Carbon monoxide inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis by suppressing NF-κB-dependent NFATc1 expression : 일산화탄소(CO)에 의한 파골세포 분화 조절 기전 연구: RANKL에 의한 NF-κB 활성화 및 NFATc1의 발현 억제

Bak, Sun-Uk 강원대학교 대학원 2013 국내석사

RANKL에 의한 신호전달은 대식세포가 파골세포로 분화하는데 필수적이다. 일산화탄소(CO)는 헴산화효소에 의해 헴이 분해되는 과정에서 생성되는 내생적인 기체 분자이며 항염증과 항산화 효과를 가지고 있다. 최근 이 분자는 류마티스 관절염이 걸린 생쥐에서 항염증 기전을 보였지만 파골세포의 분화에서 어떠한 조절을 하는지에 대해서는 아직까지도 명확하게 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 CO를 방출하는 화학분자인 COMR-2가 RANKL에 의해 파골세포 분화에 미치는 효과와 작용기전에 대한 연구를 수행하였다. RANKL로 자극한 대식세포는 파골세포로 분화되었고 뼈의 흡수가 효과적으로 일어났다. 이러한 파골세포의 분화와 뼈의 흡수는 CORM-2의 전 처리에 의해 유의성 있게 저해되었다. 또한 CORM-2는 파골세포에서 특이적으로 발현되는 tartrate resistant acid phosphatase, cathepsin K, osteoclast-associated receptor의 발현이 저해 하였다. 뿐만 아니라, 이들 유전자의 발현에 핵심적인 전사인자인 NFATc1의 발현도 저해되었다. CORM-2는 NF-κB의 활성화와 관련된 IKK 인산화 및 IkBα의 인산화와 분해, 그리고 NF-κB가 세포질로부터 핵으로의 이동 등을 효과적으로 억제하였다. 더 나아가서 CORM-2는 RANKL에 의해 유도되는 NFATc1의 전사조절 부위인 프로모터에 NF-κB가 결합되는 것을 효과적으로 억제하였다. 이러한 연구결과는 CO에 의한 파골세포 분화억제 효과는 RANKL에 의해 유도되는 IKK의 활성화, NF-κB의 핵이동, NFATc1의 발현, 파골세포 표지인자 발현 등을 효과적으로 억제함에 기인됨을 시사하고 있다. 따라서 CO는 파골세포분화로 유발되는 골다공증 및 염증성 관절염 치료제로 활용될 수 있음을 제시하고 있다. Signaling by receptor activator of NF-κB (nuclear factor-κB) ligand (RANKL) is essential for differentiation of macrophages into osteoclasts. Carbon monoxide (CO), an endogenous gas molecule from breakdown of heme by hemeoxygenase, has been known to mediate anti-inflammatory and anti-oxidant effects. Recently, this molecule showed to mediate anti-inflammatory effects in a rheumatoid arthritis mouse model. However, the regulatory effects of CO on osteoclastogenesis have not been clearly elucidated. We here investigated the effects of CO on RANKL-induced osteoclastogenesis using the CO-releasing molecule CORM-2. We found that treatment of CORM-2 inhibited RANKL-induced differentiation of macrophages into osteoclasts and subsequent bone resorption. CORM-2 also decreased RANKL-induced expression of tartrate resistant acid phosphatase, cathepsin K, and osteoclast-associated receptor, which are well-known marker genes for osteoclasts. Moreover, CORM-2 inhibited the RANKL-induced expression of nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 (NFATc1), which a key transcription factor of osteoclastogenesis. During the RANK/RANKL signaling, CORM-2 inhibited nuclear translocation of NF-κB p65 subunit, which was correlated with its inhibitory effect on IκB kinase (IKK) phosphorylation and IκBα phosphorylation and degradation, but not ERK, p38, JNK and AKT. Furthermore, CORM-2 decreased RANKL-mediated bind of NF-κB to the promoter region of NFATc1, indicating that CO blocks NFATc1 expression via inhibition of IKK activation. These data suggest that CO inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis of cultured macrophages by IKK-dependent NF-κB-mediated osteoclastogenic signaling. Our results suggest that CO has the potential for treatment of inflammatory arthritis.

Mechanistic Analysis of Eriodictyol on Bone loss

이주현 숙명여자대학교 대학원 2012 국내석사

Thanks to growing up with science, our human life span is longer than it has been in times past, and we are going to move from an “Aging society” into an “Aged society”. That means, it appears there will be an increase in many diseases related to this situation. Among them, bone disease is increasing, especially osteoporosis. Osteoporosis comes from many causes, for example, from an imbalance of cells, hormones and vitamin D3. For a number of reasons, lower bone mineral density is deeply connected to osteo-immunology. In this study, I focused on the bone remodeling process that is controlled by two types of cells, the osteoblast and osteoclast. The osteoblast is responsible for the synthesis of bone, and the osteoclast is responsible for bone resorption. In the bone remodeling process there is a balance between the number of ostoclast and osteoblast cells. If the rate of osteoclast is higher than osteoblast, bone mineral density (BMD) will be decreased, leading to osteoporosis. We call this process “Osteoclastogenesis”. In osteoclastogenesis, the most important factor is RANKL which is a ligand of RANK. In this paper, I used bone marrow macrophage cells (BMMs) from the bone marrow of mice with macrophage colony stimulate factor (M-CSF). Then BMMs were treated with RANKL that differentiated them to pre-osteoclast or mature osteoclast. Eriodictyol, which is a natural flavonoid compound, was the focused a mechanistic analysis of eriodictyol on bone loss via osteoclastogenesis. Eriodictyol(5,7,3`4`-tetrahydroxyflavanone) is extracted from rosehip or citrus fruits like lemon peel. It is also known as a bioflavonoid or vitamin P. According to other papers, bioflavonoids help to increase the work of vitamin C, which includes the synthesis of collagen, anti-inflammatory, anti-bacterial and anti-oxidant functions. From one of them, I suspected that eriodictyol is able to influence anti-oxidant functions, and so I tried to study its effects on osteoporosis. Eriodictyol is an aglycon of eriocitrin that is consumed and absorbed by enzymes or acidic hydrolysis in the liver. Based on the study, I conducted tests to check its effects on osteoclast formation. The result was that eriodictyol inhibited osteoclast formation about 50% higer than eriodicitrin of the same concentration. Eriodictyol (IC50=10M) dose-dependently inhibited RANKL-induced osteoclast formation and affected each stage on treatment day, especially the late stage more than early. Through RT-PCR assay, it attenuated osteoclast differentiation on the osteoclast marker gene like CTR and Cathepsin K. Eriodictyol also perfectly blocked RANKL-induced bone resorption on dentin. To check the expression strength of signals on western blotting, I detected some pathways related to osteoclastogenesis. Thus, eriodictyol suppressed RANKL-induced NFATc1, COX-2, p38 and ERK expression. Besides, eriodictyol rescued NFATc1 activation about 70% on the overexpression test. Eriodictyol inhibited LPS-induced osteoclast formation just as RANKL- induced it. It was based on these results that I conducted an in vivo test. First of all, ICR mice were directly injected LPS on calvaria for acute inflammation. Then they were injected with eriodictyol (12.5mg/kg) with corn-oil by i.p for some days. After several days, the calvaria were extracted for TRAP stain, which is checked to determine the range of inflammation. As a result, I suspected that eriodictyol might block bone loss from LPS-induced inflammation. The other in vivo test is OVX, the goal of which is the recovery of BMD or BMC on ovariectomied mice when treated with eriodictyol. After ovariectomy, one group was orally treated by eriodictyol (12.5mg/kg), the others were treated with just a neutral solution. I then checked for any changed BMC level between the two groups. On investigation the eriodictyol treated mouse group showed a recovery of leg BMC level. Therefore these results suggest that eriodictyol regulates bone loss. Recently it was discovered that eriodictyol is a TRPV1 receptor antagonist, which is connected with neuro-pain, like capsazepine. So I examined what is different between eriodictyol and other TRPV1 receptor antagonists. Other TRPV1 receptor antagonists worked similarly to eriodictyol in some experiments. Only eriodictyol, however, affected the RANKL-induced mature osteoclast form, which was changed from mature to pre-osteoclast. After stopping treatment with eriodictyol, the pre-osteoclast grew up mature again. Because eriodictyol does not induce apoptosis, it has a temporally limited effect on mature osteoclast. For these reasons, I concluded that eriodictyol blocks RANKL- or LPS-induced osteoclastogenesis, and it also interrupts bone loss. I suggest that eriodictyol will be used as a therapeutic drug for osteoporosis in the future.

RANKL로 유도한 osteoclastogenesis의 조절 인자로서 Tmem173의 새로운 기능

최충현 전북대학교 일반대학원 2016 국내박사

Transmembrane protein 173 (Tmem173), identified as a growth inhibitor associated with major histocompatibility complex (MHC) class II, mediates the transduction of cell death signals in B lymphoma cells. Tmem173 is also known as a potential stimulator for interferon (IFN)-β, which is essential for innate immune response induction in monocyte/macrophage cells, and plays the role of negative feedback controller for receptor activator of nuclear factor B ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation of monocytic macrophage cells, which is mediated by c-Fos. Accordingly, it is hypothesized that Tmem173 negatively regulates osteoclastogenesis through IFN-β induction and growth inhibition of osteoclast progenitor cells expressing MHC class II molecules. This study explored the regulatory roles of Tmem173 on RANKL-induced osteoclast differentiation of murine monocytic macrophage/osteoclast progenitor RAW 264.7 cells and the cellular mechanisms therein. As the results, overexpression of Tmem173 inhibited RANKL-mediated osteoclastogenesis of RAW 264.7 cells. Overexpression of Tmem173 also suppressed pit formation in RANKL-treated RAW 264.7 cells with the attendant reduction in the levels of osteoclast-specific genes including tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), cathepsin K, and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Similarly, the induction of Tmem173 down-regulated the RANKL-induced activation of osteoclast-specific transcription factors such as nuclear factor (NF)-κB, c-Fos, and nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1 (NFATc1), and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) including extracellular signal-regulated kinase (ERK) and p38 MAPK in RAW264.7 cells. The inhibition of RANKL-mediated osteoclastogenesis by Tmem173 was regardless of cell viability and IFN-β expression of RANKL-stimulated macrophages. Further, treatment with plant extracts such as JAMI1 through 5 up-regulated the expression of Tmem173, whereas it reduced TRAP expression and pit formation in RANKL-stimulated macrophages. Interestingly, exogenous addition of osteoprotegerin (OPG) increased the expression of Tmem173 in a dose-dependent manner. Final study, Tmem173-interacting protein complexes in control vector- or Tmem173-transfected RAW264.7 cells were determined by immunoprecipitation and 2-DE analyses, the levels of several proteins identified as HNRNPH3, HNRNPDL, HNRNPA3, and HNRNPD were greater in the control than Tmem173-overexpressed cells. Collectively, the current findings demonstrate that the expression of Tmem173 negatively regulates RANKL-stimulated osteoclastogenesis by inhibiting signaling molecules required for osteoclast differentiation and maturation rather than by down-regulating IFN-β. It is also suggested that Tmem173 possibly communicates with the RANKL-RANK signaling/OPG-stimulated signaling network in osteoclastogenesis.

RANKL transiently facilitates tooth eruption and osteoclastogenesis

Puttharuks, Pharitporn Graduate School, Yonsei University 2019 국내박사

Purpose The objectives of this study were to investigate the effect of exogenous injected local receptor activator of nuclear factor-kappa ligand (RANKL) inducing osteoclastogenesis during the tooth germ eruption and alveolar bone development in mice. Materials and Methods On postnatal 3(PN3), 40 fetal mice were randomly divided into the control and experiment groups. In experiment groups, subcutaneous injection of RANKL (0.4 mg/kg) into inferior mandible areas of mice daily until PN11. On day 7, 9, 11 and 13 of 10 mice (control 5 animals and experiment 5 animals) were sacrificed, respectively. Micro-CT reconstructed images of the lower incisors and molars were used to survey the level of tooth eruption. Longitudinal sections of the mandibles were prepared for H & E and TRAP staining to perform the TRAP-positive cell counting. Statistical comparisons were carried out using Student’s t-tests (P < 0.01). Results The incisal tooth eruption of mice on day 11 and 13 in RANKL group appeared significantly greater than in PBS (phosphate buffered saline) group. The first molar tooth eruption in the RANKL group was slightly faster than in PBS group on day 9 and 11(P < 0.01). RANKL group showed the significantly large number of multinuclear TRAP-positive osteoclasts on day 7, 9 and 11 (P < 0.01). Conclusions The facilitation of tooth eruption probably is mediated by exogenous RANKL. However, this effect expressed transiently of tooth eruption process. Short-term local administration of RANKL may be a method by which to facilitate the tooth eruption in mice with a delayed tooth eruption. 최근에receptor activator of nuclear factor-ΚB (RANK)와 그 리간드 (RANKL)의 신호가 파골 세포 형성(Osteoclastogenesis)에 중추적인 역할을 하는 것으로 보고되었다. RANKL의 발현과 치배 및 치조골 발달 중에서의 이 분자의 역할을 평가하는 많은 연구가 있지만, 우리는 간단하고 안전하게 실험을 할 수 있도록 이 모델 연구를 확립하기로 결정했다. 본 연구의 목적은 쥐의 하악골 모델에 외인성으로 주입된 RANKL이 치배 분화 및 치조골 발달 과정에서 파골 세포 생성 (Osteoclastogenesis)에 미치는 효과를 알아보기 위함이다. 본 연구에서는40 마리의 태어난지3일된 쥐를 RANKL군과 PBS (phosphate buffered saline) 군으로 나뉘었다. RANKL군에서는 RANKL (0.4 mg/kg)을 매일 하악 부위에3일부터11 일까지 피하 주사하였다. 7, 9, 11 그리고 13 일째에는 10 마리(RANKL군 5마리,PBS 군 5마리)를 각각 희생시켰다. 치아의 Micro-CT 영상을 사용하여 치아 맹출을 조사하였다. 전치 맹출의 양은 전단면에서 치조골까지의 거리를 이용해서 측정하였다, 제 1 대구치 맹출의 양은 교합면의 가장 높은 지점 (most occlusal tip)에서 하악의 능선 (Inferior mandibular ridge)까지의 거리를 이용해서 측정하였으며 이때 측정치는 치관의 장축과 평행을 이룬다. TRAP 양성 파골 세포(TRAP-positive cells) 개수를 측정하기 위해 하악 종단면도 H & E 및 TRAP 염색을 하였다. 통계적 비교는 Student 's t-test를 사용하여 수행되었다 (P <0.01). RANKL 군에서 전치 맹출은 11 일과 13 일째에 PBS 군보다 유의하게 더 많이 일어났다. RANKL 군의 제 1 대구치 맹출은 9 일과 11 일째에 PBS 군보다 약간 빨랐다 (P≤0.01). 두 그룹 간의 TRAP 양성 파골 세포수는 13 일째에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았지만 7, 9, 11 일째에는 RANKL군에서 상당량의 TRAP 양성 파골 세포가 관찰되었다. 결론적으로 치아의 맹출 및 치조골 발달의 촉진은 아마도 외인성 RANKL에 의해 매개되는 것 같다. 그러나 이 효과는 치아의 분화 과정을 일시적으로 나타냈다. RANKL의 단기간 국소 투여는 비정상적인 치아 맹출을 가진 쥐의 치아 맹출을 촉진시키는 방법일 수도 있다.

RANKL과 항체의약품 Denosumab 상호작용에 대한 구조 연구

손지영 건국대학교 대학원 2015 국내석사

Receptor activator of nuclear factor(NF)-κB ligand(RANKL) and its cognate receptor RANK is an essential mediator of osteoclast function and survival. Denosumab, a fully human monoclonal antibody against RANKL, inhibits osteoclastogenesis and is widely used not just for the treatment of osteoporosis, but for cancer. Here, we report the crystal structure of the Denosumab Fab fragment in complex with RANKL at resolution of 2.8 Å. This study revealed the key residues for Denosumab/RANKL interaction and suggested the mechanism of RANKL inhibition by blocking the approach of RANKL to RANK on membrane. These results also suggest potential residues for increasing affinity of Denosumab with RANKL. The occasional emergence of pandemic influenza viruses which result in serious disease made evident the need for faster and higher-yield methods for the production of the influenza vaccine. Expression of fragments of the hemagglutinin(HA) protein in prokaryotic systems can be most efficacious strategy for the manufacture of large quantities of influenza vaccine in a short period of time. Using X-ray crystallography, we show that the receptor binding domain(RBD) of HA refolds spontaneously into its native, immunogenic structure even when expressed in an unglycosylated form in Escherichia coli. In the 2.8 Å structure of the HA-RBD, the data provide a structural basis for the rapid production of influenza vaccines in E. coli. Myotubularin-related proteins are a large family of phosphatases that have the catalytic activity of dephosphorylating the phospholipid molecules phosphatidylinositol 3-phosphate and phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Each of the 14 family members contains a phosphatase catalytic domain, which is inactive in six family members owing to amino-acid changes in a key motif for the activity. All of the members also bear PH-GRAM domains, which have low homologies between them and have roles that are not clear. Here, the cloning, expression, purification and crystallization of human myotubularin-related protein 3 encompassing the PH-GRAM and the phosphatase catalytic domain are reported. Preliminary X-ray crystallographic analysis shows that the crystals diffracted to 3.30 Å resolution at a synchrotron X-ray source. The crystals belonged to space group C2, with unit-cell parameters a= 323.3, b= 263.3, c= 149.4Å, β= 109.7°. RANKL과 수용체 RANK는 파골세포의 기능과 생존에 필수적인 매개체이다. Denosumab은 RANKL과 결합하여 파골세포 생성과정을 저해하는 골다공증 완전인간 단일클론 항체 치료제이다. 본 연구는 단백질 결정학을 통해 RANKL과 결합한 Denosumab Fab 영역의 복합체의 구조를 2.8 Å의 해상도로 규명하였다. 구조 연구를 통하여 RANKL과 Denosumab의 상호작용에 중요한 잔기를 확인하고 Denosumab이 RANKL과 세포막의 RANK로의 결합하는 것을 막는 정확한 저해 작용기작을 이해할 수 있었다. 이러한 결과를 통해서 RANKL과 Denosumab의 결합력을 증가시킬 가능성이 있는 잔기를 제시하였다. 심각한 질병을 초래하는 유행성 독감 바이러스의 출현은 빠르고 고효율의 인플루엔자 백신 생산 방식을 요구한다. 원핵생물에서 헤마글루티닌(HA) 단백질의 단편을 발현시키는 것은 인플루엔자 백신을 단시간에 높은 효율로 대량 생산이 가능하게 할 것이다. X선 결정학을 통해 대장균에서 glycosylation 없이 발현된 HA 수용체 결합 영역(RBD) 단백질이 원래의 항원성을 갖는 형태로 refolding되는 것을 확인하였다. HA-RBD의 구조를 2.8 Å의 해상도로 규명하였고, 이를 통해 대장균을 이용한 인플루엔자 백신의 생산 가능성을 뒷받침하는 구조적 근거를 제시하였다. Myotubularin-related protein(MTMR)은 탈인산화효소의 한 종류로 인지질 분자인 PtdIns 3-phosphate와 PtdIns 3,5-bisphosphate를 탈인산화시키는 활성을 가지고 있다. 14가지 family member들은 모두 탈인산화 활성에 관한 영역을 가지고 있지만 그 중 6개의 family member는 활성을 위한 중요 모티프의 아미노산 서열의 변화로 활성이 없는 영역을 가지고 있다. 또한 모든 MTMR들은 서로 유사성이 낮은 PH-GRAM 영역을 가지고 있으나 정확한 역할은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 인간 MTMR3의 PH-GRAM와 효소활성 도메인을 구조연구를 위해 복제, 발현, 정제, 결정화 단계까지 진행하였다. X선 회절 실험을 통해 3.3 Å 해상도로 데이터를 모았고, 공간군(space group)은 C2, 단위세포상수(unit-cell parameter) a=323.3, b= 263.3, c=149.4Å, β=109.7° 를 얻었다.

RANKL이 생쥐 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포의 증식, 생존 및 가슴샘세포 형성촉진인자 생성에 미치는 효과

이충원 부산대학교 대학원 2003 국내박사

가슴샘은 골수에서 유래한 T 전단계세포를 성숙한 T 세포로 분화시키는데 관여하는 중추면역기관이다. 가슴샘 미세환경은 가슴샘세포의 증식과 분화 및 성숙에 관여한다. RANKL (receptor activator of nuclear factor-κB ligand)은 TNF (tumor necrosis factor) superfamily에 속한 type II transmembrane protein으로서, 주로 수지상세포에서 발현되는 RANK (receptor activator of nuclear factor B)와 결합하여 수지상세포의 생존을 촉진시키고, 혈구형성전단계세포로부터 뼈파괴세포로의 분화를 유도할 뿐만 아니라, T 세포의 활성과 T 세포 및 B 세포의 성숙에 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 본 연구에서는, 재조합 수용성 RANKL 단백질을 생산하여, RANKL이 생쥐 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포에 미치는 효과를 분석하였다. 수용성 재조합 RANKL을 제조하기 위해, RANKL의 extracellular domain (Asp76-Asp316)에 대해 역전사중합효소연쇄반응을 수행하여 생쥐의 가슴샘으로부터 RANKL 유전자를 증폭하였다. 증폭된 RANKL 유전자를 pET-32b expression vector에 삽입하여 E.coli strain BL21/DE3에 형질전환시킨 후 단백질을 과발현시키고, Ni-NTA agarose gel을 이용하여 정제하였다. 생쥐 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포에서 RT-PCR 분석을 통해 RANKL 및 RANK 유전자의 발현을 확인하였다. RANKL은 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포 및 가슴샘세포의 증식을 촉진하였을 뿐만 아니라 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포 및 가슴샘세포의 세포사멸을 유도시킨 다음 RANKL을 처리하였을 때 Bcl-2, Bcl-xL mRNA의 발현 증가와 Bax mRNA의 발현 감소를 확인할 수 있었다. 또한 RANKL은 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포에서 가슴샘세포형성촉진인자인 IL-6, IL-7 및 GM-CSF mRNA의 발현을 현저하게 증가시켰다. 따라서 본 연구의 결과는 RANKL이 생쥐 가슴샘 피막밑/겉질 상피세포의 증식 및 생존에 중요한 역할을 수행할 뿐만 아니라 IL-6, IL-7 및 GM-CSF의 생성을 촉진시킴으로서 가슴샘에서 T 세포의 증식 및 분화과정에 중요한 역할을 수행할 수 있음을 시사해준다. The thymus is the central lymphoid organ for development of bone marrow-derived precursor cells into mature T-cells. The thymic epithelial cells provide the specialized microenvironment for the proliferation, differentiation, and maturation of the immature T-cells, thymocytes. Receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) is a type II membrane protein of the TNF family and plays a critical role in the regulation of osteoclastogenesis. RANKL expressed on osteoblastic stromal cells has been shown to support osteoclast differentiation originated from hematopoietic precursors. Interestingly, RANKL is also expressed on cells of the immune system including T cells and dendritic cells. This study was performed to investigate the effect of RANKL on the proliferation and survival of mouse thymic subcapsular/cortex epithelial cells. Following the transformation of BL21/DE3 cells with the expression construct, the overexpression of sRANKL protein was induced by the addition of 1 mM IPTG and the overexpressed sRANKL protein was purified using Ni-NTA agarose gel. The results showed that the mouse subcapsular/cortex epithelial cells expressed RANKL and RANK. The stimulatory effect of sRANKL on the proliferation of mouse thymic subcapsular/cortex epithelial cells and thymocytes was observed. It was also found that sRANKL promoted survival of the thymic subcapsular/cortex epithelial cells and thymocytes, and enhanced the anti-apoptotic gene (Bcl-2 and Bcl-xL) expression but inhibited the pro-apoptotic gene (Bax) expression, when tested in the subcapsular/cortex thymic epithelial cells after H_(2)O_(2) treatment. sRANKL appears to upregulate IL-6, IL-7, and GM-CSF expression in the thymic subcapsular/cortex epithelial cells. In conclusion, these results indicate that RANKL stimulates the proliferation and survival of the thymic epithelial cells as well as thymocytes, and enhances the thymopoietic factor-production of the thymic subcapsular/cortex epithelial cells.

Inhibition of bone metastasis by receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand (RANKL) immunization on breast cancer

김보라 전남대학교 대학원 2020 국내박사

Bone is the most common target organ of breast cancer metastasis. At present, accumulating evidence suggests that inhibition of the receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) does not only induce an increase in bone mass and strength but also has anti-tumor effects. Here, I proposed a strategy using mutated RANKL (RANKLM) as an immunogen for active immunization to induce anti-cytokine antibodies for the immune therapy of bone metastatic cancer. I then investigated whether the produced RANKL antibody could inhibit osteolytic bone metastasis of breast cancer in a murine model. The reduced intraosseous growth of MDA-MB-231 cells in vivo, as a result of RANKLM treatment, was correlated with decreased osteolytic lesions and hindered tumor progression. In addition, RANKLM treatment led to significant improvements in overall survival and in the skeletal metastasis of tumor-bearing mice. I confirmed inhibition of osteoclast activities in xenograft models injected with a recombinant mutant RANKL, demonstrating that RANKLM immunization inhibits osteolytic bone metastasis in breast cancer. This study suggests that vaccination with an inactive recombinant mutant RANKL could be investigated for its ability to prevent bone metastasis of breast cancer. 뼈는 유방암에서 가장 흔한 전이 기관으로 알려져 있으며 흔한 표적 기관으로 알려져 있으며 RANK 수용체의 활성 억제를 통해 유방암의 골전이 억제 효과가 시사되었다. 따라서, 본 연구에서는 유방암의 골 전이 억제 및 이의 치료를 위한 면역 요법으로서 돌연변이 RANKL을 면역원으로 사용하여 항-사이토 카인 항체 형성을 유도하고, 유방암 골 전이 동물 모델에서, RANKL로 인해 생성된 항체가 유방암의 골 용해성 전이를 억제할 수 있는지에 관하여 연구하였다. 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포 배지의 처리에 따라 골모세포주 MC3T3는 NF-κB 신호 전달을 통해 GDF-15의 배출을 촉진하였고, 동물실험에서 돌연변이 RANKLM 처리는 MDA-MB-231 세포주가 주입된 골전이 동물 실험 모델에서 GDF-15의 발현과 골용해 병변의 억제 그리고 종양 성장의 감소를 유도하였다. 특히 RANKLM 처리는 마우스 생존률의 증가를 유도하였으며 RANKL 항체의 생성에 따라 유방암의 골 전이를 억제하였음을 확인하였다. 결론적으로, 돌연변이 RANKL에 의한 면역요법은 유방암의 골 전이 억제를 위한 유용한 방안이 될 수 있음을 시사한다.

Inhibition of RANKL-induced osteoclastogenesis by novel mutant RANKL

장유리아 조선대학교 대학원 2020 국내석사

Purpose: The critical role of the protein triad, RANK–RANKL, in osteoclastogenesis has made their binding an important target for the rational development of drugs against osteoporosis. Recently, it is reported that leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 4 (LGR4, also called GPR48) is another receptor for RANKL. LGR4 competes with RANK to bind RANKL and suppresses canonical RANK signaling during osteoclast differentiation. Methods: Based on this, the RANKL was mutated the point in based on the crystal structure of the complex of RANKL and its counterpart receptor RANK and it is investigated whether the LGR4 signaling without RANK signal could be involved in inhibition of osteoclastogenesis. As a proof of concept, mutant RANKL led the stimulation of GSK-3beta phosphorylation, inhibition of NFATc1 translocation and mRNA expression of TRAP and OSCAR and TRAP activities and bone resorption, subsequently in RANKL-induced mouse models. Results :The results demonstrated that the mutative RANKL has a possibility to therapeutic agent for osteoporosis to inhibit the RANKL-induced osteoclastogenesis by comparative inhibition with RANKL in which lacks toxic side effects for the treatment of osteoporosis. 목적: osteoclastogenesis에서 단백질 트라이어드 RANK-RANKL의 중요한 역할은 골다공증에 대한 약물의 합리적인 개발을 위해 그들의 결합을 중요한 목표로 만들었습니다.최근 leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 4 (LGR4, GPR48로도 불림)가 RANKL에 대한 또 다른 수용체 인 것으로 보고되었다. LGR4는 RANKL에 결합하여 파골 세포 분화 동안 정식 RANK 신호 전달을 억제하기 위해 RANK와 경쟁한다.이를 바탕으로 RANKL과 RANKL 복합체의 결정 구조를 기반으로 RANKL을 변이시켜 RANK 신호가없는 LGR4 신호 전달이 파골 세포 생성 억제에 관여하는지 여부를 조사 하였다. 실험 및 방법: 개념 증명으로서, 돌연변이 RANKL은 RASKL- 유도 된 마우스 모델에서 GSK-3β인산화의 자극, NFATc1 전좌의 억제 및 TRAP 및 OSCAR의 mRNA 발현 및 TRAP 활성 및 골 흡수를 주도 하였다. 결과: 돌연변이 RANKL이 골다공증 치료제에 대한 부작용이 결여 된 RANKL에 의한 비교 억제에 의해 골다공증 치료제가 RANKL에 유도 된 파골 세포 형성을 억제 할 가능성이 있음을 입증 하였다.분석결과 골 형성이 가장 빠르게 촉진되었음을 관찰할 수 있었고, Type-1 Collagen 및 Osteocalcin 단백질 발현의 증가를 유도하였음을 알 수 있었다.

파골세포의 부착 및 이동과 RANKL에 의해 유도되는 Monokine induced by interferon-gamma (MIG)의 연관성에 대한 연구

곽한복 조선대학교 대학원 2005 국내박사

골(骨)은 일생 동안 끊임없이 생성과 소멸을 반복하는데 골 밀도는 인체 내의 내분비 호르몬 (hormone)과 국지적인 염증 유발인자 (Inflammatory cytokine)에 의해 조절된다고 보고 되었다. 골 밀도를 조절하는 중요한 두 가지 세포 중에 조골세포 (Osteoblast)는 골기질의 합성으로 뼈를 형성시키고 반면 파골세포 (Osteoclast)는 조골세포에 의해 만들어진 골 기질을 흡수하는 역할을 한다. 그러나 과도하게 파골세포의 활성이 높아지면 골 밀도가 감소하게 되어 골다공증 및 류마티스 관절염과 같은 골 질환이 유발된다. RANKL는 파골세포의 분화와 활성에 없어서는 안될 중요한 인자로 RANKL에 의한 파골세포의 분화는 다양한 유전자 (gene)의 발현에 의해 유도된다. 따라서 RANKL에 의해 유도되는 유전자를 규명하는 것은 파골세포의 분화와 활성을 유도하는 기작 (mechanism)을 알 수 있는 중요한 일이라 할 수 있다. 파골세포의 전구세포 (Osteoclast precursor)를 RANKL로 자극하여 파골세포의 분화를 유도하였고, cDNA microarray 기법을 사용하여 파골세포의 분화 과정에서 유도되는 유전자를 확인 하였다. 그 결과 RANKL에 의해 유도되는 유전자 중에서 MIG (Monokine induced by interferon-?)라 불리는 chemokine을 확인 하였다. MIG는 혈관내피 세포 (Endothelial), 섬유아 세포 (Fibroblast), 대식세포 (Macrophage)등에서 발현된다고 보고되었으며 여러 조직 (간, 신장, 심장 등)에서도 MIG가 분비된다고 보고되었다. 위의 세포와 조직에서 분비된 MIG는 면역 계통 세포의 활성에 중요하게 작용하며 다른 조직 (Tissue)으로의 이동과 부착에 관련되어있다고 보고되었다. 먼저 파골세포의 전구세포에 RANKL를 자극하여 MIG 발현 정도를 확인하였다. MIG는 RANKL의 자극에 의해 24 시간 까지 발현이 증가 되었고 40-50 ng/ml 농도로 분비되었다. 다음으로 RANKL에 의해 유도되는 MIG가 어떤 기작을 통해 유도되는지 확인하기 위해 신호 전달 억제제 (Signaling inhibitor)를 사용하여 실험하였다. 그 결과 전사 유도인자 (Transcription factor)인 NF-kB와 신호 단백질인 p38 MAPK에 의존적으로 전사 유도인자 STAT1이 MIG 유도에 관련되어 있다는 것을 확인하였다. 그 결과 RANKL가 파골세포의 분화 과정에서 전사 유도인자인 NF-kB와 STAT1에 의해서 MIG 발현을 조절한다는 것을 확인하였다. MIG는 수용체 (Receptor)인 CXCR3를 자극하여 CXCR3를 발현하는 세포의 활성을 조절한다고 보고되었다. 따라서 파골세포의 전구세포가 CXCR3를 발현하는지 확인 하였고 M-CSF에 의해서 파골세포의 전구세포뿐만 아니라 파골세포 에서도 CXCR3가 발현된다는 것을 확인하였다. 또한 MIG의 수용체를 가지고 있는 파골세포의 전구세포에 MIG로 자극하여 파골세포의 분화와 활성에 어떤 효과를 나타내는지 확인 하였다. MIG는 RANKL에 의해 많은 양이 분비 되었지만 파골세포의 분화와 활성에는 차이를 보이지 않았다. 골수에서 유래된 파골세포와 전구세포는 뼈 조직으로 이동하여 뼈를 흡수하게 된다. 그러나 골수에서 유래된 파골세포와 전구세포가 어떻게 뼈 조직으로 이동하는지는 자세히 알려지지 않았다. 그래서 MIG가 파골세포의 이동과 기질 (Fibronectin, Vitronectin)로의 부착을 촉진 하는지 확인 하였다. 그 결과 MIG는 파골세포와 전구세포의 이동과 부착을 농도에 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였으며 파골세포의 전구세포에서 분비된 MIG가 다른 파골세포와 전구세포의 이동을 유도한다는 것 역시 확인 하였다. 이 결과로 MIG가 파골세포의 이동과 기질로의 부착을 유도함으로써 파골세포가 뼈 조직으로 이동하는데 중요한 역할을 할 것이라고 제안한다. 결론으로 파골세포에 중요한 인자인 RANKL가 파골세포의 분화 과정 동안에 chemokine의 일종인 MIG의 분비를 촉진하였고 이런 과정은 전사 유도인자인 NF-kB와 STAT1에 의해 조절되었다. 또한 파골세포의 전구세포 에서 분비된 MIG는 다른 파골세포와 전구세포의 이동과 기질로의 부착을 촉진 시켰다. 이런 결과로 MIG는 생체 내에서 파골세포가 뼈로 이동하는데 있어서 중요한 인자로 생각된다. Bone remodeling, a coupled process involving bone resorption and formation, is initiated by mechanical signals and is thought to be regulated by endocrine factors and by local inflammatory cytokines. Bone loss is accompanied by differentiation of osteoclasts from monocyte/macrophage lineage of hematopoietic cells. The TNF receptor family member RANK, its ligand RANKL are the crucial factors responsible for inducing osteoclast differentiation, survival, and bone resorption. RANKL is required for osteoclast differentiation through expression of various genes. Information about genetic programs and coordinated gene expression can be obtained effectively by the use of cDNA microarray technology that allows simultaneous measurements of the expression levels of several thousand genes. In a cDNA microarray study to identify genes targeted by RANKL, I found that monokine induced by interferon-? (MIG) gene was up-regulated in osteoclast precursors. MIG was well known as a CXC chemokine that is produced mainly by activated macrophages and binds to CXCR3, which is functionally expressed on activated T cells, B cells, and endothelial cells. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), western blot analysis, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were used to verify increased expression of MIG gene identified by the microarray analysis. RANKL induction of MIG required the activity of nuclear factor kappa B (NF-κB), whose binding site is present in MIG promoter. MIG induction by RANKL was also dependent on p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase and signal transducers and activators of transcription (STAT) 1. RANKL stimulated the phosphorylation of serine 727 of STAT1, which required p38 MAPK activity. Moreover, the expression of MIG mRNA was observed in RANKL-stimulated wild-type osteoclast precursors, but not in those cells derived from STAT1-deficient mice MIG secreted upon RANKL treatment could stimulate the migration and adhesion of osteoclast precursors and osteoclasts that were primed to express CXCR3, the MIG receptor, by macrophage-colony stimulating factor (M-CSF). I provide the first evidence demonstrating that RANKL stimulates the serine phosphorylation of STAT1 through the p38 MAPK pathway, causing MIG gene transcription and secretion, which may have a role in recruiting CXCR3-positive osteoclast precursors and osteoclasts to bone remodeling or inflammatory sites.

로즈마린산에 의한 핵 인자-κB 리간드 수용체 활성제/핵인자 κB의 수용체 활성제 유도성 염증 반응 조절

강호근 호서대학교 일반대학원 2022 국내석사

The purpose of this study is to investigate the therapeutic effect of rosmarinic acid (RA) in receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand (RANKL)-induced inflammatory response. Human mast cell line (HMC-1) cells were cultured and pretreated with various concentrations of RA followed by RANKL stimulation. The results demonstrated that pretreatment with RA significantly suppressed secretion of interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8, and thymic stromal lymphopoietin (TSLP) and down-regulated their mRNA expression. RA effectively regulated the activity of caspase-1 and protein levels of caspase-1. RA down-regulated nuclear protein levels of NF-κB and restored the cytoplasmic protein levels of NF-κB. Additionally, cytoplasmic protein levels of phosphorylated-IκBα were down-regulated by pretreatment with RA in RANKL-stimulated HMC-1 cells. Furthermore, RA did not exhibit significant cytotoxicity at the tested concentrations. In conclusion, these findings suggest that RA exerts anti-inflammatory effects by down-regulating pro-inflammatory cytokines via suppressing the caspase-1/NF-κB signaling pathway. These results provide valuable insights into the potential therapeutic application of RA in treating inflammatory disease involving mast cell activation by RANKL. 이 연구의 목적은 핵 인자(NF)-κB 리간드(RANKL)에 의한 염증 반응에대한 수용체 활성화제인 로즈마린산(RA)의 조절 효과를 조사하는 것이다. 인간 비만 세포주(HMC-1) 세포를 배양하고 다양한 농도의 RA로 전처리한 후RANKL를 처리하였다. 먼저, RA의 세포독성을 분석한 결과, RA는 시험된 농도에서 유의한 세포 독성을 나타내지 않았다. RA 전처리는 인터루킨(IL)-1β, IL-6, IL-8, 흉선 기질 림포포이에틴(TSLP)의 분비를 현저히 억제하고 이들의mRNA 발현을 하향 조절하는 것으로 나타났다. 또한, RA는 카스파제-1의 활성과 카스파제-1의 단백질 수준을 효과적으로 조절하였다. RA는 NF-κB의 핵단백질 수준을 하향 조절하고 세포질 단백질 수준을 회복시켰다. 또한, RA는인산화-IκBα의 세포질 단백질 수준을 RANKL로 자극된 HMC-1 세포에서 하향조절하였다. 결론적으로, 이러한 연구 결과는 RA가 카스파제-1/NF-κB 신호경로를 억제하여 전 염증성 사이토카인을 하향 조절함으로써 항염증 효과를 발휘한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 RANKL에 의한 비만세포 활성화와관련된 염증성 질환을 치료하는 데 있어 RA의 잠재적인 치료 적용에 대한 귀중한 통찰력을 제공한다.