PCR-RFLP를 이용한 Mycobacterium 감염의 진단 및 균종 감별

한민희 연세대학교 대학원 2003 국내석사

Mycobacterium spp.에 인한 감염은 만성전염병으로 전 세계에 중요한 질병 중에 하나이다. 이로 인한 지속적인 환자의 발병 및 사망은 human immunodeficiency virus (HIV) 감염에 따라 지속적으로 증가추세를 보이면서 Mycobacterium 감염이 단순한 질병이 아닌 심각한 감염으로 대두되고 있다. 더욱이 1980년대 초반부터 Mycobacteria other than M. tuberculosis (MOTT) 또는 atypical mycobacteria라고 명명되는 균종에 의한 감염이 증가되면서 Mycobacterium 감염의 신속한 진단 및 원인 균종의 감별과 이에 따른 효과적인 치료의 중요성이 부각되고 있다. Mycobacterium spp.의 감별은 현재까지 생화학적 검사나 배양 검사에 의한 것으로 배양 시 진단에 수주 이상의 시간이 소요되는 단점이 있으며 정확한 정보를 얻을 수 없는 경우도 있다. 최근 high performance liquid chromatography (HPLC), thin-layer chromatography, DNA 염기서열 분석 등의 새로운 감별법들이 제시되고 있지만 조작에 어려움이 있어 통상적으로 적용하기에 어려운 상태이다. 그리고 amplified DNA 및 probe hybridization을 통한 분자생물학적 검사가 개발되어 진단과 균종 감별을 비교적 신속하게 할 수는 있으나 고가의 비용을 필요로 하기 때문에 현재로선 임상에 도입하기 어려운 실정이다. 유전자 분석을 이용한 감별법인 rpoB 유전자에 대한 PCR-restriction fragment length ploymorphism (PCR-RFLP) 방법은 Mycobacterium spp. 간의 공통 유전자를 이용한 것으로 임상검체로부터 Mycobacterium 감염을 조기에 진단하고 균종을 감별하여 적절하고 신속한 치료제를 선택하는데 도움을 주고자 하였다. 이에 본 연구에서는 기존에 동정된 Mycobacterium spp.를 PCR-RFLP하여 동정된 균종과 비교함으로써 PCR-RFLP가 Mycobacterium 감염 진단 및 균종을 감별하는데 있어서 유용성이 있음을 확인하였다. 또한 세포 수에 따른 민감도를 알아보기 위해 sputum에 혼합된 균 분리의 PCR 결과는 5 CFU/ml에서도 가능함을 볼 수 있었다. 이러한 높은 민감도는 PCR-RFLP 방법이 Mycobcterium 감염을 진단하는 현명한 대안일 수 있으며 이를 통해 Mycobcterium spp.의 원인 균종을 감별하여 실험실적 정도 관리에도 도움을 줄 수 있으므로 검사의 질적 향상을 기대할 수 있는 것으로 사료되었다. 따라서 Mycobacterium 감염이 의심되거나 그 균종을 감별하기 위해 환자의 검체에서 DNA 추출, PCR을 통해 검체에 rpoB 유전자가 있음을 보고 Mycobacterium의 감염을 일차적으로 확인하였다. 그리고 이것을 배양 검사와 PCR-RFLP를 실시하였을 때 그 결과는 모두 일치하였다. 즉, 균의 감염이 모두 양성이었으며 이 가운데 비정형 결핵 확진 환자의 경우, PCR-RFLP를 통해 M. avium으로 균종을 더 명확히 구분 지을 수 있었다. 따라서 PCR-RFLP가 Mycobacterium 감염 진단 및 균종 감별에 중요한 인자로 작용함을 볼 수 있었으며, 이는 염기서열 분석에서도 동일한 결과가 나와 PCR-RFLP를 통한 검사 결과를 뒷받침해 주었다. 또 다른 방법으로 조직 검사와 함께 PCR-RFLP를 실시한 결과 Mycobacterium 감염 양성이 모두 일치하였다. 이 가운데 비정형 결핵균의 균종이 M. intracellulare임을 확인하였으며 이는 또한 염기서열 분석을 통해서도 같은 균종이 나왔음을 확인했다. 이것은 치료제를 사용하여 환자의 호전된 정도를 보았을 때의 결과와도 같은 것이었다. 따라서 PCR-RFLP를 통한 결과가 Mycobacterium 감염 진단뿐만 아니라, 원인 균종 감별, 치료제 선택에 도움을 줄 수 있는 충분한 근거가 될 수 있음을 확인하였다. Mycobacterium 감염 진단 및 균종을 감별하기 위해 PCR-RFLP를 임상 진단과 비교하였는데 Mycobacterium 감염 양성 혹은 음성 결과가 모두 일치하였다. 또한 이것을 PCR-RFLP 하였을 때 Mycobacterium spp.의 균종을 M. tuberculosis로 감별하므로 감염 환자 진단을 더욱 확정할 수 있는 지침이 될 수 있음을 볼 수 있었다. 그리고 염기서열 분석에서도 같은 결과가 나와 PCR-RFLP를 통한 검사 결과를 뒷받침해 주었다. 11명의 환자를 통해 알아본 Mycobacterium 감염 양성 혹은 음성을 감별하는데 있어서 배양 검사, 조직 검사 및 임상 진단은 PCR-RFLP의 결과와 모두 일치하였다. 그리고 PCR-RFLP 방법을 통한 균종의 감별은 배양 검사 2건 모두, 조직 검사 4건 중 2건, 임상 진단에서 2건 중 1건의 검사 결과와 일치함을 확인했다. 이 같은 결과를 바탕으로 현재 수 주 이상 인력이 소요되었던 생화학적 검사나 배양 검사에 의존한 Mycobacterium spp.의 진단을 Mycobacterium spp.에 공통적으로 존재하는 rpoB 유전자로부터 PCR-RFLP 방법을 이용하여 진단 및 원인 균종을 조기 감별할 수 있었다. Mycobacterial infection is one of the major public health problems in the world. Identification of Mycobacterium spp. in clinical specimens is primarily based on culture and biochemical tests. These conventional tests take several weeks and sometimes fail to provide precise identification. In contrast to these techniques, PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) offers an easy, rapid, and inexpensive way to identify Mycobacterium spp. PCR-RFLP technique is a rapid method for identifying the species of Mycobacterium spp. from clinical specimens. In this study, I evaluated the usefulness of PCR-RFLP for rapid diagnosis and species identification of Mycobacterium spp. from clinical specimens. Conserved gene of RNA polymerase of Mycobacterium spp. was amplified by PCR. The amplified 360 bp region of rpoB was digested with restriction enzymes MspI or HaeIII. And the PCR-RFLP patterns of each Mycobacterium spp. were determined. PCR-RFLP patterns of Mycobacterium spp. isolated from several clinical samples were compared with restriction fragment band patterns of control. Mycobacterium spp. isolated from clinical samples were identified as M. tuberculosis, M. fortuitum, M. intracellulare, or M. avium. And the results of PCR-RFLP were nearly identical to those of culture, biopsy, clinical diagnosis, or sequencing. In conclusion, PCR-RFLP is a rapid and useful method for the identification of Mycobacterium spp. from clinical specimens. This study suggest that this method would contribute to the rapid diagnosis and treatment of mycobacterial infections in clinical setting.

지리적 기원이 다른 고추 더뎅이병균 균주의 RFLP와 RAPD 분석

정희정 順天大學校 大學院 1995 국내석사

우리 나라의 주요 고추 재배지와 미국, 대만, 호주, 아르헨티나에서 수집된 44개 고추 더뎅이병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) 균주간의 유전적 분화를 genomic DNA의 restiction fragment length polymorphism(RFLP)과 random amplified polymorphic DNA(RAPD)에 의해 분석하였다. 제한효소 7개와 probe 5개를 사용하여 얻은 genomic DNA RFLP profiles을 cluster 분석하여 얻은 dendrogram에서 지리적 기원이 다른 44개 균주들은 11개 RFLP 그룹으로 분류되었다. 또한 11개의 arbitrary primer를 사용하여 PCR에서 증폭시킨 genomic DNA의 RAPD 분석을 통하여 유도된 dendrogram에서 공시한 균주들은 18개 RAPD 그룹으로 분류되었다. Genomic DNA의 RAPD profiles에서의 변이는 RFLP 분석에 의해 얻은 결과와 매우 유사하였지만, 공시한 균주들에 대한 RAPD 분석이 RFLP 분석보다 더 정밀한 것으로 밝혀졌다. 외국 균주들은 genomic DNA의 RFLP와 RAPD 분석에 의해 모두 각각 다른 RFLP 그룹과 RAPD 그룹으로 분류되었지만, 우리 나라 균주들은 6개의 RFLP 그룹과 12개의 RAPD 그룹으로 분류되었다. 외국 균주들 중에서 미국과 대만 균주는 genomic DNA의 RFLP와 RAPD 분석으로부터 유도된 dendrogram에서 대부분의 우리 나라 균주들과 함께 cluster를 이루었다. 특히 미국 균주와 우리 나라 일부 균주들은 밀접한 유전적 관련성을 가지고 함께 cluster를 이루었는데, 이것은 이 균주들이 동일한 고추 더뎅이병균의 조상 균주 집단에서 유래했으리라는 것을 시사해 준다. 그러나 우리 나라 균주들 중에서 마산에서 수집된 Ms93-1은 다른 우리 나라 균주들과 뚜렷하게 구분되었는데, Ms93-1의 genomic DNA가 다른 균주들의 genomic DNA와 유전적으로 매우 다르다는 것을 시사한다. 이러한 결과들은 우리 나라에서 지리적 기원이 다른 고추 더뎅이병균 균주 사이에 다양한 유전적 분화가 일어나고 있다는 증거이다. Genetic variation of the 44 strains of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria collected from the major pepper cultivation areas of Korea and the United States, Taiwan, Australia, and Argentina was analyzed using restriction fragment length polymorphism(RFLP) and random amplified polymorphic DNA(RAPD) of genomic DNAs. The Forty four strains of diverse geographic origins were classified into 11 RFLP groups based on the dendrogram generated by cluster analysis of RFLP profiles of the genomic DNAs of the strains using 7 restriction enzymes and 5 hybridization probes. The same strains were classified into 18 RAPD groups based on the dendrogram derived from RAPD analysis of the genomic DNAs amplified by polymerase chain reaction with a set of 11 arbitrary primers. The variation in the RAPD profiles of the genomic DNAs was very similar to the results obtained by the RFLP analysis of the genomic DNAs, but the RAPD analysis was found to be more sensitive than the RFLP analysis of the strains tested. Thirty nine Korean strains were classified into 6 RFLP groups and 12 RAPD groups. Strains of foreign countries formed discrete RFLP groups and RAPD groups for each country. Among the foreign strains, the strains from the United States and Taiwan were formed to be genetically closely related with some of the Korean strains based on both the dendrograms derived from the RFLP and RAPD analyses of the genome DNAs, suggesting that these strains may have originated from a common ancestral population of the strains of X. campestris pv. vesicatoria. Of the 39 Korean strains, one strain, Ms93-1 collected in Masan, was found to be significantly different from other strains, suggesting that genomic DNA of Ms93-1 may be genetically very distant from those of the others. These results provide evidence that there occurred genetic variation in the strains of X. campestris pv. vesicatoria collected from different geographic areas in Korea.

양볼락과 (Family Scorpaenidae) 어종에 기생하는 Microcotyle 속 단생흡충 (Genus Microcotyle: Monogenea)에 대한 연구

남우화 강릉원주대학교 일반대학원 2023 국내박사

Monogeneans (Platyhelminthes) are common ectoparasitic flatworms of fish, infecting the body surfaces such as the skin, fins and gills. Monogeneans have a short direct life-cycle with no intermediate hosts, which facilitates their rapid propagation in aquaculture environments. The infected host fish show anemia and dyspnea with considerable mortality, but may remain in a state of chronic infections. In Korea, Microcotyle sebastis is a well-known gill parasite of cultured Korean rockfish (Sebastes schlegeli), causing economic loss. Sebastid fish, including Korean rockfish are considered economically valuable species in Korea for commercial fisheries. In addition to Korean rockfish, artificial propagation of several sebastid species juveniles is also established, and they are considered potential candidates for aquaculture. But, there is no information on the gill monogenean fauna of these sebastid species, and they can be a potential threat to the sebastid fish aquaculture industry. In this study, of 682 sebastid fish (S. schlegeli, Sebastes inermis, Sebastes thompsoni, Sebastes taczanowskii, Sebastes steindachneri, Sebastes owstoni, Sebastes pachycephalus, Sebastiscus marmoratus and Sebastiscus tertius) examined, 243 fish were infected with monogeneans in their gills. The number of monogeneans collected were 1,501 in total. 5 species of monogeneans including M. sebastis were found in 7 sebastid fish species; Microcotyle caudata (of S. inermis) and Microcotyle kasago (of S. marmoratus) are previously reported from Japan. Two different Microcotyle species were also found from two Sebastid fish (S. thompsoni, S. taczanowskii), which have not been described elsewhere up to date. They were identified based on the morphology of the genital atrium and mtDNA cox1 gene sequences and these criteria are considered as useful tools for unambiguous species identification of microcotylid monogenean. Mitogenome sequencing was performed with 3 Microcotyle species (M. caudata, M. kasago, and Microcotyle sp. of S. taczanowskii). As a result, the specific gene order and codon usage of the genus Microcotyle were found in the 3 mitogenomes. In addition, the phylogenetic analysis using mitogenome clearly showed the taxonomic level of the genus Microcotyle in the class monogenea. Thus, mitogenome is a useful genetic marker for molecular identification of genus Microcotyle. PCR-RFLP targeting mitochondrial cox1 gene, was designed for discriminating M. sebastis and M. caudata. The AseI enzyme treatment with the PCR products showed that M. sebastis were cleavaged while M. caudata did not. 98.6% (1,004/1,018) of monogeneans from S. schlegeli were identified as M. sebastis, and 98.4% (316/321) of monogeneans from S. inermis were identified as M. caudata by PCR-RFLP. Whereas, 5 monogeneans from S. schlegeli were identified as M. caudata (5/1,018), and 5 monogeneans from S. inermis were identified as M. sebastis (5/321). These 10 monogeneans were identified as M. caudata and M. sebastis also by ITS region-based PCR-RFLP. The PCR-RFLP method in this study will help investigate the differential diagnosis and epidemiology of Microcotyle species in two sebastid fish. The temperature strongly influenced on fertility and viability of M. caudata and M. sebastis. The average amount of oviposition of M. caudata after 48 hours incubation were 36.5±0.9 per individual at 10℃, 45.3±8.2 at 15℃, 30.3±2.9 at 20℃, 16.4±1.6 at 25℃. And those of M. sebastis were 31.8±1.5 at 10℃, 46.5±8.3 at 15℃, 57.9±6.4 at 20℃, and 26.5±2.2 at 25℃. M. caudata showed the highest fertility at 15℃, whereas M. sebastis showed the highest fertility at 20℃. In addition, the average survival period of M. caudata showed 7.4±0.4 days at 10℃, 4.4±0.1 days at 15℃, 3.5±0.4 days at 20℃, and 1.8±0.1 days at 25℃. M. sebastis showed 11.4±2.2 days at 10℃, 7.0±0.3 days at 15℃, 4.3±0.8 days at 20℃, and 3.4±0.3 days at 25℃. The average time required to hatch eggs decreased as the temperature increased. The highest egg hatching rate was observed at 15℃ for M. caudata and 20℃ for M. sebastis. Meanwhile, M. sebastis and M. caudata appeared to different distribution patterns within the gills cavity of each host species. There are intensively distributed on the second gill arch, M. caudata was mainly distributed in the dorsal segment and M. sebastis was mainly distributed in the medial segment. The efficacy of various anti-helminthic agents and disinfectants were evaluated in vitro against adults and eggs of the M. sebastis and M. caudata, respectively. Praziquantel (PZQ), ivermectin (IVM), trichlorfon (TCF), fenbendazole (FNBZ), febantel (FBT), flubendazol (FLBZ) and thiabendazole (TBZ), formalin, H2O2, NaClO were selected as test chemicals. The hatching rate of M. sebastis and M. caudata eggs was significantly reduced when compared with the control group (seawater; M. sebastis = 86.7%±0.5, M. caudata = 83.0%±0.5) by at least 33.3% in formalin (200, 300 mg/L), H2O2 (50-200 mg/L), and NaClO (75-200 mg/L) treatment. However, 7 anti-helminthic agents, including PZQ, did not effectively inhibit hatching of eggs. In addition, 50-200 mg/L NaClO treatment significantly killed M. sebastis and M. caudata adults when compared with the control group. IVM 200 mg/L for 30 min treatment showed 100% killing activity of M. sebastis adults and 80% of M. caudata adults. However, PZQ, TCF, FNBZ, FBT, FLBZ and TBZ treatment showed less than 33% mortalities. PZQ 200 mg/L for 30 min treatment showed 99.2% detachment of M. sebastis attached to the gills, and 100% detachment of M. caudata at the same PZQ conditions. IVM 200 mg/L detachment or killed more than 83% of M. sebastis and M. caudata attached to the gills. However, all the other chemicals showed weak effect. This result shows that PZQ and IVM immersion treatments are effective to control M. sebastis and M. caudata in sebastid species aquaculture, and formalin, H2O2 and NaClO are effective against eggs. In this study, the microcotylid monogenean diversity of sebastid fish in Korea and their taxonomic status were investigated. In addition, information on physiological characteristics and control strategies of M. caudata and M. sebastis were provided. In Korea, S. schlegeli is cultured in a large scale and other sebastid fish (S. inermis, S. thompsoni and S. marmoratus) are also propagated in a small scale. These fish species are promising candidate aquaculture species but their production can be affected by harmful microcotylid monogenean infection. The results presented in this study provide comprehensive information on potential microcotylid monogenean infection in Korea. 단생흡충은 숙주의 체표, 아가미 등에 감염하는 체외기생성 편형동물이다. 단생흡충은 생활사 내에 하나의 숙주만이 필요한 단순한 생활사를 가지고 있는데, 이러한 생활사는 재감염에 필요한 단계가 간단하여 숙주 어류를 고밀도로 사육하는 양식 환경에서는 감염강도가 급속도로 증가될 수 있다. 감염된 숙주 어류는 빈혈과 호흡곤란 등의 증상이 발생할 수 있으나, 만성감염으로 남을 수도 있다. 우리나라에서는 양식산 조피볼락 (Sebastes schlegeli)에 Microcotyle sebastis가 감염하여 심각한 피해를 유발하고 있다. 그런데 국내 연안에는 조피볼락 외에도 다양한 양볼락과 어종이 서식하고 있으며, 일부 종은 시험적으로 양식되고 있다. 그러나 아직 조피볼락 이외에 다른 어종에 대해서는 단생흡충에 대한 조사가 수행되지 않았다. 따라서 M. sebastis외에도 다른 단생흡충이 차후 볼락류 양식시설에서 발병하여 문제가 될 수 있다. 본 연구에서는 총 682개체의 양볼락과 어종 (S. schlegeli, Sebastes inermis, Sebastes thompsoni, Sebastes taczanowskii, Sebastes steindachneri, Sebastes owstoni, Sebastes pachycephalus, Sebastiscus marmoratus, Sebastiscus tertius)을 채집한 결과 243마리가 Microcotyle 속 단생흡충에 감염되어 있었으며, 1,501개체의 Microcotyle 속 단생흡충이 분리되었다. M. sebastis를 포함한 5종의 Microcotyle 속 단생흡충이 7종의 양볼락과 어종에서 발견되었다. 볼락 (S. inermis)에서 발견된 Microcotyle caudata와 쏨뱅이 (S. marmoratus)에서 발견된 Microcotyle kasago는 지리적으로 인접한 일본에서 보고된 종이었다. 불볼락 (S. thompsoni)과 탁자볼락 (S. taczanowskii)에서 발견된 2종은 미기록 종으로 확인되었으며 차후 신종으로 보고할 계획이다. 또한 생식강의 형태와 mtDNA cox1 유전자를 함께 사용한 동정법은 Microcotyle 속 단생흡충을 종수준까지 명확하게 동정할 수 있는 방법으로 확인되었다. 3종의 Microcotyle 속 단생흡충 (M. caudata, M. kasago, Microcotyle sp. of S. taczanowskii)을 대상으로 mitogenome sequencing을 수행하였다. 그 결과 3종의 mitogenome에서는 Microcotyle 속의 특이적인 유전자 배열과 코돈 사용이 확인되었다. 또한 mitogenome을 사용한 계통분석은 단생강 내에서 Microcotyle 속의 분류학적 수준을 명확히 나타내었다. 따라서 mitogenome은 Microcotyle 속 단생흡충의 분자생물학적 동정에 유용한 유전자 marker로 확인되었다. M. sebastis와 M. caudata를 구별하기 위해 mtDNA cox1 영역을 기반으로 PCR-RFLP를 설계하였다. AseI 효소를 처리한 결과 M. sebastis의 cox1 유전자는 분절된 반면, M. caudata는 분절되지 않았다. 조피볼락에서 분리된 Microcotyle 속 단생흡충의 98.6% (1,004/1,018)는 M. sebastis로 동정되었으며, 볼락에서 분리된 Microcotyle 속 단생흡충의 98.4% (316/321)는 M. caudata로 동정되었다. 반면, 조피볼락에서 분리된 5개체는 M. caudata (5/1,018)로 동정되었으며 볼락에서 분리된 5개체는 M. sebastis (5/321)로 동정되었다. 해당 10개체는 ITS 영역을 기반으로 설계된 PCR-RFLP에서도 혼합감염으로 확인되었다. 본 연구에서 개발한 PCR-RFLP법은 조피볼락과 볼락에 기생하는 Microcotyle 속 단생흡충의 감별진단과 역학 조사에 사용될 것으로 기대된다. 수온은 M. caudata와 M. sebastis의 생식능력과 생존기간에 강한 영향을 미쳤다. 배양 48시간 후 M. caudata의 평균 산란량은 10℃에서 36.5±0.9개, 15℃에서 45.3±8.2개, 20℃에서 30.3±2.9개, 25℃에서 16.4±1.6개였다. 그리고 M. sebastis는 10℃에서 31.8±1.5개, 15℃에서 46.5±8.3개, 20℃에서 57.9±6.4개, 25℃에서 26.5±2.2개였다. M. caudata의 생식능력은 15℃에서 가장 높았으며, M. sebastis는 20℃에서 가장 높았다. 또한, M. caudata의 평균 생존 기간은 10℃에서 7.4±0.4일, 15℃에서 4.4±0.1일, 20℃에서 3.5±0.4일, 25℃에서 1.8±0.1일이었으며, M. sebastis의 평균 생존 기간은 10℃에서 11.4±2.2일, 15℃에서 7.0±0.3일, 20℃에서 4.3±0.8일, 25℃에서 3.4±0.3일로 확인되었다. 수정란의 발달 기간은 수온이 높아질수록 감소하였으며, M. caudata 수정란의 부화율은 15℃에서 가장 높으며, M. sebastis의 수정란은 20℃에서 가장 높았다. 한편, M. caudata와 M. sebastis는 아가미 내에서 서로 다른 분포 패턴을 나타내었다. 두 종 모두 2번째 새엽에 가장 많이 분포하지만, M. caudata는 dorsal segment에 주로 분포하고, M. sebastis는 medial segment에 주로 분포하였다. M. sebastis 및 M. caudata의 수정란과 성충에 대한 다양한 화합물의 구제 효과를 in vitro 조건에서 비교하였다. Formalin, hydrogen peroxide, chlorine, Praziquantel (PZQ), ivermectin (IVM), trichlorfon (TCF), fenbendazole (FNBZ), febantel (FBT), flubendazol (FBZ), thiabendazole (TBZ) 등 10가지의 화합물을 선택하여 실험에 사용하였다. M. sebastis와 M. caudata의 수정란은 formalin (200, 300 mg/L), hydrogen peroxide (50-200 mg/L), NaClO (75-200 mg/L)를 처리시 멸균해수 (M. sebastis = 86.7%±0.5, M. caudata = 83.0%±0.5)에 비해 부화율이 33.3% 이하로 유의하게 감소하였다. 그러나 PZQ를 포함한 7가지 (PZQ, IVM, TCF, FBZ, FBT, FLBZ, TBZ)의 항기생충제는 수정란의 부화에 영향을 미치지 않았다. 50-200 mg/L NaClO는 M. sebastis 및 M. caudata의 성충을 효과적으로 사멸시켰다. 또한, 200 mg/L의 IVM은 M. sebastis 성충을 100% 사멸시키고, M. caudata 성충을 80% 사멸시켰다. 그러나 200 mg/L의 PZQ, TCF, FNBZ, FBT, FLBZ, TBZ는 33% 이하의 개체를 사멸시켰다. 아가미에 부착된 M. sebastis 성충은 200 mg/L의 PZQ 처리시 99.2% 탈락되었으며, M. caudata 성충은 100% 탈락하였다. 이때 탈락된 개체는 모두 생존하였다. 200 mg/L의 IVM은 아가미에 부착된 M. sebastis 및 M. caudata 성충을 83% 이상 탈락시키거나 사멸시켰다. 본 연구 결과 200mg/L의 PZQ, IVM은 숙주의 아가미에 부착되어 있는 M. sebastis 및 M. caudata 성충을 효과적으로 탈락시키거나 사멸시켰다. 그러나 두 화합물은 수정란의 부화를 억제하지 못하였다. 반면, formilin, H2O2, NaClO는 수정란의 부화를 효과적으로 억제하였다. 따라서 Microcotyle 속 단생흡충을 효과적으로 제거하기 위해서는 두 가지 방식의 복합적인 처리법이 필요하다. 본 연구에서는 국내 연안에 분포하는 Microcotyle 속 단생흡충의 종 다양성을 보고하고 해당 종들의 분류학적 수준을 명확히 하였다. 또한, M. sebastis 및 M. caudata의 감염증에 대응할 수 있는 여러 생리학적 특성이나 구제방안에 대한 정보를 제공하였다. 국내에서는 조피볼락이 대량으로 양식되고 있으며, 볼락, 불볼락, 쏨뱅이 등이 소규모로 양성되거나 방류용 종묘로 생산되고 있다. 양볼락과 어종은 국내에서 자원 가치가 높은 만큼 차후에도 다양한 종이 양식될 것으로 전망되나, 양식 환경에서는 어종에 따라 다양한 종의 Microcotyle 속 단생흡충이 감염하여 피해를 유발할 수 있다. 본 연구 결과는 차후 국내에서 발생할 수 있는 Microcotyle 속 단생흡충에 대한 종합적인 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

RAPD.RFLP 및 DNA-fingerprinting에 의한 Capsicum속의 유적적 다양성 분석과 유용 분자 marker탐색

최학순 順天大學校 大學院 1996 국내석사

Capsicum속 식물에 있어서 최척의 증폭 조건은 template DNA 25ng, primer 2μM, 각각 150μM의 dNTP, 2mM의 MgCl_(2), 0.5U의 Taq DNA polymerase를 포함한 경우였다. 시판의 random primer를 이용하여 Capsicum속 28품종간의 RAPD분석 결과 다수의 band를 검출할 수 있었다. 6종의 primer에 있어서 공히 종간에 많은 변이를 보였으며 품종내에 있어서는 변이폭이 좁았다. 6종의 primer의 경우 모두 70개의 band가 검출되었으며, 평균 l종의 primer당 11.7개의 band가 검출 되었으며, 대부분의 band는 250-3000bp 사이에 존재하였다. 본실험에 공시한 6종의 primer에 의해 증폭된 결과를 기초로하여 cluster분석을 하였다. 28품종은 5군으로 나눌수 있었다. 8품종의 Pendant type의 PCR산물중 Palbang과 Sisidou는 다른 품종에 존재하는 band가 검출되지 않았다. Sisidou의 경우 primer 5'-CCCGCCTTAG-3'를 이용하여 증폭 하였을때 가장 큰 크기의 band가 검출되지 않았으나 Palbang은 검출되어 형태적으로 구분하기 어려운 Sisidou와 Palbang를 식별할수있는 primer로 이용할수있는 가능성을 나타냈다. 또한 국내종과 도입종의 특이적인 band는 Primer 5'-TGGTCACTGA-3'를 이용했을때 도업종에는 없는 국내종 특이적인 band가 검출 되었다. 국내외 고추품종의 동정과 품종 특이적 DNA marker를 탐색하기 위하여 단백질의 전기영동적 분획, DNA fingerprinting 및 RFLP분석을 하였다. C. annum내의 20 품종간의 전단백질을 SDS-PAGE분석 결과 종내의 20품종간에서는 다형성을 발견할 수 없었으나, Capsicum 속내 7종, 10품종을 이용하여 종간의 다형성을 검토한 결과 60KD 및 18KD근방에서 다형성이 나타났으나 종내 또는 종간에도 뚜렷한 marker의 선발에는 한계가 있었다. RFLP 분석시 다형성은 oligonucleotide probe와 제한효소에 의해 결정되며, 본 실험에서는 multi-locus probe인 (GATA)_(4), 26S rDNA, 벼의 엽록체 DNA단편인 P2, P10, P10-1, P45, P50, 미토콘드리아 DNA단편인 ATP A를 probe로 이용하였다. 품종수준의 DNA marker탐색을 위해 (GATA)_(4)를 이용하여 DNA fingerprinting을 한 결과 제한효소 RsaI과 HaeIII로 소화하여 Southern hybridization 하였을때 가장 다양한 다형성 및 marker 탐색이 가능 하였다. 26S rDNA유전자를 probe로 이용하여 품종간의 유연관계 및 marker 탐색을 한 결과 Capsicum속내 29품종을 제한효소 BamHI, HinfI, HaeIII, HindIII로 소화하였을때 여러개의 품종 수준의 marker탐색이 가능 하였다. 세포질 수준에서의 다형성을 분석하기 위해 RFLP 분석한 결과 벼의 엽록체 단편인 P2와 옥수수 미토콘드리아 단편인 ATP A를 probe로 이용 하였을때 품종간의 다형성을 볼 수 있었다. P2 단편을 probe로 사용하고 제한효소 BamHI로 소화하였을때는 약 4.4kb 부근에서 X-mas bell I(C. pendulum)과 156(C. frutescens)의 band가 검출되지 않았으며, 제한효소 Hind III로 소화하였을때는 masan jere에서 약 11kb 부근에 다른 품종에는 없는 band가 검출 되었다. 미토콘드리아 단편인 ATP A를 probe로 이용하여 제한효소 HindII, HaeIII로 소화하여 Southern hybidization한 결과 품종간 다형성을 찾아볼 수 있었다. 이중 제한효소 HindIII로 소화하였을때 C. pendulum인 X-mas bell I과 X-mas bell II는 동일한 band를 형성 하였으며 Green 100의 경우는 품종 특이적인 band가 검출 되었으며 나머지 종은 6.6kb 부근에서 band의 유, 무로 품종을 구분할 수 있었다. 제한효소 HaeIII로 소화 하였을때도 Green 100은 이 품종 특이적인 band가 검출되었으며 나머지종은 약 1kb에서 band의 유, 무로 품종을 구분할 수 있었다. 새고추 genonic DNA library에서 선발된 16개의 probe DNA를 이용하여 Southern blot분석한 결과 29개의 품종간 다형성을 찾아 볼 수 없었으며, 대부분의 경우 smear한 band pattern을 나타내었다. 국내 재배종인 녹광과 신홍 각각 14개체에 있어서 26S rDNA를 probe로 사용하여 RFLP 분석한 결과 유전적 순도가 고르지 못하였다. 한 품종 이상에서 다형성을 나타낸 RFLP 분석에서 검출된 총 55개의 band를 cluster분석한 결과 크게 8군으로 나눌 수 있었으며, 이중 X-mas bell I과 일본품종인 Jouseongisae와 Sameung, 역시 156과 일본품종인 Jouseongisae와 Sameung의 유연관계가 0.67로 가장 낮았다. 반면 일본품종인 Jouseongisae와 Sameung, 국내 개량종인 Saegochoo와 Putgochoo는 1.0 으로 긴밀한 유연관계를 나타내었다.

PCR-RFLP법에 의한 배의 자가불화합성 계통과 자가화합성 계통의 교배후대에서 자가화합성 계통의 선발

안승구 韓京大學校 産業大學院 2004 국내석사

배(Pyrus pyrifolia Nakai) 품종은 배우체형 자가불화합성을 나타내고 있으며, 배의 육종은 많은 노동력과 시간이 요구되는 인공수분에 의존하고 있다. 자가불화합성 품종‘Niitaka’(S3S9),‘Whasan’(S3S5),‘Chuwhangbae’ (S4S6)와 자가화합성 품종인‘Osanijisseiki’(S2S4sm)의 사이의 자식으로부터 자가화합계통을 선발하기 위하여 PCR-RFLP분석을 사용하였다. S-allele는 멘델의 법칙에 의해 유전되며, 'Osanijisseiki'가 부친인 경우 자가불화합성 자식(S4sm-allele를 포함하고 있지 않음)과 자가화합성 자식(S4sm-allele를 포함함)를 교배하여 얻어진 F1에는 S2S8, S2S9, S8S4sm, S4smS9의 유전자형으로 4 type으로 나누어지는데 이중 S2S8과 S2S9은 자가불화합성이며 S8S4sm, S4smS9은 자가화합성으로 분리된다. 최근 일본 배와 국내 육성 배 품종에서 S-RNase의 염기서열을 결정하였으며, 배의 S-RNase가 두 개의 보존영역인 exon과 하나의 변이 영역인 intron로 구성된 것을 밝혔다(Kim et al., 2002a, b). PCR 증폭은 9개의 배 S-RNase 염기서열을 기초로 하여 각각의 exon 영역에서 S-RNase 특이적 primer PF (FTQQYQ)와 anti-PR((I/T)IWPNV)의 조합을 이용하여 수행한 결과 각각의 S-RNase의 intron 크기는 S2= 1,153 bp, S3= 179 bp, S4= 168 bp, S5= 179 bp, S6= 147 bp, S9= 1,115 bp 이었다. 또한 S-allele 특이적인 제한효소 선발하기위해 9개의 S-RNase의 염기서열에서 제한효소에 의해 소화되는 S-allele specific cleavage sites를 찾았다. 제한 효소는 ScfI(S1), XbaI(S2), PpuMI(S3, S5), NdeI(S4), AlwNI(S5), HinCII(S6), MluI(S6, S7), NruI(S8), BstBI(S9)을 선발하였다. 이들 data를 근거로 본실험에 사용된 자가불화합성 품종과 자가화합성 품종사이의 교배한 16개 조합에서 PCR-RFLP법에 의해 S4sm-allele를 가진 자가화합성 계통을 선발하였다. 이런 PCR-RFLP 시스템을 이용하여 8개의 자가불화합성 계통의 자가불화합성 유전자형을 결정하였으며, 8개의 자가화합성 계통을 선발하였다. 따라서 얻어진 자가화합성계통을 이용하여 F1품종을 육성한다면 인공수정 없이도 배 생산할 수 있어 경제적으로 막대한 효과를 가질 수 있을 것으로 사료된다. These studies were conducted PCR-RFLP analysis for screening of self-compatible strain from the offspring of the self-incompatible cultivar and self-compatible cultivar of Pyrus pyrifolia (Nakai). These results were summarized as follow: Breeding of the pear cultivars depends on artificial pollination that requires much labor, many worker and time period. The pear cultivar 'Osanijisseiki'(S2S4sm; sm= stylar-part mutant) has been used as a parent to breed a self-compatible cultivars with excellent fruit. We have developed a PCR-RFLP system that could screened out self-compatible strain from the off springs between the self-incompatible cultivar and self-compatible cultivar. Recently, the nucleotide sequences of the S-RNase(S1∼S9) were determined from genomic DNA. Using the intron information, we could screened out the self-compatible strains with digestive only S4-, S5-, S6- and S9-RNase fragments and self-incompatible strain with digestive S2- and S9-RNase fragments. Also, we determined the S-genotype of eight self-incompatible strains and screened the eight self-compatible strains by S-allele based PCR-RFLP system.

韓國産 벼 흰잎마름病菌의 Genome RFLP와 抵抗性 遺傳子 Xa21에 대한 病原性

이세원 단국대학교 대학원 1996 국내석사

세계적으로 저항성품종 육성에 있어 많은 관심의 대상이 되고 있는 Xa27 저항성유전자에 대한 우리나라 벼 흰잎마름병균의 반응을 평가하여 저항성원으로서의 이용가능성을 검토하고, 기내에서 병원균의 병원성분화를 동정하기 위한 기술을 개발하기 위하여 병원균 게놈의 RFLP를 분석한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 공시한 우리나라 벼 흰잎마름병 38균주 중 Xa21 저항성유전자에 대해 병원성을 지닌 균주는 KX085, KX090, KX0169, KX0342, KX0377 KX0378, KX0400 등 7균주로 동정되었다. 2. Xa21 저항성유전자를 보유한 IRBB21 품종에 대한 유묘기 병반장은 병원성 균주와 비병원성 균주간에 6cm 이상의 차이를 보여 이병성과 저항성이 뚜렷이 구별되었고, 접종엽내의 병원균 밀도조사에서도 비병원성 균주에 비해 병원성 균주는 10배 이상의 증가를 보였다. 3. 유묘기 병반장 조사와 접종엽 내 밀도조사에서 IRBB21 품종을 침해했던 균주는 최고분얼기와 출수기에도 IRBB21 품종에 이병성 반응을 일으켰다. 4. RFLP를 이용한 게놈분석 결과 우리나라 벼 흰잎마름병균은 크게 xoriiM을 보유한 균과 보유하지 않은 균주 2그룹으로 분류되었다. 5. 비병원성 유전자 pBSavrXa10을 이용한 genome RFLP분석 결과로 우리나라 벼 흰잎마름병균은 크게 2개의 그룹으로 구별되었으며, 이를 다시 유사도 0.75 이상에서 5개의 소그룹으로 구분할 수 있었다. Transposable element인 pJEL101을 표지인자로 이용한 경우에도 5개의 소그룹으로 구분 되었으며 pBSavrXa10을 이용하여 분석한 결과와 일치하였다. 6. Xa21 저항성유전자에 대한 병원성은 기내에서 xoriiM 유사염기서열의 보유 유무와 pBSavrXa10, pJEL101을 이용한 genome RFLP로 완전하게 동정할 수 있었다. Recently, new resistance gene Xa21 was identified from Oryze longistaminata that is genetically far from cultivated rice Oryza sativa. Many scientists have interested in this gene for resistance breeding. Therefore, this experiment was conducted to evaluate the reaction of the Xa21 gene to Korean isolates of Xanthomonas oryzae pv. orzae. We also analyzed genome RFLP of Xanthomonas oryzae pv. oryzae to establish in vitro techniques for pathogenic differentiation. This experiment was conducted at the Division of Plant Pathology, National Agricultural Science and Technology Institute, Suwon in 1994 and 1995. The results are summerized as follows : 1. Virulence to Xa21 resistance gene were identified in KX085, KX090, KXO169, KX0342, KX0377, KX0378, KX0400 among the 38 Korean isolates of Xanthomonas oryzae pv. oryzae. 2. Symptom severity of IRBB21 that carries Xa21 resistance gene was clearly differentiated between susceptible and resistant reaction with more than 6cm difference in lesion length at seedling stage. There was more than 10 times difference in pathogen population in rice leaves inoculated between susceptible and resistant interactions. 3. Those isolates of Xanthomonas oryzae pv. oryzae that infected IRBB21 at seedling stage also showed virulence at both maximum tillering and flag leaf stages. 4. The Korean isolates of Xanthomonas oryzae pv. oryzae were classified into xoriiM positive group and xoriiM negative group. 5. The Korean isolates of Xanthomonas oryzae pv. oryzoe were clustered into two groups by genome RFLP when avirulence gene avrXa10 or transposable element pJEL101 was used as probe. The two lineage groups could be further classified into five subgroups. 6. Presence of xoriiM homolog and phylogeny generated by gemone RFLP with avrXa10 and pJEL101 were perfectly correlated with virulence to resistance gene Xa21.

Restriction fragments length polymorphism(RFLP)에 대한 기초 연구

임영선 建國大學校 大學院 1992 국내석사

RFLP에 관한 기초연구를 수행하기 위해 미토콘드리아 DNA를 제한효소로 잘라전기영동하여 상호비교하고 Genomic DNA를 분리하여 이미 밝혀져 있는 human DQα, 유전자 probe와 human urokinase-type plasminogen activator(uPA) probe를 사응하여 hybridization 시킴으로써 얻는 즉, southern blotting 상에서 나타나는 band의 위치를 상호비교한 실험들을 실시하여 얻은 결과들을 요약하면 다음과 같다. 1. Rat liver 3개로 부터 분리된 미토콘드리아 DNA는 약 18.5mg이었고, O.D 280nm에 대한 O.D 260nm의 비율은 약 1.93으로 분리된 DNA의 순도는 좋은 편이었다. 2. 1에서 분리된 미토콘드리아 DNA를 HindⅢ, KpnⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, XhoⅠ등 5가지 제한효소를 사용하여 절단하여 본 결과, XhoⅠ을 제외한 나머지 제한효소들에 의해 미토콘드리아 DNA가 절단되었다. 3. 혈액 5ml에서 Genomic DNA를 분리했을때 약 45㎍의 DNA를 얻을 수 있었고, 50ml에서는 약 300㎍의 DNA를 분리할 수 있었다. O.D 280nm에 대한 0.D 260nm의 비율은 약 2.08로 순도는 아주 좋았다. 4. 37℃에서 random-priming법으로 DIG-labeled DNA의 합성을 실시하고, 합성된 DIG-labeled DNA의 양을 측정하여 그린 labeling kinetic graph를 보면 2시간 incubation하는 동안 DIG-labeled DNA가 급격히 합성되고, 그 이후 labeling reaction은 정체기에 도달하여 20시간까지 합성이 아주 조금씩만 증가되었다. 5. DIG-labeled probe의 sensitivity와 specificity를 결정하기 위해 Dot blotting을 실시한 결과 homologous DNA의 경우 100fg까지도 detection이 가능하고, Genomic DNA의 single-copy gene 까지 detection할 수 있을정도로 높은 감도를 나타내었다. 6. 각종(Rat, Rabbit, Bovine)의 Genomic DNA률 EcoRⅠ으로 절단하여 전기영동한후 Southern blotting하여 uPA 유전자 probe로 detection만한결과 uPA의 RFLP양상은 각종간에 약간의 차이가 있었다. 7. Bovine Genomic DNA를 PstⅠ으로 절단하여 전기영동한후 southern blotting하여 uPA 유전자 probe로 detection한 결과 각 개체간에 있어서 uPA의 RFLP양상에 약간의 차이가 존재하는 것음 확인하였다. 8. Bovine Genomic DNA를 BamHⅠ으로 절단하여 전기영동한후 southern blotting하여 DQα 유전자 probe로 detection한 결과 7Kb, 4Kb, 0.96Kb의 3개의 major band와 2.7Kb의 minor band로 구성되어 있었고 각 개체간에서 DQα의 RFLP양상에는 전혀 차이점이 나타나지 않았다. This study was carried out to investigate the cleavage patterns of Mitochondrial DNA(mt DNA) by restriction endonuclease and DQα class Ⅱ MHC gene and uPA gene of the genomic DNA was also investigated by southern blot analysis using humane cDNA probes for DQα and uPA. The results obtained are summarized as follows : 1. 18.5mg of mitochondrial DNA was purified from three Rat liver. The ratio of O.D at 260nm to O.D at 280nm was 1.93, which may indicate a high purity. 2. When purified mitochondria DNA was digested with five restriction endonuclease(HindⅢ, KpnⅠ, PstⅠ, SHaⅠ, XhoⅠ) it was digested with four restrict ion endenuclease except XhoⅠ. 3. The Genomic DNA yield from 5ml and 50ml of blood were about 45㎍, and 300㎍, respectively. The ratio of O.D at 260nm to O.D 280nm was 2.08. 4. According to the result of albeling kinetic curve obtained with DIG-labeled DNA systheized by random-primed method at 37℃, the react ion reached at plateau after 2 hours. 5. Dot blot feet was carried to deterwine the sensitivity and specificity of DIG-labeled DNA. The DIG-system allowed the detection of 100fg homologous DNA and single-copy gene of genomic DNA which was good enough to be used as a routine method. 6. Southern blot hybridization of human uPA probe to genomic DNA of various species such aS rat, rabbit and bovine digested with EcoRⅠ revealed small differences in RFLP pattern among species. 7. Hybridization of uPA gene to genomic DNA of bovine digested with PstⅠ revealed some differences in RFLP patterns within species. 8. Hybridization of DQα class Ⅱ gene of bovine major histo-compatibility complex(MHC) to genomic DNA digested with BamHⅠshowed the 3 major band(7Kb, 4Kb, 0.96Kb) and 1 minor band(2.7Kb). The RFLP pattern of bovine DQα gene was the same within species.

Fusarium 속 7종에 대한 미토콘드리아 DNA의 RFLP 분석

임경혁 한양대학교 대학원 1996 국내석사

국내분리 돼지 전염성위장염 바이러스의 spike gene 염기서열과 RFLP 분석을 이용한 유전적 특성조사 및 혈청학적 관련성 분석

신웅 建國大學校 農畜大學院 1999 국내석사

Coronaviridae에 속하는 돼지 전염성위장염 바이러스(TGEV)는 자돈에서 구토, 수양성 설사, 탈수 등의 증상을 나타내며, 특히 2주령 미만의 자돈에서 높은 폐사를 일으키드로 국내 양돈업에 많은 경제적 피해를 초래하고 있다. 이 바이러스는 단일혈청형이며 분리주들간의 유전적 특성도 높은 유사성을 갖는 것으로 알려져 있으나, 국내 분리주들에 대한 유전자 분석자료가 미비하기 때문에 이 연구에서는 국내분리주들의 염기서열과 RFLP분석을 통해 이들의 유전적 특성을 조사하고 외국에서 보고된 표준주들과의 유전적 상관성을 조사하며 교차중화시험에 의한 혈청학적 관련성을 규명하고자 하였다. 국내분리 TGEV 밌 PRCV의 염기서열을 분석하기 위하여 중화항체를 유도하는 antigenic site A epitope가 포함된 spike glycoprotein gene[Purdue주 nucleotide sequence; 1539~2175에 해당되는 637bp]을 reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)로 증폭한 후 pGEM-T easy vector에 cloning하였다. 표준주인 Purdue, Miller 및 백신주인 Pyungtaik, 그리고 야외분리주인 175L 등 7주의 TGEV와 야외에서 분리된 SYN11, SYL-2 등 3주의 porcine respiratory coronavirus(PRCV) 등 총 13주에 대한 spike gene의 염기서열을 분석한 결과 Purdue주에 가까운 Pyungtaik, SYL-2 등 7주와 Miller주에 가까운 SYN11, V-1, 115L, 126L 두 가지의 group으로 나타났다. 한편 Woods는 PCR product를 제한효소 Sau3AI SspI으로 처리한 RFLP 분석을 이용하여 북미에서 분리된 TGEV들을 7개(Ⅰ~Ⅶ) group으로 구분하였으나 대부분의 국내분리주는 group Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ에 속하였다. 또한 분리주 SYN11, V-1은 염기서열 분석결과에서 homology가 높게 나타났던 Miller주와 함께 group V에 속하였고, 분리주 TGEV 중 표준주들에 낮은 homology를 보였던 2개의 분리주(l15L, 126L)는 RFLP 분석 결과 PRCV가 속하는 것으로 알려진 group Ⅶ에 포함되었다. 한편 위의 7가지 group과는 상이한 pattern의 한 group(WP)을 추가 확인 하였다. 또한 이 연구에 이용되어진 13개 분리주중 11개 분리주의 고도면역혈청을 제조하여 교차중화시험을 수행한 결과 유전적 특성과 밀접하게 연관되어지는 상관관계가 밝혀지지는 않았지만 분리주들간에 다소의 중화항체가의 차이가 있음을 확인하여 항원 다양성의 가능성을 인지할 수 있었다. 이 연구에서 얻어진 결과는 국내분리 TGEV의 유전적 특성과 교차중화시험에 의한 혈청학적 특성을 근거로 하여 국내에 존재하는 TGEV의 다양성을 확인하고 TGE 진단 및 예방연구에 유용하게 적용될 것으로 생각된다. Transmissible gastroenteritis virus(TGEV) belongs to the family Coronaviridae which causes vomiting, severe diarrhea, dehydration and a high mortality in piglets under 2 weeks of age. Therefore TGE brings about severe economic losses in pig farm. It is known that TGEV has single serotype, and genetic characteristics among isolates show a high homology. Since a few genetic data on the field isolates have been reported until recently, genetic characteristics of Korean isolates were investigated using nucleotide sequencing and restriction fragment length polymorphism(RFI,P) analysis. In addition cross neutralizing activity of the isolates was also examined. The spike genes[nucleotide sequence of Purdue strain; 1039~2175, 6371bp] including antigenic site A epitope of TGEV and porcine respiratory coronavirus(PRCV) isolates were amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and cloned into the pGEM-T easy vector. Judging from nucleotide sequence homology analysis of 10 strains of TGEV and 3 strain of PRCV, the isolates could be classified into two groups, Purdue type and Miller type. On the other hand, Woods(1997) divided TGEV isolates of north America into 7 groups(?~?) by RFLP analysis of spike gene using restriction enzymes Sau3AI and SspI. By using the RFLP analysis most of the field isolates belonged to Woods' group ?, ?, ?. Interestingly, the isolate WP did not belong to any of above 7 groups. In this study, there was no close correlation between cross neutralizing activity and molecular characteristics of the field isolates. But considerable differences in cross neutralizing titer were recognized among isolates, )which indicate that there is some possibility of antigenic diversity of TGEV and PRCV. The results of this study could be applied usefully for the diagnosis and prevention research on TGE.

Phylogenetic analysis by RFLP and sequencing of Mitochondrial DNA on a Korean Population : RFLP와 염기서열결정법에 의한 한국인 미토콘드리아 DNA의 계통 분석

이진영 Inje University 2003 국내박사

목적 미토콘드리아 DNA (mtDNA)는 핵 이외의 영역에 존재하는 유일한 DNA 분자이며, 그 유전적 표지자는 인간 진화, 기원, 이주 형태, 인종간 구별에 있어서 매우 중요하다. mtDNA의 제한효소 분석은 이러한 인종간의 진화적 관계를 분석하기 위한 유력한 방법으로 최근 몇 년 동안 200여 인종을 대상으로 mtDNA변이에 대한 많은 연구가 이루어져 왔으나 한국인에 대한 연구는 아직 많이 부족한 실정이다. 본 연구는 혈연관계가 아닌 한국인 집단으로부터 noncoding D-loop영역의 과변이 부위 I (HVS-I)을 포함한 upstream에서 mtDNA 다형성과 염기 다양성을 분석하고 이를 한국 주변의 몇몇 인종과 비교하고자 하였다. 방법 본 연구에서는 서로 연관성 없는 430명의 건강한 한국인을 대상으로 미토콘드리아 유전자 중 noncoding D-loop 영역의 HVS-I 지역과 그 upstream 영역에서 PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)와 염기서열분석을 하였다. 이 영역 (mt13715-16504)을 증폭하여 얻은 2,790 염기쌍 (base pair, bp)의 PCR산물에 각각 6가지의 다른 제한 효소 (Hinf I, Hae Ⅲ, Alu I, Dde I, Mbo I, Rsa I)를 처리하여 RFLP분석을 시행하였다. 그 결과를 PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony, Version 4.0) computer package를 이용해서 분석하였다. 나누어진 haplotype을 좀 더 상세히 조사하기 위하여, 각 haplotype을 대표하는 선택된 개체들로부터 mtDNA의 선택 영역 (2,790 bp) 모두를 염기서열 분석하였다. 이 결과를 DNASIS 프로그램 (Version 2.5)과 MEGA 프로그램 (Molecular Evolution Genetic Analysis, Version 2.1)을 사용하여 Anders-on이 분석한 염기서열 및 일본인의 염기서열과 비교하였다. 결과 PCR-RFLP의 PAUP 결과 한국인에서 38개의 mtDNA haplotype (Hap 1-38)이 관찰 되었고 이들은 유연관계검사에서 11개의 haplogroup으로 분석되었다. 성별 분석에서 haplogroup 7은 남성에서 82.8%이고 여성에서 17.2%였으나, haplogroup 2는 반대로 여성에서 55.6%, 남성에서 44.4%로 나타났다. 또한, 개체의 염기서열을 Anderson이 결정한 염기서열과 비교한 결과 선택된 영역에서 59개의 다른 염기 부위가 관찰 되었다. 각 변이 부위에서 대부분의 염기 변화는 10% 미만 이었으나, 14783 (Cyt b region), 15043 (Cyt b region), 15301 (Cyt b region), 15326 (Cyt b region), 16223 (HVS-I region), 16362 (HVS-I region) 부위에서의 염기 변화는 각각 81.3%, 81.3%, 75.0%, 100.0%, 68.8%, 62.5%로 나타났다. 치환의 유형에서 이행형 치환이 전환형 치환보다 훨씬 우세하였고 삽입/결실은 전혀 관찰되지 않았다. 또한, 제 1 과변이 부위에서 3개의 다형부위 (A16240C, A16351G, G16384A)를 새롭게 발견했다. 이러한 변이 중 본 연구에서는 16351 부위에서 전환형 치환 (A→C) 대신 이행형 치환(A→G)이 발견되었다. 그리고, 16240 부위에서 전환형 치환 (A→C)과 16384 부위에서 이행형 치환 (G→A)을 각각 발견했다. 결론 본 연구에서 한국인 내에서 총 38개의 다른 haplotype이 관찰되어 한국인 집단의 상 대적인 동질성을 고려한다면 다소 높게 나타났으나 빈도별로 볼 때 haplotype 1의 매우 높은 빈도와 기타 대부분 haplotype의 낮은 빈도를 고려한다면, 그리 놀랄만한 결과는 아닌 것으로 여겨진다. 다형의 부위는 선택 영역에서 일정하지 않게 분포되어 있었고, 각 부위의 빈도는 다양했다. 염기서열 분석결과, 한국인 mtDNA의 연관성은 지역 특이성을 보이며, superhaplogroup M에 완전히 포함되는 것으로 추정되었다. 뿐만 아니라 haplogroup M7은 동부 아시아 중에서도 주로 남쪽에 분포하고 있는 반면, 그의 종속 그룹인 M7a와 M7b2는 한국인과 일본인에서 특징적인데, 본 연구에서도 동일한 결과를 보여주었다. 본 연구는 동양인의 계통연구를 위한 기초 자료가 될 것으로 여겨지며 향후 한국인의 미토콘드리아 다형성에 대한 보다 심도 있는 연구와 다른 아시아인의 유용한 유전학적 정보를 제공해 줄 것으로 기대된다.