in vivo. In the last chapter, I studied a possible role of KRT8 on mitochondrial homeostasis in RPE under oxidative stress. KRT8 expression facilitates mitochondrial fission and mitophagy in RPE cells under oxidative stress, which leads to suppression of necrotic cell death. I found that mitophagy, a selective degradation process of mitochondria by autophagy, occurs sequentially after mitochondrial fission in RPE cells that express KRT8 under oxidative stress. In contrast, when mitochondrial fission does not occur properly, mitochondria were swollen to large shape (i.e. enlargement) due to accumulation of ROS stress. The cytoprotective effect of KRT8 is supposed to be achieved by mitochondrial fission and mitophagy via facilitation of the interaction between endoplasmic reticulum and mitochondria under oxidative stress condition. Taken together, I studied homeostatic maintenance of RPE against oxidative stress with an emphasis on roles of autophagy and cytoskeletal protein KRT8. Through the doctorate study, I found three important results on molecular pathogenesis of AMD, as followings; 1) Autophagy protects retinal pigment epithelium from apoptotic cell death under oxidative stress, 2) Phosphorylated keratin 8 induces degeneration of retinal pigment epithelium through epithelial-mesenchymal transition, and 3) Keratin 8 suppresses necrotic cell death under oxidative stress through mitophagy. These findings will improve current understanding of the molecular pathology of AMD and suggest a therapeutic strategy for the treatment of AMD by preventing RPE degeneration under oxidative stress. 세포의 항상성은 세포의 내·외부에서 발생하는 스트레스 자극에도 세포 내 환경을 일정하게 유지해준다. 세포의 항상성 유지에 중요한 자가포식작용은 영양결핍 혹은 스트레스 조건에서 손상된 세포 소기관, 혹은 불필요하거나 비정상적인 단백질을 분해하는 역할을 한다. 노화는 계속되는 스트레스 자극에 의해 세포가 항상성을 잃게 되고 이로 인한 세포 손상이 축적되어 나타나게 된다. 알츠하이머 병, 파킨슨 병 등과 같은 대부분의 노인성 질환은 자가포식작용의 이상, 그로인한 항상성 기능 저하 및 세포 손상이 그 원인으로 알려져 있다. 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD)은 50대 이상의 노년층에서 실명을 야기하는 대표적인 노인성 질환으로 망막에 존재하는 황반부에 손상이 일어나면서 나타나게 된다. 세포 내 리포푸신(lipofuscin) 세포 외 드루젠(drusen)과 같은 해로운 세포 대사 산물의 축적은 아마도 손상된 세포 구성 성분의 분해와 생성의 불균형으로부터 기인하는데, 이러한 해로운 세포 대사산물의 축적이 황반변성의 병리기전으로 인식된다. 나이관련 황반변성의 초기단계(건성 황반변성)는 망막 색소 상피층(retinal pigment epithelium, RPE)의 위축과 색소 소실에 의한 위축에 의해 이루어지며, 이는 지도모양위축증(geographic atrophy)으로 발전된다. 나이관련 황반변성의 심화단계인 지도모양위축증과 신생혈관 생성(neovascularization, CNV)은 광수용체 세포의 죽음과 중심시력의 상실을 일으킨다. 습성 황반변성은 비정상적인 혈관 생성과 혈액 누수가 특징적으로 나타나며 건성 황반변성의 경우 세포 대사 찌꺼기인 드루젠이 망막층과 그 아래 존재하는 기저막 사이에 축적되어 나타난다. 습성 황반변성은 직접적인 원인(예, vascular endothelial growth factor, VEGF; 혈관내피세포 성장인자)이 규명되어 있어 이미 많은 치료제도 개발되어 있지만, 환자의 약 90% 비율을 차지하는 건성 황반변성은 확실한 발병기전이 알려져 있지 않으며 치료제 역시 없는 상황이다. 본 연구에서는 황반변성의 분자병리학적인 이해를 위하여 산화스트레스에 대한 망막색소상피세포의 항상성 유지에 관하여 중간 세포골격인 케라틴8과 자가포식작용의 역할을 중점적으로 다루었다. 케라틴8은 나이관련 황반변성 환자로부터 얻어낸 방수(aqueous humor) 시료를 바탕으로 한 이전 단백질체(proteomics) 연구를 통해 나이관련 황반변성의 질병 마커 단백질로 선택되었다. 첫 번째 장에서는, 산화스트레스 하에서 망막색소상피세포의 세포 항상성에 대한 자가포식작용의 역할을 연구했다. 사람의 망막상피세포는 산화스트레스 조건에서 세포 사멸로부터 세포를 보호하기 위해 mTOR (mechanistic target of rapamycin)를 매개로 하는 자가포식작용 경로를 겪는다. 특히, 산화스트레스 하에 망막색소상피세포는 자가포식작용의 유도와 함께 케라틴8의 발현이 증가됨을 관찰하였다. 케라틴8은 산화스트레스 하에서 망막상피세포의 자가포식체와 리소좀의 융합을 촉진하는 것으로 관찰되었다. 두 번째 장에서는 상피-간엽세포화(epithelial-mesenchymal transition, EMT)에 관한 산화스트레스 조건의 망막색소상피세포 항상성에서 케라틴8의 역할에 대해 연구하였다. 케라틴8의 인산화가 산화스트레스 하에서 망막색소상피세포의 병리학적 상피-간엽세포화를 통해 망막상피세포 변성을 유도한다는 것을 발견했다. 산화스트레스 조건 하에서 케라틴8은 세포외 신호조절인산화효소(extracellular signal-regulated kinases, ERK)에 의한 인산화를 통해 핵 주위로 재배열된다. 인산화 된 케라틴8의 재배열은 세포 이동성 증가 및 상피-간엽세포화를 야기한다. ERK 억제제(PD98059)를 이용하여 케라틴8의 인산화와 이에 따른 핵 주변으로의 재배열을 억제하였고, 이는 산화스트레스에 의한 세포 변성을 저해한다는 것을 밝혔다. 마지막 장에서는 산화스트레스 조건 하에 망막색소상피세포의 미토콘드리아 항상성에 대한 케라틴8의 역할과 기능을 연구하였다. 산화스트레스에 노출된 망막색소상피세포에서 케라틴8의 발현은 세포 괴사를 억제하는 미토콘드리아의 분열과 자가포식작용을 활발히 일어나게 한다. 미토콘드리아 선택적 자가포식작용(mitophagy)은 산화스트레스 조건의 케라틴8을 발현하는 망막색소상세포에서 미토콘드리아의 분열이 진행되고 난 후 순차적으로 일어나게 된다. 그러나 미토콘드리아의 분열이 잘 이루어지지 못하면 미토콘드리아 내 손상이 축적되어 부풀어오른 형태로 변화하게 된다. 케라틴8의 세포보호효과는 소포체와 미토콘드리아 간의 상호작용 조절을 증가시켜 미토콘드리아의 분열 및 자가포식작용을 도와 나타나는 것으로 보여진다. 정리하자면, 본 연구는 산화스트레스에 대한 망막색소상피세포의 항상성 유지를 자가포식작용과 세포골격 단백질인 케라틴8의 역할을 중점적으로 다루어 그 분자기전을 규명한 것이다. 특히, 나이관련 황반변성의 분자생물학적 발병기전에 관한 세 가지 중요한 결과를 발견했다. 1) 자가포식작용은 산화스트레스 하에서 망막색소상피세포를 세포 사멸로부터 보호한다; 2) 인산화된 케라틴8은 상피-간엽세포화를 통해 망막색소상피세포의 변성을 유도한다; 3) 케라틴8은 미토콘드리아 선택적 자가포식작용을 통해 산화스트레스에 의한 세포괴사를 억제한다. 이러한 연구 결과는 나이관련 황반변성의 분자병리학적 이해를 향상시킬 것이며, 산화스트레스에 의한 망막색소상피세포의 변성을 억제하여 황반변성에 대한 치료전략을 제안할 것이다.

Quorum sensing and oxidative stress responses in Pseudomonas putida and Acinetobacter oleivorans

김지선 Graduate School, Korea University 2015 국내박사

이 논문의 주 목적은 토양 세균인 슈도모나스 푸티다와 아시네토박터 올레이보란스의 쿼럼 센싱 및 산화적 스트레스 반응을 이해하는 것이다. 따라서 이 연구에서는 쿼럼 센싱과 산화적 스트레스를 조절하는 조절자를 찾고, 이들의 조절 관계를 밝히는 것을 목표로 한다. 이를 위하여 비교 전사체 및 단백질체 분석이 수행되었고, 다양한 분자 생물학적 방법을 통하여 연구를 수행하였다. 쿼럼 센싱은 세균의 밀도를 감지하여 유전자의 발현을 조절하는 기작이다. 완전한 쿼럼 센싱 시스템은 전사 조절자 (LuxR homologue)와 acyl-homoserine lactone (AHL) synthase (LuxI homologue)로 구성되어 있다. 슈도모나스 푸티다는 orphan LuxR인 PpoR을 보유하고 있으며, luxI 관련 유전자는 유전체 내에 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 이전 연구에서 AHL을 형성할 수 있도록 플라스미드를 도입한 슈도모나스 푸디다 KT2440 세균은 성장 증가, 항생제 저항성 및 바이오 필름 형성의 증가를 보였다. 아시네토박터 올레이보란스 DR1은 LuxI-type AHL synthase와 LuxR-type 조절자인 AqsI와 AqsR를 보유하고 있다. 이 연구에서는 쿼럼 센싱 전사 조절자인 AqsR의 조절을 받는 유전자를 찾고자 하였다. RNA 시퀀싱을 통한 전사체 분석을 통해 aqsR 돌연변이 균주에서 수많은 유전자의 발현이 차이가 나는 것이 확인 되었으며, aqsR 돌연변이 균주에서 헥사데케인 분해 및 바이오 필름 형성 저하, cumene hydroperoxide에 대한 민감성 증가를 보임에 따라서 AqsR이 아시네토박터 올레이보란스의 중요 전사 조절자임을 밝혔다. 전사체 분석에서 야생형 균주에서 발현이 증가된 유전자 중에서 AOLE_03905 (putative surface adhesion protein) 와 AOLE_11355 (L-asparaginase)의 프로모터 부분에 LuxR 결합 위치가 존재하였다. AqsR이 두 유전자의 프로모터 결합함을 Electrophoretic mobility shift assays (EMSA)로 확인하였다. Indole은 세균 군집 내 바이오 필름 형성, 항생제 저항성, 병원성과 같은 다양한 영향을 미치므로 중요한 물질로 주목 받고 있다. 슈도모나스 푸티다와 아시네토박터 올레이보란스에 indole을 처리하였을 때 에너지 형성과 샤페론과 관련된 유전자들이 많이 발현 되었다. Indole은 세포막 교란과 TCA 회로를 구성하는 유전자의 발현을 높게 함으로써 세포 내 NADH/NAD+ ratio 와 adenosine triphosphate (ATP)의 농도를 증가시킨다. 또한 indole이 단백질 접힘을 방해한다는 연구 결과를 in vitro 단백질 재접힘 (protein-refolding) 실험을 통하여 증명하였다. 쿼럼 센싱에 조절 받는 표현형은 indole에 의하여 저해를 받기 때문에 aqsR 돌연변이 균주와 야생형 균주에 indole이 처리된 효과는 유사한 표현형을 보였다. Indole 처리시 AqsR에 조절받는 유전자의 발현이 감소하였다. AqsR 과발현 균주에 indole을 처리하여 AqsR을 과발현 시키는 것은 불가능 하였다. Indole이 AqsR 단백질의 안정성과 접힘을 저하시킨다는 결과를 [35S]-methionine pulse-labelling 실험을 통하여 얻었으며, 놀랍게도 이러한 결과는 aqsR mRNA 발현 수준은 변화시키지 않고, protein 수준에서 indole이 영향을 미침을 확인하였다. 따라서 이러한 결과들로부터 indole이 쿼럼 센싱 표현형에 영향을 미치는 원인이 에너지 생성의 감소와 쿼럼 센싱 조절자의 접힘을 방해하는 것에 있음을 밝혔다. 세포 내 혹은 외부로부터의 oxidant에 노출된 세균은 이를 감지하고 제거하는 시스템을 갖고 있다. 이 논문에는 슈도모나스 푸티다와 아시네토박터 올레이보란스에서의 산화적 스트레스 반응에 대한 연구 결과와 최근 연구 동향을 정리하여 요약하였다. 디젤 분해능을 갖는 아시네토박터 올레이보란스 DR1은 redox-sensitive 전사 조절자인 SoxR (AOLE_12135)와 OxyR (AOLE_14380)을 갖는다. 이차원 젤 전기영동으로 단백질 발현의 차이를 관찰했을 때, 13개의 단백질이 hydrogen peroxide 처리 시 발현이 증가하였다. 이들 중에서 ahpC, ahpF, trxB (thioredoxin-disulfide reductase), oprC (outer membrane receptor protein)가 OxyR 결합 위치가 프로모터 부분에 존재하며, putative catalase gene (AOLE_09800)와 함께 총 5개의 유전자의 프로모터에 OxyR이 결합하는 것으로 확인되었다. qRT-PCR을 통하여 5개 유전자는 OxyR-dependent로 발현이 조절되는 것을 확인하였다. Putative catalase와 oprC 유전자는 이번 연구를 통하여 새롭게 OxyR의 조절을 받는 것으로 밝혀졌다. Redox-cycling drugs 존재 시 SoxR이 AOLE_16635 (putative endoribonuclase)의 프로모터에 결합하여 유전자를 전사 수준에서 조절함을 EMSA와 qRT-PCR을 통하여 확인하였다. 흥미롭게도 redox-cycling drugs를 처리하여 AOLE_16635를 과발현 시키면 단백질 합성이 저해되는 것을 [35S]-methionine incorporation 방법으로 확인하였고, 성장 저해도 관찰되었다. AOLE_16635의 발현이 cspE mRNA의 안정성에 영향을 주고, RNA 샤페론으로 작용하는 cspE의 transcript와 같이 몇몇의 transcript의 번역 효율을 낮춰 결과적으로 단백질 합성과 성장 저해를 가져옴을 확인하였다. 유전자 발현 분석, 단백질 합성 비교, 성장 비교 실험을 통하여 다양한 redox-cycling drugs 존재 시 아시네토박터 올레이보란스 DR1의 SoxR은 활성화되어 번역을 방해하여 스트레스 반응을 조절함을 증명하였다. 이 논문은 세균의 쿼럼 센싱과 산화적 스트레스 반응에 중요한 역할을 하는 유전적 요인과 이들의 전사적 수준에서의 조절을 제시하고 있다. 이러한 조절 관계를 실험실 수준에서 연구하였다. 이 연구는 복잡한 토양 환경에서의 세균의 조절 시스템을 이해하는 데에 중요한 기여를 할 것으로 사료된다. The main purpose of this dissertation is to understand quorum sensing and oxidative stress responses in soil bacteria, Pseudomonas putida and Acinetobacter oleivorans. For this purpose, characterization of quorum sensing and oxidative stress response regulators became the object of this research and their regulation systems were identified. To achieve this goal, comparative transcriptomic and proteomic analysis was conducted on both strains along with various molecular biology approaches corroborating the results. The bacterial quorum sensing (QS) is a mechanism for coordinating gene expression in response to cell density, and then adjusting the expression of those genes. P. putida has LuxR-family protein (PpoR) but does not harbor the luxI-like gene. Previous studies demonstrated that an artificial AHL-producing plasmid introduced P. putida KT2440 showed enhanced growth, antibiotic resistance, and biofilm formation ability. A. oleivorans DR1 has a QS system consisting of a LuxI-type AHL synthase protein and a LuxR-type regulator, designated AqsI and AqsR, respectively. The goal of this study was to identify the target genes regulated by AqsR. AqsR appears to be an exceptionally important regulator, because knockout of aqsR affected global gene expression though transcriptional profiling using RNA sequencing analysis and AqsR is associated with several phenotypes, such as hexadecane utilization, biofilm formation, and sensitivity to cumene hydroperoxide. Among up-regulated genes in wild type cells, both the AOLE_03905 (putative surface adhesion protein) and the AOLE_11355 (L-asparaginase) genes have putative LuxR binding sites at their promoter regions. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) with purified AqsR revealed direct binding of AqsR to those promoter regions. Indole has received great attention because of its extensive effects on various biological functions in the bacterial population. Many genes involved in energy generation and chaperones are highly expressed under indole treatment in both P. putida and A.oleivorans. Indole increases the NADH/NAD+ ratio and decreases the adenosine triphosphate (ATP) concentration inside cells, due to membrane perturbation and higher expression of TCA cycle genes. Interestingly, in vitro protein-refolding assay demonstrated that indole interferes with protein folding. QS-controlled phenotypes appeared to be inhibited by indole and the aqsR mutant had the same phenotypes. Indole decreased the expression of two AqsR-targeted genes. The overexpression of AqsR in Escherichia coli was impossible with the indole treatment. Surprisingly, [35S]-methionine pulse-labelling assay demonstrated that the stability and folding of AqsR protein decreased under indole without changing aqsR mRNA expression in E. coli. Here, results showing that the indole effect on QS-controlled bacterial phenotypes is due to reduction of energy generation and inhibited QS regulator folding. Bacterial cells exposed to endogenous or exogenous sources of oxidants have systems for detecting and removing them. The current knowledge of oxidative stress response in P. putida and A. oleivorans together with recent studies from molecular genetics perspectives are summarized in this paper. The A. oleivorans DR1 contains a putative redox-sensitive transcription factor SoxR homologue (AOLE_12135) and OxyR homologue (AOLE_14380). Two-dimensional gel electrophoresis was conducted to investigate the effect of hydrogen peroxide on whole protein expression. Among 13 up-regulated proteins, OxyR binding was confirmed at the promoter regions of ahpC, ahpF, trxB (thioredoxin-disulfide reductase), and oprC (outer membrane receptor protein), along with a putative catalase gene (AOLE_09800). Quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) analysis of these genes was performed in the wild type and the oxyR mutant to identify the role of OxyR at the transcriptional level. The putative catalase and oprC genes discovered in this study represent newly identified OxyR-controlled genes. EMSA and qRT-PCR analysis indicated that SoxR binds to the promoter of AOLE_16635 (putative endoribonuclease) and regulates that gene in the presence of redox-cycling drugs. Interestingly, overexpression of AOLE_16635 in A. oleivorans DR1 reduced protein synthesis as assessed by incorporation of [35S]-methionine and growth inhibition appeared upon the addition of redox chemicals. AOLE_16635 might reduce the stability of cspE mRNA and consequentially, it was able to cause growth defect and inhibition of protein synthesis due to low translation efficiency of several mRNA transcripts. Gene expression analysis, in vivo protein synthesis assay and growth test showed that SoxR from A. oleivorans DR1 can activate and regulate bacterial stress response through inhibition of translation in the presence of various redox-cycling drugs. Here, this study suggested that identifying genetic component and its transcriptional regulation are important to understand bacterial quorum sensing and oxidative stress responses. Various genetic factors-related quorum sensing and oxidative stress responses have been investigated in laboratory scales. This will provide a crucial clue to understand bacterial regulation systems in complicated soil environments.

Molecular characterization of oxidative stress responses in pseudomonas species

염진기 Graduate School, Korea University 2011 국내박사

이 논문의 주 목적은 토양 모델 세균인 슈도모나스 푸티다와 인체병원균인 슈도모나스 아루지노사 균의 산화적 스트레스 반응에 대한 기초적인 정보를 제공하는 데에 있다. 두 세균의 산화적 스트레스 반응에 대해서 알아보기 위해서 두 세균을 다양한 분자 생물학적 방법을 이용해서 탐구하였다. 슈도모나스 푸티다의 유전체에서 삼가철 환원효소는 밝혀져 있지 않았기 때문에 삼가철 환원효소에 대한 연구를 수행하였다. 슈도모나스 푸티다는 두 종류의 페레독신 환원효소 (FprA, FprB) 를 보유하고 있으며, 그들의 기능에 관해서는 지금까지 구체적으로 밝혀지지 않았다. 삼가철 환원효소는 구조적으로 페레독신 환원효소와 같은 범주에 속해 있다고 알려져 있다. 그래서 우리는 페레독신 환원효소들을 삼가철 환원효소로써의 기능을 알아보기 위해 슈도모나스 푸티다 야생종 균주와 돌연변이 균주를 이용해서 다양한 분자 생물학적 특징과 생리적인 특징에 대해 탐구하였다. 이를 위해서 가장 먼저, 삼가철 환원 효소 분석과 플라빈 환원 효소 분석을 시행하였으며, FprA 와 FprB 는 전자공여체로써 NADHP 와 NADH 를 선호하고 있다는 것을 알게 되었다. 또한 두 종류의 효소는 자연유래 삼가철 킬레이터 와 합성 삼가철 킬레이터 모두 전자를 전달할 수 있으며, 이를 위해서 FMN 을 전자 매개체로 이용한다는 것을 알 수 있었다. 특별히FprB 는 더 높은 효소 활성을 나타내었다. fprB 유전자 돌연변이 균주는 최소배지에 철을 첨가할 경우에 생장효율이 fprA 유전자 돌연변이 균주와 야생종 균주보다 낮다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 fprB 돌연변이 균주의 경우에 플라빈 환원 능력도 다른 두 균주와 달리 완전히 사라진다는 것을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도 FprB 의 NAD(P) 결합 위치의 구조가 대장균의 삼가철 환원효소와 닮았다는 것을 확인할 수 있었다. 이 연구는 최초로 슈도모나스 푸티다 내에서 플라빈 과 삼가철 환원효소의 기능에 대해서 밝힌 연구 결과이다. 또한 이 연구결과를 통해 FprB 가 NADH 를 이용해서 철 스트레스 상태에서 삼가철과 플라빈을 환원하는 중요한 효소로 작용한다는 것을 알 수 있었다. 슈도모나스 속 세균들의 항생제와 철 간의 관계를 이해가 위해서 두 종류의 슈도모나스 속 세균들을 항생제 처리 조건에서 어떤 반응을 하는 가에 대해서 다양한 연구기법을 통해서 알아보았다. 항생제는 기존에 자신들의 고유한 특징을 이용해서 세균들을 죽이는 것으로 알려져 있었으며, 이런 특징으로는 전사 억제, 리보좀 기능 억제, 세균 세포벽 생성 억제 등이 있다. 이 연구의 결과들은 항생제를 처리한 조건에서 철의 이용능력은 매우 중요하며, 특별히 슈도모나스 푸티다 와 슈도모나스 아루지노사 미생물에서 삼가철 환원효소는 펜턴 반응에 의해서 항생제 유도 세포 사멸을 가중시킬 수 있다는 것을 알 게 되었다. 또한 환원된 NADH 양의 조절과 철 킬레이션의 조절은 항생제의 활동에 직접적으로 영향을 미친다는 것을 알 게 되었다. 흥미롭게도 삼가철 환원효소의 돌연변이 균주는 항생제 저항성이 향상된다는 것을 확인할 수 있었고, 삼가철 환원효소를 과발현 시킬 경우에는 오히려 항생제에 의한 세포 사멸이 가중된다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 전사체 분석 결과들은 두 종류의 슈도모나스 균주에서 항생제를 처리한 조건에서 산화적 스트레스가 유발된다는 것을 확인해 주었고, 이는 삼가철 환원효소가 없는 돌연변이 균주에서는 산화적 스트레스가 발생하지 않는 것을 확인하였다. 따라서 항생제를 처리한 조건에서 세균은 철 이온의 항상성을 유지하는 것이 매우 중요하다는 것을 알 수 있었으며, 이는 항생제의 기능을 향상 시키기 위해서 철을 이용하는 것이 매우 중요한 적용점이 될 수 있다는 것을 말해주는 결과이다. 토양환경 내에서 많은 세균들은 질소의 부족 현상을 겪게 된다. 이런 환경은 질소의 불균형이 산화적 스트레스의 방어의 문제와 같은 심각한 현상을 일으키기 때문에 세균의 질소와 탄소간의 균형을 매우 중요하다. 글루코스-6-포스페이트 탈수고효소 (Zwf) 는 질소가 제한된 조건에서 NtrC 조절단백질에 의해서 유전자 발현이 억제되고 있다. 흥미롭게도 ntrC 유전자의 돌연변이 균주는 생장속도는 느리지만, 슈도모나스 푸티다에서 질소가 부족한 조건에서 세균이 산화적 스트레스에 견디는 능력은 향상된다는 것을 알 수 있다. 이런 현상은 또한 유동세포분석기를 이용해서 다양한 형광 산화적 스트레스 감지 염색약을 사용해서 확인하였다. 또한 전사체 분석 결과 zwf 와 같이 ntrC 돌연변이 균주에서 몇몇의 유전자들이 산화적 스트레스의 방어에 도움을 줄 수 있다는 것을 알게 되었다. 따라서, 질소의 조건에 따라서 산화적 스트레에 관여하는 많은 유전자들이 있다는 것과 NtrC 에 의해서 감지되는 질소의 이용여부는 슈도모나스 푸티다 균주 세포의 생존에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 알게 되었다. 이 논문은 실험실 수준에서 산화적 스트레스에 관여하는 많은 유전적, 생리적 특징에 관해서 연구한 논문이다. 더욱이 이를 통해 알게된 산화적 스트레스 반응에 관한 정보는 생물분해자인 슈도모나스 푸티다 균주의 분해 최적화와 인체 병원균인 슈도모나스 아루지노사 균주의 제어에 매우 중요한 기여를 할 것으로 사료된다. The main purpose of this dissertation is to provide the basic information for oxidative stress response using soil bacterium, Pseudomonas putida KT2440 and human pathogenic bacterium, Pseudomonas aeruginosa PA01. To identify oxidative stress response in both strains, studies on both strains using various molecular methods were evaluated. The ferric reductase research was conducted, because ferric reductase is not annotated on the chromosome of P. putida. P. putida harbors two Ferredoxin-NADP+ reductases (Fpr) on its chromosome, and their functions remain largely unknown. Ferric reductase is structurally contained within the Fpr superfamily. In an effort to elucidate the function of the Fpr as a ferric reductase, we employed a variety of biochemical and physiological methods using the wild-type and the fprB gene mutant strains. In both the ferric reductase and flavin reductase assays, FprA and FprB preferentially used NADPH and NADH as electron donors, respectively. Two Fprs prefer a native ferric chelator to a synthetic ferric chelator and utilize free FMN as an electron carrier. FprB has a higher kcat/Km value for reducing the ferric complex with free FMN. The growth rate of the fprB mutant was reduced more profoundly than that of the fprA mutant, the growth rate of which is also lower than the wild-type in ferric iron-containing minimal media. Flavin reductase activity was diminished completely when the cell extracts of the fprB mutant plus NADH were utilized, but not the fprA mutant with NADPH. Interestingly, the structure of the NAD(P) region of FprB resembled the ferric reductase (Fre) of E. coli in the homology modeling. This study demonstrates, for the first time, the functions of Fprs in P. putida as flavin and ferric reductases. Furthermore, our results indicated that FprB may perform a crucial role as a NADH-dependent ferric/flavin reductase under iron stress conditions. To understanding about relationship between antibiotics and iron in Pseudomonas species, both Pseuomonas strains were tested with various experimental methods in antibiotic-treated condition. Antibiotics can induce cell death via a variety of action modes, including the inhibition of transcription, ribosomal function, and cell wall biosynthesis. In this study, results demonstrated directly that iron availability is important to the action of antibiotics and the ferric reductases of P. putida and P. aeruginosa could accelerate antibiotic-mediated cell death by promoting the Fenton reaction. The modulation of reduced nicotinamide-adenine dinucleotide (NADH) levels and iron chelation affected the actions of antibiotics. Interestingly, the deletion of the ferric reductase gene confers more antibiotic resistance upon cells, and its overexpression accelerates antibiotic-mediated cell death. The results of transcriptome analysis showed that both Pseudomonas species induce many oxidative stress genes under antibiotic conditions, which could not be observed in ferric reductase mutants. These results indicate that iron homeostasis is crucial for bacterial cell survival under antibiotics, and should constitute a significant target for boosting the action of antibiotics. In soil condition, many bacteria suffer nitrogen starvation. This situation makes significance of balance between nitrogen and carbon, because unbalance of nitrogen in cell generates problems about malfunction of defense of oxidative stress. The zwf, which encodes glucose-6-phosphate dehydrogenase, is repressed by NtrC under nitrogen-limited condition. Interestingly, deletion of the ntrC gene significantly reduces growth rate, but renders cells more resistant to oxidative stress, under nitrogen limited condition in P. putida. More vitality of the ntrC mutant under oxidative stress condition was also confirmed by the fluorogenic redox dye using flow cytometry. The results of transcriptome analysis demonstrated that the derepression of several oxidative stress genes along with the zwf-1 gene might confer high resistance to oxidative stress in the ntrC mutant. Here, we presented the data for the first time, showing that different sets of genes are involved in nitrogen-rich and nitrogen-limited oxidative stress conditions and NtrC-sensed nitrogen availability is one of the most important prerequisite for full cellular defense against oxidative stress in P. putida. Here, I have investigated various genetic and physical factors-related oxidative stresses in laboratory scales. Furthermore, this information along with understanding about influence of oxidative stress response by each factors will provide clues on the optimal conditions for successful either inhibitory of P. aeruginosa or biodegradation of P. putida.

머위의 항산화 및 신경세포 보호를 통한 인지능력 개선 효과

김지현 부산대학교 대학원 2016 국내석사

The present study was performed to confirm protective effects against oxidative stress and Alzheimer's disease (AD) of Petasites japonicus and its active compounds. The protective activity from oxidative stress was evaluated under in vitro, cellular model of neuronal oxidative stress and Aβ-injected AD in vivo model. The polyphenol and flavonoid contents of methanol extract and 4 fractions [butanol, ethylacetate (EtOAc), methylene chloride and hexane] from P. japonicus were measured. As a result, the EtOAc fraction was found to contain the highest polyphenol and flavonoid contents. Also, the EtOAc fraction showed the strongest scavenging activity against superoxide radical (O2-), indicating that EtOAc fraction mainly attributed to the antioxidative effect of P. japonicus. In addition, the protective activity from oxidative stress of P. japonicus were investigated under cellular system using LLC-PK1 cell. The EtOAc fraction from P. japonicus dose-dependently increased the protein expression of heme oxygenase-1 (HO-1) and thioredoxin reductase 1 (TrxR1) known to be involved in antioxidant effect, through activation of NF-E2-related factor 2 (Nrf-2). These results indicated that the EtOAc faction of P. japonicus showed higher antioxidant activity through regulation of Nrf-2 pathway. Moreover, O2-, nitric oxide (NO) and peroxynitrite (ONOO-) by sodium nitroprusside (SNP), pyrogallol, and 2-morpholinosydnonimine (SIN-1) led to the decline in cell viability by oxidative stress, while the treatment of EtOAc fraction increased cell viability. Furthermore, active compounds were isolated and identified from EtOAc fractions, kaempferol, kaempferol-3-O-glucoside, quercetin (Q) and quercetin-3-β-D-glucoside (Q3G). Protective effects against hydrogen peroxide (H2O2) and amyloid beta25-35 (Aβ25-35) of active compounds were investigated using neuronal cells (C6 glial and SH-SY5Y cells). Treatment of active compounds showed the protective role of neuronal cell by increase of cell viability and decrease of reactive oxygen species (ROS) production. To study the mechanism of protective effects of active compounds, the protein expression related to inflammation and apoptosis under oxidative stress was investigated. The results showed that C6 glial cell under oxidative stress increased the expressions of protein related to inflammation. However, the treatment of active compounds led to reduction of protein expression related to inflammation such as inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), interleukin-1β (IL-1β). Also, the SH-SY5Y neuronal cell under oxidative stress increased the expressions of protein related to apoptosis, but the treatment of active compounds led to down-regulation of protein expression of cleaved caspase-3, -9 and Bax. In paricular, treatment of Q and Q3G showed the highest protective effect against oxidative stress. In the present study, I investigated the protective effects of Q and Q3G under Aβ25-35-injected ICR mouse. To develop an AD in vivo model, mice were received intracerebroventricular (i.c.v.) injection of Aβ25-35. Q and Q3G were administered orally for 2 weeks at dose 30 mg/kg/day. Learning and memory functions were evaluated using behavioral experiments including T-maze, novel object cognition and Morris water maze test. The administration of Q and Q3G improved memory and cognitive function, compared with Aβ25-35-injected control mice under T-maze and object recognition test. In Morris water maze test, Q and Q3G decreased time to reach platform, especially the group administered Q showed the higher protective effect from impairment of long-term spatial memory and learning ability than the group administered Q3G. Furthermore, lipid peroxidation and NO formation in brain were significantly elevated in the Aβ25-35-injected control mice. However, the administration of Q and Q3G inhibited the lipid peroxidation and NO production. In addition, administration of Q and Q3G inhibited acetylcholineesterase (AchE) activity in brain compared with Aβ25-35-injected control mice. To study the protective mechanisms of Q and Q3G from AD, the inflammation and apoptosis-related gene expression was investigated. The Aβ25-35-injected mice exhibited the up-regulation of AD-related expression such as amyloid precursor protein (APP), β-site APP cleaving enzyme (β-secretase; BACE) and phospho-tau, while Q and Q3G treatment reduced the expression. Also, Aβ25-35-injected mice increased inflammation-related protein and mRNA expression such as nuclear factor κB (NF-κB), iNOS, COX-2 and IL-1β levels in the brain, however, Q and Q3G treatment decreased the expression of inflammatory cytokines. In addition, treatment of Q and Q3G induced expression of protein related to apoptosis such as cleaved caspase-3, -9 and DR-4. Therefore, these results demonstrate that Q and Q3G improved Aβ25-35-induced memory deficit and cognition impairment in mice and protected against oxidative stress by regulation of protein expression such as AD-related, inflammation and apoptosis in brain. In conclusions the present results indicated that P. japonicus and its active compounds would have protective effects against oxidative stress and AD induced by neurodegeneration.

Effects of persistent organic pollutants and fe(III)-doped nanoparticle on oxidative stress and mitochondrial dysfunction

이송희 전남대학교 2021 국내석사

산업이 발달하고 인류에 의한 다양한 화학물질이 배출됨에 따라, 생성되는 오염물질이 증가하고 있다. 이들의 위험성을 관리하기 위한 독성평가는 다양한 동물 모델을 이용하여 이루어지고 있는 추세이다. 생체 내 중요한 독성 기전 중 하나는 산화적 스트레스이다. 본 연구에서는 독성 물질의 모델 시스템 내 축적으로 인해 야기되는 산화적 스트레스의 변화에 대해 초점을 두어 실험을 진행하였다. 각 처리 물질에 따라 산화적 스트레스를 유발하는 ROS/RNS의 양을 측정하고 항산화 기작을 구성하는 요소의 양이나 활성도를 측정하였다. 또한, 주요 ROS를 생산하는 세포 소기관인 미토콘드리아 전자전달계의 활성도를 측정하여 산화적 스트레스의 전반적 기작을 보고자 하였다. 첫 번째로, 대사적 질환을 야기한다고 알려진 POPs의 산화적 스트레스 유발 기작을 알아보기 위해 낮은 농도의 POPs를 지브라피쉬에 농도별로 처리하였다. 사용한 POPs는 OCPs와 PCBs로, 잔류성으로 인해 생체 내에 축적될 수 있는 생산 금지 물질이다. POPs는 생태계에 혼합물 형태로 존재하기 때문에 단독 처리 시와 혼합된 상태의 차이를 관찰하기 위해 대조군, OCPs 처리 그룹, OCPs+PCBs 처리 그룹으로 구분하였다. 실험 결과, OCPs 처리 그룹과 OCPs+PCBs 처리 그룹은 다른 반응을 나타냈으며, 혼합형태의 POPs 노출에서 독성이 더욱 악화됨이 관찰되었다. 이 밖에도 암컷과 수컷의 차이가 확인되었다. 수컷은 POPs 처리에 의해 유도된 산화적 스트레스 관련 마커에 민감하게 반응하였으며 암컷의 경우 이와 상반되게 미토콘드리아 관련 마커에서 수컷에 비해 비교적 취약함이 확인되었다. 본 연구결과는 환경독성물질인 POPs 노출에 의해 산화환원 불균형과 미토콘드리아 고장의 기저기작을 설명하는 실험적 증거를 제시하였으며 환경 독성 물질로서 POPs가 대사적 질환을 발생하는 기작을 밝히는데 도움이 될 것이다. 두 번째로, 환경에 위험성을 지닐 것이라고 예상되어지는 산화철 흡착제의 환경 평가를 산화적 스트레스 관점에서 진행하였다. 흡착제 제작에 사용된 Fe3O4 나노파티클은 수질정화와 토양정화에 흡착제로 사용하는 입자이다. 본 실험을 위해 Fe3O4 나노파티클을 활성탄과 함께 복합흡착제 형태로 제작하였다. 산화철 흡착제의 잠재적 위험성을 평가하기 위해 독성에 민감하다고 알려진 물벼룩에 다양한 농도로 노출시켰다. 실험 결과, 흡착제의 처리에 따라 항산화 기작이 매우 유의하게 저해됨이 관찰되었으며 이는 증가한 ROS/RNS 수준을 야기하였다. 증가한 ROS/RNS는 RS를 생성하는 주요 소기관인 미토콘드리아 복합체 III를 저해하여 결국 대조군보다 낮은 RS 생성량을 초래하였다. 활성종 자체는 생체 내 다양한 역할의 시그널을 담당하기 때문에 대조군보다 낮은 RS 생성 결과는 많은 생체 질병을 야기할 수 있다. 본 연구의 결과는 금속 기반 흡착제의 누출 가능성과 관련된 위험성을 증명한 것에 의의가 있다. As the industry develops and anthropogenic chemicals are generated, the released environmental pollutants increase. One of the most important toxic mechanisms is the production of oxidative stress caused by reactive species. To identify the effects of toxic substances on the mechanism of the antioxidant defense system, the amounts of ROS/RNS, and non-enzymatic antioxidant (GSH) and enzymatic antioxidant (SOD) were measured along with evaluating mitochondrial function. Firstly, low concentrations of persistent organic pollutants (POPs) were treated in zebrafish to identify the oxidative stress-induced mechanism of POPs that known to cause metabolic diseases. We used organochlorine pesticides (OCPs) and polychlorinated biphenyls (PCBs) which are prohibited these days but are accumulated in vivo. We divided into solitary OCPs treatment groups and OCPs+PCBs treatment groups to observe the synergic effects in mixed states. Results have shown that the OCPs treatment group and the OCPs+PCBs treatment group have different responses, and the toxicity was worse in mixture POPs exposure. In addition, a difference between sex was observed. Males were sensitive to oxidative stress-related markers, and in contrast, females were more vulnerable to mitochondrial markers induced by POPs treatment. These findings provide experimental evidence and basal mechanisms explaining metabolic disease caused by POPs exposure. Secondly, environmental assessment of Fe(III)-doped nanoparticle, which is expected to pose a risk to the environment, was conducted in terms of oxidative stress. Fe3O4 nanoparticle is iron oxide particles used as a sorbent for water and soil purification. To assess the potential risk of iron oxide nanoparticle, D. magna were exposed to various concentrations of nanoparticle solutions. As a result, antioxidant mechanisms are significantly inhibited by the treatment of sorbent, resulting in increased ROS/RNS levels. The increased ROS/RNS inhibited mitochondrial complex III, the main producer of ROS, resulting in lower ROS production than the control group. It can be predicted that ROS, which is reduced compared to controls, interfered with the signaling role of free radicals and caused malfunctioning diseases related to the dramatic change of the redox environment. The results of this work demonstrate the risk associated with the potential release of nanoparticle used for contaminant removal.

Studies on the IDH- and TRAP1-mediated cell protection against oxidative stress in Parkinson’s disease

양진성 서울대학교 대학원 2017 국내박사

Parkinson’s disease (PD) is the second most prevalent neurodegenerative disease with dopaminergic (DA) neuronal degeneration in the substantia nigra pars compacta (SNpc). Environmental causative factors and genetic causative factors induce the pathogenesis of PD, and their interaction leads to mitochondrial dysfunction, thereby degenerating DA neurons. Oxidative stress among environmental causative factors, and DJ-1 and PINK1 mutations among genetic causative factors have been extensively studied. They induce PD-related phenotypes like mitochondrial defects, reduced climbing ability in Drosophila, and DA neuronal degeneration. However, more research is still needed to precisely understand the molecular mechanism of PD and to prevent DA neuronal degeneration. Firstly, to investigate the pathogenesis of PD induced by oxidative stress, IDH was found as a key player for the PD phenotypes in DJ-1ß mutant flies under oxidative stress. IDH mutant flies showed DA neuronal degeneration and climbing defects in an age-dependent manner. The PD-related phenotypes of DJ-1ß null flies under oxidative stress were rescued by IDH overexpression. Moreover, in mammalian DA neuronal cells, various defects induced by oxidative stress were restored by IDH overexpression or treatment of a permeable substrate of IDH, trimethyl isocitrate (TIC). In conclusion, IDH, the downstream molecule of DJ-1, and its substrate, TIC, protect DA neurons from oxidative stress. Secondly, I found TRAP1 associated with PINK1, a PD-causative gene. TRAP1 loss-of-function mutants showed resistance against oxidative stress. In addition, the phenotypes caused by PINK1 mutation under oxidative stress were restored by TRAP1 mutation. Furthermore, treatment of G-TPP, a TRAP1 inhibitor, made flies resistant to oxidative stress and recovered the phenotypes of PINK1 mutation. Lastly, I demonstrated that FOXO mediated the TRAP1-induced cell-protective signal from mitochondria. In summary, I have identified IDH and TRAP1 associated with PD-causative genes DJ-1 and PINK1, respectively, and suggested their molecular mechanisms of regulation. Moreover, I proposed TIC and G-TPP as potential treatments for DJ-1 and PINK1, respectively, mutation-induced diseases including PD. Therefore, my thesis studies suggest novel molecular mechanisms of the pathogenesis of PD and its treatment.

Effects of H2-Rich Water Consumption on Oxidative Stress, PBMC Profiles and Their Transcriptome: A Randomized, Double-blind, Controlled Study

심민주 서울대학교 대학원 2018 국내석사

Oxidative stress indicates a state where excessive oxidants overwhelm the biological antioxidant system, leading to various pathological conditions such as chronic inflammation and cellular dysfunctions. Recently, molecular H2 has been proposed as a novel antioxidant, and its therapeutic effects against various diseases were demonstrated with animal models and clinical trials. However, the antioxidant effect of the H2 administration has not been examined in the healthy subjects, and its systemic effect has not been elucidated. Here, we aimed to investigate the effects of H2-rich water (HW) consumption in healthy adults through the extensive analysis of antioxidant capacity, immune cell profiles, and transcriptome of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and to compare the effects of HW consumption with those of plain water (PW) consumption in resting state and exercise-induced oxidative stress state. A total of 38 participants (20-59 y) completed a double-blind, randomized, controlled intervention trial. They consumed either 1.5 L/d of PW (n = 18) or HW (n = 20) for 4 weeks. When the participants were at rest, we measured biological antioxidant potential (BAP), derivatives of reactive oxygen metabolites (d-ROMs), and 8-Oxo-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) in serum, and also analyzed the apoptosis and subpopulations of PBMCs. At week 4, we conducted the treadmill test to induce acute oxidative stress, and analyzed the level of oxidative stress, peripheral immune cell subpopulations and PBMC transcriptome. In resting state, BAP increased to a greater extent in HW group (n = 10) than in PW group (n = 8) in those who aged ≥30 y (P = 0.028), with no difference between groups in <30 y (P = 0.534). Also, HW group (n = 18) showed a lower percentage of PBMC apoptosis than PW group (n = 18) (P = 0.042) and HW consumption decreased the frequency of CD14 positive PBMCs (P = 0.042). In the exercise-induced oxidative stress state, HW group (n = 18-20) did not significantly differ from PW group (n = 18) in the serum biomarkers of BAP, d-ROMs, and 8-OHdG and in the frequencies of PBMC subpopulations (All P > 0.05). Transcriptome profiling of PBMCs, however, revealed a clearly classified transcriptional response of HW group. Particularly, HW consumption most influenced on the genes belonging to the functional category of inflammatory response and significantly down-regulated the NF-κB signaling pathway. Furthermore, the expression levels of NF-κB responsive genes including IL1B, IL8, IL6R, and TNFRSF10B were significantly lower in HW group. In conclusion, a 4-week HW consumption reduces oxidative stress by improving antioxidant capacity, which leads to the decreases in cellular damages of PBMCs and the frequency of circulating monocytes. In the condition of acute oxidative stress, 4-week HW consumption reduces the inflammatory response by down-regulating NF-κB-mediated signal transduction and NF-κB responsive genes. These findings suggest that the H2 administration exhibits the antioxidant effect in healthy population and our study may help understanding the molecular mechanism by which H2 exhibits the anti-inflammatory effect against intense oxidative stress.

Oxidative stress by mitochondrial dysfunction contributes to the activation of necroptosis in acute respiratory distress syndrome

이수환 Graduate School, Yonsei University 2021 국내박사

배경: 급성호흡곤란증후군은 폐 또는 폐 이외의 문제로 유발되는 폐의 급성 손상으로 발생한다. 급성호흡곤란증후군의 발병 기전은 복잡하며, 아직 모든 발병 기전이 밝혀지지는 않았다. 산화스트레스 (oxidative stress)와 세포사멸 종류 중 necroptosis는 급성호흡곤란 발생에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 이전에 보고된 세포실험 연구에서 산화스트레스가 necroptosis의 유도에 관여됨이 확인 되었다. 그러나 생체 내 (In Vivo)에서는 그 관련성이 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다. 목적: 본 연구에서는 급성호흡곤란증후군 환자의 폐에서 산화 스트레스와 RIPK3-mediated necroptosis가 발생함을 확인하고, lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 급성 폐손상 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능장애로 유발된 산화스트레스가 RIPK3-mediated necroptosis에 영향을 주는지 밝히고자 하였다. 방법: 7명의 급성호흡곤란증후군 환자의 폐 조직병리 슬라이드에서 면역 염색을 시행하였고, 2명의 급성호흡곤란 증후군 환자의 폐 조직에서 단백질 면역 블랏을 시행하였다. 동물 실험에서 급성 폐손상 마우스 모델은 LPS를 기도내 주입하여 만들었다. 산화스트레스는 미토콘드리아 기능장애를 유발하는 oligomycin을 마우스 복강내 주입하여 발생시켰다. 급성 폐손상 마우스 모델에서 산화스트레스가 유도된 그룹과 유도되지 않은 그룹의 폐 손상 정도를 조직병리 염색을 이용하여 비교하였다. 그리고 RIPK3-mediated necroptosis 발생 정도를 단백질 면역 블랏과 면역화학 염색을 이용하여 비교하였다. 마우스의 기관지 세척으로 획득한 기관지 폐포세척액에서 necroptosis와 관련되어 분비되는 damage- associated molecular patterns (DAMPs)의 양을 비교하였다. 결과: 본 실험에서 사용된 급성호흡곤란증후군 환자의 폐 조직은 급성호흡곤란증후군이 없는 폐 조직에 비해 RIPK3-mediated necroptosis와 산화스트레스가 증가하였다. 그리고 RIPK3-mediated necroptosis 및 산화스트레스 모두 급성호흡곤란증후군 환자의 폐 상피세포에서 증가하였다. ATP synthase를 억제하는 oligomcyin을 투여하여 산화스트레스가 유도된 폐손상 마우스 모델에서 폐 손상 정도와 폐 조직의 RIPK3-mediated necroptosis의 발생이 oligomycin을 사용하지 않은 폐손상 마우스 모델에 비해 증가되었다. 그리고 oligomycin으로 산화스트레스가 유발된 폐손상 마우스 모델의 기관지 폐포 세척액에서 necroptosis로 인한 DAMPs 분비가 oligomycin을 사용하지 않은 폐손상 마우스 모델에 비해 증가하였다. 결론: 급성호흡곤란 증후군 환자의 폐 조직에서 RIPK3-meidated necroptosis와 산화스트레스가 증가하였다. 그리고 LPS로 유도된 급성 폐손상 마우스 모델에서 산화스트레스가 증가하면 폐손상 및 RIPK3-mediated necroptosis와 DAMPs 분비가 증가하였다. 이상의 결과들은 급성호흡곤란 증후군의 발생 과정에서 산화스트레스의 증가가 RIPK3-medicatied necroptosis의 활성화에 기여할 수 있음을 시사한다. Background: Acute respiratory distress syndrome (ARDS) develops due to acute injury to the lungs caused by pulmonary or extrapulmonary abnormalities. Since the pathogenesis of ARDS is complex, the mechanisms of development of ARDS are not fully understood. Necroptosis is linked to cell death in ARDS. Oxidative stress has also been implicated in the pathogenesis of ARDS. Although the effect of necroptosis through oxidative stress is identified in the cellular system, the mechanisms for the activation of necroptosis in ARDS remain unclear. Purpose: This study aims to confirm whether oxidative stress contributes to the receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3)-mediated necroptosis associated with ARDS. Methods: The lung tissues from seven human subjects with ARDS were investigated for the involvement of RIPK3-mediated necroptosis and oxidative stress using immunoblot and immunostaining. We also investigated whether the oxidative stress due to mitochondrial dysfunction might exacerbate the RIPK3-mediated necroptosis in the lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) mouse model. Results We found that RIPK3- mediated necroptosis was significantly elevated in patients with ARDS compared to the non-ARDS subjects. Oxidative stress was increased in patients with ARDS due to the accumulation of 4-HNE, a marker for oxidative stress. Both RIPK3-mediated necroptosis and oxidative stress were elevated in the lung epithelial cells of the patients with ARDS. The oxidative stress due to mitochondrial dysfunction caused by oligomycin, an inhibitor of ATP synthase, significantly increased lung injury in the LPS-induced ALI mouse model compared to the ALI model without oligomycin treatment. Moreover, the oxidative stress due to mitochondrial dysfunction significantly increased the levels of RIPK3 and the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs) by necroptosis in the lung during ALI compared to the group administered the dose without treatment of oligomycin. Conclusion: The results of the human ARDS analysis showed that RIPK3-mediated necroptosis and oxidative stress were increased in ARDS, and the LPS lung injury mouse model with oxidative stress induced by mitochondrial dysfunction had increased RIPK3-mediated necroptosis, lung injury, and DAMPs release. Our results suggest that oxidative stress due to mitochondrial dysfunction might contribute to a critical mechanism for RIPK3-mediated necroptosis-induced lung injury during ARDS.

Oxidative stress induces cell death via Jak2/Stat3 in astrocytes

남경년 경희대학교 2010 국내박사

Astrocytes are one of the predominant glial cell types and respond to neuronal injury in the central nervous system (CNS). Oxidative stress is involved in the pathogenesis of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) contributes to accelerate the apoptosis. Jak/Stat singaling pathway mediates cellular responses to certain oxidative stress stimuli and cytokines. Although the action of hydrogen peroxide on astrocytes have been addressed, the signaling pathway involved in hydrogen peroxide-induced apoptosis of astrocytes is not clear. The aim of this study is to investigate the involvement of oxidative stress by hydrogen peroxide in apoptosis and Jak/Stat signaling pathway in astrocytes. Hydrogen peroxide caused cell death and induced phosphorylation of Stat3 and Jak2. Hydrogen peroxide increased pro-apoptotic gene expression and reduced anti-apoptotic gene expression such as Bcl-2, Bcl-xL. Inhibitors of Jak2/Stat3 prevented hydrogen peroxide induced cell death and tyrosine phosphorylation of Stat3. Also, Jak2 inhibitors and Stat3 inhibitor prevented hydrogen peroxide induced intracellular ROS. Furthermore, Jak2 inhibitors and Stat3 inhibitor increased gene expression of Bcl-2 and Bcl-xL. These results suggest that Jak2/Stat3, oxidative stress-regulated signal transducers, may promote cell death in astrocytes. Also, expression of Bcl-2 and Bcl-xL gene by Jak2/Stat3 activation are specific signaling mechanism of oxidative stress induced cell death. Thus, targeting for Jak2/Stat3 signaling may provide a protective strategy for rescuing astrocytes under various neuropathological conditions associated with oxidative stress. Reactive oxygen species (ROS)는 oxygen이 부분적으로 환원된 여러 가지 대사물을 칭하며, ROS의 level이 비정상적으로 높거나 지속되면 DNA, 지질, 단백질에 심각한 손상을 준다. Oxidative stress는 동맥경화, 암 및 퇴행성 뇌 질환 등과 같은 다양한 질병의 진전과 관련되어 있다. Jak/Stat 경로는 cytokine receptor를 통한 대표적인 신호전달체계로 알려져 있으며, 최근 neuron과 astrocytes 등에서 oxidative stress 자극을 주었을 때 Stat1과 Stat3의 인산화가 보고 되었지만 그 분자생물학적 기전에 대해서는 밝혀지지 않았다. 본 연구는 oxidative stress로 자극을 받은 astrocytes에서의 Jak2/Stat3 신호전달 활성화의 가능성과 그와 관련된 작용 기전을 확인하고자 수행하였다. 이에 H2O2로 처리된 astrocyte에서 Stat3의 인산화를 확인하였고, 증가된 Stat3 인산화는 Jak2 inhibitors와 Stat3 inhibitor를 통해 억제되는 것을 확인하였다. 또한 Jak2 inhibitors와 Stat3 inhibitor는 H2O2에 의해 증가된 세포사멸과 세포고사를 줄임을 확인하였다. 또한 Jak2와 ERK1/2 신호전달 단백질과의 관련성을 확인 결과, H2O2에 의해 증가된 ERK1/2 인산화는 Jak2 inhibitor인 AG490에 의해 줄어들지 않는 것을 확인하였다. H2O2에 의한 세포고사와 관련된 유전자의 mRNA level에서의 변화를 확인하기 위해 real-time PCR을 진행하였고, 세포고사를 증가시키는 Bax mRNA level이 억제제들에 의해 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. 이와 반대로, 세포고사를 억제하는 것으로 알려진 Bcl-2, Bcl-xL는 억제제들에 의해 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 외부 oxidative stress에 의한 세포 내 ROS level의 변화를 확인 하기 위해 DCFH-DA assay를 실행하였으며 H2O2에 의해 증가된 세포 내 ROS level 또한 억제제들에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 oxidative stress에 노출된 astrocyte에서 Jak2/Stat3 pathway가 세포고사와 관련된 Bcl-2 family의 유전자 조절을 통해 세포사멸을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.