Identification and mRNA expression level of Cysteine Proteinase Inhibitor (Cystatin; CPI) in mungbean (Vigna radiata L. wilczek)

김민정 이화여자대학교 2002 국내석사

녹두는 전 아시아 지역에서 재배되는 대표적인 콩과 작물로서 생산량의 50-60%가 재배 기간이나 저장 기간 동안에 팥바구미에 의해 손실되고 있다. 녹두에 감염하는 해충인 팥바구미는 여러 보고를 통하여 trypsin 같은 serine proteinase 보다 cysteine protinase를 사용하여 소화하는 것으로 확인되었고, 반면 사람이나, 다른 고등 동물들은 serine 계 proteinase를 사용하는 것으로 확인되었다. 따라서 cysteine proteinase는 콩류의 손실을 줄이기 위한 표적으로 그 중요성을 가진다. 본 연구에서는, 저항성 야생종인 V2709와 감수성 재배종인 전남 4호, 선화, 그리고 이들의 교배를 통해 새로운 품종으로 개발되어진 장안, 수원 29, 수원 30을 대상으로 cysteine proteinase inhibitor(CPI; cystatin)의 존재 유무와 그것의 발현 양의 차이를 알아보고자 CPI gene의 cDNA 염기서열 분석과 northern blot, quantitative RT-PCR 분석을 수행하였다. 1. CPI cDNA 유전자 염기 서열 분석 결과, 분석된 304bp의 cystatin은 저항성 종인 V2709, 장안 녹두, 수원 29, 수원 30, 그리고 감수성 종인 전남 4호와 선화 모두에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 분석된 cystatin은 모든 식물 종뿐만 아니라 동물 종에서도 보존적인 Q-V-V-S-G의 아미노산 서열을 가지고 있으며, 식물 종에서 보존적인 P-W 의 아미노산 서열을 가지고 있다. 또한 2차 구조에서 α-helix, loop를 암호화하는 signal sequence를 포함하고 있었다. 이것은 분석된 녹두에서의 cystatin cDNA가 phytocystatin superfamily의 일원이라는 것을 나타낸다. 2. 저항성 종인 V2709, 장안 녹두, 수원 29, 수원 30, 그리고 감수성 종인 전남 4호와 선화의 cystatin은 서로 높은 유연 관계를 보였으며, PHYLIP 프로그램을 이용한 계통도 분석 결과, 크게 부모계가 하나의 그룹을 형성하고, 육종계가 다른 그룹을 형성하였으며, 각각 V2709, 전남 4호와 선화로, 장안 녹두, 수원 30종과 수원 29 종으로 다시 소 그룹을 형성한다. 이것은 cystatin 유전자가 바구미에 대한 저항성에 관련이 없음을 시사한다고 하겠다. 3. 장안 녹두에서 종자의 발달 단계에 따라 cystatin의 발현양이 어떻게 변화하는 지를 알아보기 위하여 Quantitative RT-PCR 과 northern blot analysis 분석을 수행한 결과, 다른 식물종과 마찬가지로 개화기 이후 2주 정도가 지난 종자에서 가장 많은 발현양을 보였으며, 그 발현양이 점점 감소하기는 하지만, 수확 후 저장 상태의 녹두 종자에서도 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 이것은 cystatin이 abiotic stress에 대한 저항 기작이라든지, programed cell death, 종자의 발아 등의 조절 기작에 관여하고 있다는 보고를 뒷받침 할 수 있다. 또한 2개의 bands가 발견되는 것으로 보아 녹두에서도 cystatin은 genefamiliy 로 존재할 가능성이 있다. 4. 저항성 종과 감수성 종을 대상으로 Quantitative RT-PCR 과 northern blot analysis를 수행한 결과, quantitative RT-PCR 분석에서는 감수성 종이 저항성 종 보다 약간 발현양이 적은 것으로 분석되었으나, 그 차이가 미미하였고, northern blot analysis 분석 결과, 거의 비슷한 발현양을 가지는 것을 알 수 있었다. 이것은 녹두에서 cystatin이 자연적인 바구미 저항성에 관련이 없음을 의미한다고 할 수 있다. 결론적으로, 녹두에서의 cystatin은 그 염기 서열 분석과 phylogenetic analysis 결과 phytocystatin이라는 superfamily에 속하며, 종자 발달 단계에 있어서 개화 후 2주 된 종자에서 가장 많이 발현되며, 그 양이 감소하기는 하지만 지속적으로 발현됨을 알 수 있었고, 저항성 종과 감수성 종 모두에서 발현되고 그 발현량에도 차이가 없었기 때문에 녹두의 바구미 저항성에는 관련이 없음을 증명하였다. A major insect-pest of mungbean, Coleoptera utilizes aspartic and cysteinee proteinases for digestion rather than serine proteases such as trypsin. Whereas higher mammalian species use serine proteinase in their digestive systems, many insect species belonging to the Coleopteran and other orders widely utilize cysteine proteinase in digestion. Cysteine proteinases, a good target enzyme for inhibition growth and development of pests and cysteine proteinase inhibitor(CPI), cystatin, plays a important role in many aspects of plant development and resistance. To analyze for presence of the CPI gene in mungbean, RT-PCR was performed. cDNA that encodes a cystatin consisting of 89 amino acids was isolated and sequenced in both resistant cultivar type(V2709, Jangan, Suwon 29, Suwon 30) and susceptible cultivar type(Jeonnam, Seonhwa). The homology of CPI genes between resistant lines and susceptible lines was 90~95%. Its nucleotide sequences, especially Jangan mungbean's, are shown 95%, 86% and 74% homology compared with cowpea cystatin, oryza cystatin and soybean cystatin, respectively. Also, it contains the putative reactive domain QXVXG in the central part of the molecule and the PW motif near the COOH is terminus conserved among members of the cystatin superfamily. And, the predictive secondary structure, α1-helix domain is located 13 - 22 residues, loop 1 domain is located 40 - 50 residues, and loop 2 domain is located 63 - 71 residues. To characterize of expression level of cystatin mRNA in Jangan mungbean, northern blot and quantative RT-PCR were performed. The mRNA expression levels of Jangan mungbean reaches its maximum level 2 weeks after flowering and is expressed continuously during following maturation period. These results strongly suggested that mungbean cystatin is expressed in mungbean seeds during maturation and that the expressed protein. As the result of quantitative RT-PCR and northern blot analysis from resistant and susceptible lines, mature seeds of resistant mungbean lines and susceptible cultivar lines showed similar patterns and levels of expression. It is concluded that the level of expression of the cystatin do not account for the differences between bruchid resistance of the resistance lines and susceptible lines.

Candida albicans proteinase의 精製와 特性에 關한 硏究

장선희 全北大學校 1993 국내석사

Candida albicans is opportunistic pathogen product disease in immunocompromised host. The virulent factors which are responsible for the pathogenicity of Candida albicans are not fully elucidated. Many investigators have postulated that extracellular proteinase is associated with disease-producing capacity of this organism. This study was undertaken to identify the extracellular proteinase of Candida albicans NIH A-207 and to investigate its biochemical properties Candida albicans were grown in a medium containing bovine serum albumin as a nitrogen source to induce proteinase. The proteinase of Candida albicans was purified from culture filtrate of C. albicans by using affi-gel blue chromatography. A single protein band with a molecular weight of approximately 41,500 was observed on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blot analysis. The optimum temperature concerning about the activity of purified proteinase was around 30-40˚C. The enzyme was inhibited by pepstatin A at a dose-dependent manner and thus determined to be a carboxyl(aspartic) proteinase. The proteolytic activity was not influenced by the addition of heavy metal ions. Also, the enzyme was a glycoprotein and able to produce keratinolytic proteinase.

Cryptococcus neoformans NHPY24 배양액에서 정제한 Serine proteinase의 생화학적 특성 및 유전자 서열 분석

유재일 中央大學校 2002 국내박사

동물독성과 단백질 분해효소 분비가 강한 임상분리주 Cryptococcus neoformans NHPY 24 균주를 선별하였다. 이들 균주의 세 포 외 분비물을 DEAE 및 affinity column chromatography 방법으 로 serine proteinase 순수 정제하였고, 효소의 특성을 관찰하였으 며, 정제된 단백질 분해효소의 DNA 서열을 관찰하였다. 1. 정제된 단백질 분해효소는 serine proteinase 억제인자인 PMSF, DFP에 의해 효소의 활성이 억제되어 정제된 효소는 serine proteinase 임을 확인하였다. 이들 효소의 최적 pH는 7.5이고, pI 값은 4.77로 확인하였다. 2. 정제된 단백질의 천연기질 분해능을 관찰한 결과, β-caseine, γ-globulin, hemoglobin에 대해 강한 분해능을 보였다. 3. 정제된 Serine proteinase의 분자량은 SDS-PAGE 영동상에서 43 kDa으로 측정되었으며 native 전기영동상에서 86 kDa으로 43 kDa의 단백질이 dimer로 존재하는 것을 확인되었다. 4. 정제된 serine proteinase의 약 90%에 해당하는 DNA 염기서 열을 분석한 결과, 1143 bp로 381개의 아미노산으로 구성되 었다. 5. DNA 염기서열의 아미노산 서열을 분석한 결과, 정제된 serine proteinase는 subtilisin 계열의 serine proteinase와 유 사한 아미노산 서열을 갖는 것으로 확인되었다.

Differences in virulence and drug sensitivity of different Miamiensis avidus isolates and effects of RNA interference-mediated knock-down of a cysteine proteinase on the ciliate growth

WAKABAYASHI CHIZUHA 부경대학교 2018 국내석사

양식 넙치 (Paralichthys olivaceus) 에서 발병하는 주요 기생충성 질병 중 하나인 스쿠티카증을 일으키는 Miamiensis avidus는 최근 연구에서 혈청형에 따라 특이적인 병원성을 나타낼 뿐만 아니라 혈청형이 유사할 지라도 다른 장소에서 분리된 분리주에 따라서도 다른 병원성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 이번 실험에서는 각각 다른 양식장에서 분리한 M. avidus의 3가지 분리주 (분리주 1~3) 를 사용해 in vivo 병원성과 약물 감수성의 차이에 대해 분석하였다. 분리주 3을 침지 감염시킨 넙치 치어는 분리주 1 혹은 2를 침지 감염시킨 넙치보다 훨씬 높은 폐사율을 보였으며, 넙치 혈청에 대한 충의 저항성 분석에서도 분리주 3이 가장 높은 저항성을 나타냈다. 또한 M. avidus가 병원성을 나타내는데 결정적인 역할을 한다고 보고된 cysteine proteinase의 분비 활성을 분석 하였을 때도 분리주 3이 가장 높은 값을 나타냈다. 추가적으로 cysteine proteinase 억제제인 E-64를 처리한 후 넙치 혈청에 대한 저항성을 분석하였을 때 모든 분리주의 저항성이 크게 감소된 것을 관찰하였으며, 이는 결과적으로 M. avidus의 cysteine proteinase 는 충이 숙주에게 병원성을 나타내는데 중요한 역할을 하고 있다는 보고를 뒷받침하는 결과이다. 따라서 이 cysteine protein-ase를 억제시키는 것으로 M. avidus의 병원성을 약화시킴으로 스쿠티카충에 의한 피해를 줄일 수 있다는 가정으로 다음 실험을 접근하게 되었다. 하지만, cysteine pro-teinase분비 활성이 큰 차이가 없었던 분리주1과 분리주 2가 혈청 저항성과 in vivo 병원성 분석에서 분리주 2가 상대적으로 높은 저항성과 병원성을 가지는 결과를 관찰하였다. 이는 cysteine proteinase가 병원성 결정에 중요한 역할을 하지만 그 이외에도 다른 인자들이 충의 병원성 결정에 관여함을 시사하였다. 또한3가지의 스쿠티카 분리주는 기생충성 질병치료제인 mebendazole과 bithionol에 대한 약물 감수성의 차이를 나타냈다. 비록 스쿠티카증에 대한 효과적인 약물 개발이 지금까지 전무하지만, 차후 효과적인 화학치료제를 개발하기 위해서는 분리주에 따른 약물 감수성 또한 고려해야 할 요소임을 알 수 있었다. 앞서 실험을 통해 관찰한 M. avidus 병원성과 cysteine proteinase의 관계를 기반으로 RNA간섭을 통해 충의 cysteine proteinase의 발현을 억제시키고 이것이 충의 성장에 미치는 영향을 분석하였다. RNase III knock-out Edwardsiella tarda 영양요구성 돌연변이체를 cysteine proteinase를 억제하는 긴 이중 가닥 RNA를 생산하는데 사용하였고, 이를 M. avidus 분리주 3에 먹이로 사용하여 RNA를 충으로 전달하였다. 조작된 E. tarda를 섭취한 충에서는 cysteine proteinase 유전자가 전사되는 양이 큰 폭으로 감소되었으며, cysteine proteinase 분비 활성 또한 큰 폭으로 감소되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 RNA간섭에 의한 cysteine proteinase의 발현 억제는 충의 증식 또한 감소시키는 것을 관찰하였다. 이러한 결과들은 cysteine pro-teinase가 M. avidus에 대한 치료 및 예방을 위한 백신의 잠재적인 표적으로 사용될 수 있음을 나타냈다.

담배(Nicotiana glutinosa L.)에서 proteinase inhibitor 유전자의 구조와 발현에 관한 연구

전윤주 연세대학교 대학원 2000 국내석사

담배에서 담배 모자이크 바이러스 감염과 비생물적 스트레스에 의해 발현이 증가하는 proteinase inhibitor (PI) 유전자의 특성을 밝힘으로써 궁극적으로 담배 모자이크 바이러스 감염을 포함하는 스트레스환경에 대한 식물의 방어기작을 알고자 하였다. 두 개의 cDNA clone, NGPI-1과 NGPI-2는 각각 1.6 kb, 1.4 kb의 길이이며, 각각 8번과 6번 반복되는 유사한 염기서열이 연이어 있는 특이한 구조를 가진다. 두 clone은 nucleotide 수준에서 97%의 유사성을 가지고 있으며, 이들은 모두 chymotrypsin과 trypsin 두 개의 reactive site를 포함하므로, serine protease inhibitors family 범주에 속한다. 이들 중 NGPI-1을 이용하여 유전자발현 특성 실험과 단백질 발현 실험을 수행하였다. NGPI-1의 발현 양상을 알아보기 위하여 total RNA를 이용하여 Northern hybridization을 수행하였다. 조직별로 본 PI의 전사량은 꽃에서 가장 높았으며, 암술과 꽃잎에서 높았다. 잎에서는 발달정도에 따라 전사량이 감소되었다. NGPI-1는 아미노산 서열이 유사한 domain이 8번 반복되는 특이한 구조를 지니고, 이는 NGPI-1의 posttranslational processing의 가능성을 보여준다. 이러한 단백질 수준의 NGPI-1 조절양상 연구를 위한 항체 제작을 위하여 대장균에서 과다발현을 시도하였다. 과다발현 과정에서 NGPI-1 발현 벡터를 삽입한 대장균의 생장곡선을 측정한 결과 NGPI-1의 과다발현은 대장균의 생장을 억제하였다. 이는 serine proteinase에 억제활성이 있는 proteinase inhibitor의 특성으로 미생물의 생장에 영향을 준 것으로 보인다. 한편, maltose binding protein과의 복합단백질을 사용한 발현실험 결과 NGPI-1 단백질의 과다발현은 유도하였으나 불안정한 특성을 보였다. NGPI-1 단백질이 단기간에 degradation되는 것은 post-translation processing과정에 의한 단편화과정과 관련된 가능성이 있다. Two CDNAS, pNGPI-1, pNGPI-2, encoding Nicotiana gluiniosa proteinase inhibitor II (PI-II) have been cloned, sequenced and identified. The deduced amino acid sequences are 54-82% indentical to those of other plant PI-II. The NGPI-I protein is composed of eight repeated domains, while NGPI-II contains six repeated regions, each with a putative reactive site. The expression of NGPI-I is highly regulated in a developmental-and tissue-specific manner, with the transcript being detected in young loaves and floral organs of tobacco plants. In mature loaves, the NPGI-I gene is rapidly activated by distinct temporal induction patterns in response to the pathogen-related (biotic) and wound-related (abiotic) stresses, respectively. pNGPI-I was subcloned into E. coli expression vector, pET, and this recombinant plasmid was transformed into E. coli cell However, expression of NGPI-I protein was not detected and cells harboring NGPI-I plasmid did not grow normally compared to wild type cell. Growth retardation of NGPI-I containing cells might be due to the NGPI-I action against endogenous serine proteinase in E. coli.

인삼으로부터의 Cysteine Proteinase Inhibitor 유전자 분리 및 다양한 스트레스에 의한 발현반응

정대영 경희대학교 2010 국내석사

Cysteine proteinase inhibitor (CPI) 는 단백질 가수분해 효소인 cysteine proteinase의 active site에 결합하여 단백질 분해 활성을 저해시키는 작용을 가지고 있다. 식물체 내에서의 외부 환경 스트레스 저항성에 관여하는 CPI의 역할들이 규명되고 있으나, 인삼에서의 역할은 밝혀진 바 없기에, 고려인삼 (Panax ginseng C.A. Meyer)으로부터 CPI 유전자의 정보 및 발현 양상을 제공하고자 하였다. 인삼 EST 중에서 CPI 유전자에 상동성을 나타내는 clone을 선발하였고 이를 바탕으로 PgCPI 동정 하였다. PgCPI의 아미노산 서열과 이차구조는 기존에 보고된 식물들과 높은 상동성을 나타내었으며 qRT-PCR 분석결과, NaCl, white light, UV, wounding, MeJA 등의 서로 다른 스트레스에 의해 강하게 발현하였으며 곰팡이와 뿌리혹선충을 감염시킨 인삼에서도 높은 발현량 증가를 보였다. 효소 저항 반응 실험 결과, MeJA, wounding 스트레스에 의해 증가된 PgCPI 단백질이 cysteine proteinase의 활성을 감소 시키는 것으로 확인되었다. Phytocystatins are plant-derived cysteine proteinase inhibitors implicated in the endogenous regulation of protein turnover and defense mechanisms against insects and pathogens. A cysteine proteinase inhibitor, PgCPI, was isolated and characterized from Panax ginseng. Sequence analysis revealed that the coding cDNA sequence of PgCPI is of 609 base pairs in length and its ORF encodes 202 amino acids. The predicted molecular mass of the mature protein is approximately 22.5 kDa with a predicated isoelectric point of 5.93. A GenBank BlastX search revealed that the deduced amino acid sequence of PgCPI shares a high degree homology with cysteine proteinase inhibitors from other plants. In this present study, we analyzed the expression patterns of PgCPI against various abiotic and biotic stresses at different time points using quantitative real time-PCR. Enzymatic activity of PgCPI was also determined against cysteine proteinase. Our results reveal that PgCPI is moderately induced by NaCl, chilling, CuSO4, ABA and jasmonic acid. However, white light, UV, MeJA, and wounding triggered a significant induction (more than fourfold) of PgCPI within 12-h post-treatment, especially PgCPI prominently accumulated by wounding (24 folds). In addition, increased transcripts of PgCPI were investigated against fungal and nematode infected roots. These results suggest that PgCPI is involved in defense responses to biotic and abiotic stresses.

Identification of Cysteine Proteinase Inhibitor (Cystatin; CPI) in mungbean (Vigna radiata[L.] wilczek)

류다운 이화여자대학교 2002 국내석사

식물에 존재하는 여러 종류의 저항성 단백질 중 cystatin(cysteine proteinase inhibitor) 은 비교적 최근에 연구되기 시작한 단백질이다. 녹두의 대표적인 해충인 팥바구미가 소화를 위해 cysteine proteinase를 주로 사용한다는 사실이 보고되었으므로 이 소화효소의 경쟁적 저해제인 cystatin의 식물 내 존재 유무가 식물의 저항성에 중요하게 작용할 것으로 보인다. 녹두 내에서 cystatin의 존재를 확인함은 물론 녹두가 지닌 팥바구미 저항성과의 관계를 밝히기 위하여 저항성, 감수성 종 녹두가 비교 분석되었으며, 저항성 야생종인 V2709와 감수성 재배종인 전남4, 선화, 그리고 이 저항성과 감수성 종 사이의 교배를 통해 새로 개발된 녹두 품종인 수원 녹두(장안 녹두, 수원 29, 수원 30)가 재료로 사용되었다. 그러나 유전자 염기 서열 분석 결과 6품종 모두에서 cystatin이 분리되었고 그 서열이 90-95% 정도로 유사했다. Southern blot 결과에서도 모든 품종에서 cystatin gene family가 확임됨을 알 수 있었다. 그러나 6 품종을 BamHI으로 제한 절단 한 경우 수원 29의 band 양상에 차이가 보이며 EcoRI으로 절단 한 경우 수원 29, 30에서 차이를 볼 수 있었다. Membrane washing 시간을 짧게 한 경우 약하게 결합되는 더 많은 밴드들이 검출되는 것으로 보아 녹두 내에서 cystatin과 연관되는 유전자들이 존재하거나, 또는 쌀이나 옥수수의 경우처럼 cystatin 자체가 유전자 그룹으로 이루어져있을 가능성을 고려해볼 수 있으며 수원 29와 30은 28과 인트론 서열 내 차이가 있는 것으로 보인다. 분리된 녹두의 cystatin 단백질 서열은 모든 cystatin에 공통적인 Q-X-V-X-G 모티프와 P-W 모티프는 물론 식물의 cystatin에만 특이적인 L-A-R-F-A-V-x-E-H-N 서열을 지니고 있어 식물 cystatin 그룹의 구성원임이 확실히 증명되었다. 또한 다른 식물 cystatin과 마찬가지로, 그 서열은 동물 cystatin family II와 유사한 반면 이황 결합이 없다는 점에서 동물 cystatin family I과 유사하여, cystatin superfamily의 계통분류학 분석결과 동물 cystatin I-III 와는 별개로 다른 가지에 위치하게 된다. 대부분의 식물 cystatin이 이렇게 동물의 cystatin과는 계통분류도 상 독립적인 다른 위치에 놓이게 되나 아직 식물 cystatin이 따로 분류되거나 명명되지는 않은 상태이므로 더 많은 식물에서 cystatin이 분리되어 새로운 family로 분류되어야 함이 주장되고 있다. 3' RACE PCR 결과 녹두 cystatin 유전자의 아미노 말단 서열을 얻을 수 있었다. 옥수수(corn), 당근(Carrot)과 콩(soybean)의 경우 이 부분에 신호 서열을 가져 단백질 가공 과정 중 절단되어 나가며 성숙한 단백질이 분비되는 것으로 보고되어져있다. 녹두에서도 이와 유사한 서열이 발견되었으며 그러므로 분비단백질일 가능성이 보이나 세포 내 구획을 밝히기 위한 조직학적인 실험이 더해져야 할 것이다. 비록 녹두에서 cystatin이 팥바구미에 대한 저항성에 직접적으로 관여하는 것으로 보이지는 않으나, 저항성과 감수성 종간에 이와 비슷한 결과를 보였던 cowpea의 경우처럼, cystatin이 저항성보다는 식물 성장과 조절에 관여할 것이라고 생각할 수 있다. 동물의 경우에는 cystatin이 세포 사멸에 관여하는 것으로 알려져 있으며 1999년에는 콩의 cystatin도 이와 유사한 기전을 보이는 것으로 보고되었다. 또한 lima bean의 vicillin의 경우처럼 cystatin이 단독적으로 작용하는 것이 아니라 여러 가지 저항성 단백질이 복합적으로 작용하여 저항 기작을 나타내는 경우를 고려해 볼 수 있다. 그러나 정확한 결과를 위해서는 더 많은 식물에서 연구가 이루어져야 할 것이다. 현재 가장 잘 밝혀진 쌀의 cystatin이 여러 형질 전환 식물에 유전자 도입되어 뛰어난 해충 저항성을 보이고 있으므로 유전자 조작에의 이용 가능성도 매우 밝다고 할 수 있다. A major insect-pest of mungbean, Coleoptera is reported to utilize aspartic and cysteine proteinases for digestion rather than serine proteases such as trypsin. Cysteine proteinase inhibitors(cystatins) are protective proteins that inhibit cysteine proteinase of insects. To identify and charcterize the cystein proteinase inhibitor in mungbean, cDNA that encodes a cystatin consisting of 89 amino acid residues was isolated using RT-PCR and sequenced(GenBank No. AF454396). The cystatin sequences of resistant lines and susceptible lines, 4 lines of Suwon 28, Suwon 29, Suwon 30 and V2709 as resistant against C. Chinesis and Jeonnam 4 and Seonhwa as susceptible lines, show high similarity of 90-95%. Nucleotide sequence of Jangan mungbean(Suwon 28, resistant breeding line) shows 93%, 86% and 74% homology compared with cowpea cystatin, oryzacystatin and soybean cystatin, respectively. As shown in amino acid sequence, it contains the putative reactive domain QXVXG in the central part of the molecule and the PW motif near the COOH terminus which are conserved among members of the cystatin superfamily. By 3'-RACE PCR analysis, untranslated region of mungbean cystatin was analyzed and signal sequence analogues were found. So, it could be though that mungbean cystatin is a kind of secreted protein like corn cystatin, soyacystatin and carrot cystatin. As a result of Southern blot analysis using mungbean cystatin cDNA as a probe, 6 lines of mungbean genomic DNA show same band pattern with PstI, HindⅢ and XhoI. However, Suwon 29 shows different band pattern with BamHI and EcoRI. Cystatin gene families were detected in both resistant and susceptible lines of mungbean, therfore, it could be concluded that cystatin in mungbean exists for plant regulation rather than defense like the case of cowpea cystatin.

밀 종피색 GWAS를 이용한 종자 발아 연관 cysteine proteinase 유전자 동정 및 발현 분석

최준용 단국대학교 대학원 2024 국내석사

밀(Triticum aestivum L.)은 전 세계적으로 재배되며 수확 시기 중 강우로 인해 발생하는 수발아는 밀 품질을 저하시켜 경제적인 손실을 야기한다. 이러한 문제를 해결하기 위해 수발아와 종피색의 연관성을 바탕으로 수발아 저항성을 향상시킬 수 있는 밀 품종 선발의 중요성이 강조된다. 이처럼 수발아 저항성이 강한 밀 품종을 선발하기 위한 대규모 평가가 필요하며, 해당 과정에서 정밀한 분자 마커 개발의 필요성이 조명되고 있다. 본 연구에서는 46개국에서 수집한 614점의 밀 핵심집단 중 562점의 자원을 대상으로 분광광도계를 이용하여 종피색 형질을 평가하고, 35K SNP chip array를 통해 유전자형을 분석하였다. 이후 전장 유전체 연관분석(Genome-Wide Association Study, GWAS)을 통해, 종자 발아와 연관된 Single nucleotide polymorphism (SNP)를 동정하였다. GWAS는 BLINK, MLM 두 가지 모델에서 수행되었고, 공통으로 -log(P) > 2.5인 12개의 SNP를 선발하였다. LD 분석을 통해 12개의 공통된 SNP와 높은 연관성을 보여주는 5개의 SNP를 선발하였고, 5개의 SNP가 위치한 유전자를 동정한 결과 intergenic region에 위치한 SNP를 제외한 2개의 SNP는 cysteine proteinase와 KH domain-containing protein로 annotation 되었다. 또한, 주변 2Mb 범위에서 유전자의 기능을 확인하여 cysteine proteinase (CP)의 첫 번째 exon에 위치하는 SNP를 후보 유전자로 선발하였다. 동정한 SNP는 synonymous SNP로 단백질을 변화시키지 않지만 SNP 변이에 따라 codon usage 빈도가 15.3, 38.2를 가지고, RNA secondary structure 분석을 통해 구조의 차이가 발생함을 확인하였다. 본 연구에서 선발된 종피색 연관 CP 유전자 발현 분석을 위해 종자의 휴면성이 강한 적립계 품종(다홍)과 약한 백립계 품종(금강)을 선정하였고, 수분흡수를 시간별로 처리하여 qRT-PCR을 통해 24시간에 금강에서 15.06, 다홍에서 8.55의 유의미한 상대적 발현 차이를 확인하였다. 또한, CP 유전자의 전사과정을 억제하는 phytocystatin (PhyCys) 유전자의 CP 유전자와 반대되는 발현양상을 확인하였다. 위 연구를 통해 동정된 CP유전자의 유전적 분석을 통해 적립계 밀의 종자 휴면력이 백립계에 비해 발아 억제가 높은 것을 알 수 있다. 결과적으로, 본 연구의 결과는 발아 검정 마커로 이용할 수 있을 것이라 예상하며 추후 CP 유전자를 통해 수발아 저항성 우수 밀 품종 육종에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Aspergillus屬 菌株가 生成하는 蛇毒 Proteinase에 對한 沮害物質

남주현 慶北大學校 1983 국내박사

김치 유래 젖산균의 Cell-envelope proteinase 유전자의 Cloning 및 특성 규명

이유진 京畿大學校 大學院 2002 국내석사

김치는 배추나 무를 주원료로 마늘, 생강, 고춧가루 등의 다양한 향신료와 젓갈을 첨가하여 발효시킨 우리나라 고유의 채소발효식품이다. 김치 고유의 맛은 원료와 미생물의 적당한 발효에 의하여 나타나며 발효에 관여하는 젖산균은 김치의 품질을 결정하는 중요한 인자가 된다. 그러나 영양요구성이 매우 까다로운 젖산균은 질소원이 생장 제한 요소로 작용하고 있다. 따라서 젖산균이 갖는 단백질 분해계에서도 첫번째 단계에 관여하는 cell-envelope proteinase (CEP)는 유제품 유래 젖산균의 생육에 큰 영향을 미치는 것으로 보고되어 있어, 김치 유래 젖산균에서도 제조과정 중에 나타나는 단백질의 분해가 젖산균의 성장속도에 큰 영향을 미치는 것으로 추정된다. 현재 김치 제조에 종균을 사용하려는 시도가 증가하고 있음에도 불구하고, 김치 유래 젖산균의 단백질 분해계에 대한 분자생물학적인 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 김치 유래 젖산균의 CEP 존재 여부 및 유전자 수준에서의 연구를 시도하였다. 김치 유래 젖산균의 CEP 존재 확인에 앞서, 생화학적으로 동정된 김치 유래 젖산균들의 16S rDNA 염기서열을 결정하여 재동정하였다. 재동정한 김치 유래 젖산균들을 대상으로 CEP의 활성을 측정해 본 결과, 균주들에 따라 활성의 차이는 나타났지만 CEP로 추정되는 세포외 proteinase의 활성을 보유하고 있으며, 대체로 Leuconostoc속 균주보다는 Lactobacillus속 균주들이 높은 세포외 proteinase 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. CEP 유전자를 증폭시킬 수 있도록 제작한 primer에 의해서 CEP의 존재를 확인해 본 결과, Lactobacillus 유래의 CEP 유전자가 Leuconostoc 유래의 CEP 유전자에 비해서 지금까지 밝혀진 유제품 유래 젖산균의 CEP 유전자와 높은 상동성을 가지고 있는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 기존에 보고된 CEP 유전자와 유사한 CEP 유전자의 존재가 확인된 균주들 중에서 Lactobacillus pentosus KFRI 821이 가장 높은 활성을 나타냈고, 이 균주는 buffer의 pH에 따라 CEP 활성에 비해 유출에 민감한 변화를 보였다. 또한 이 균주의 CEP 유출 시 EDTA의 첨가는 CEP의 유출과 함께 세포벽에 부착된 다른 단백질의 유출을 증가시켰고, 조효소액에 첨가한 Ca2+은 효소의 안정화에는 기여하나 활성에는 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. Lb. pentosus KFRI 821의 genomic DNA를 대상으로 CEP 특이적 primer에 의해 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, Lactobacillus paracasei와 Lactococcus lactic subsp. cremoris의 PrtP와 높은 상동성(84% - 86%)을 보였다. CEP 유전자의 일부로 확인된 Lb. pentosus KFRI 821의 PCR 산물을 CEP 유전자 cloning을 위한 probe로 사용하여 gene walking을 진행중에 있다. 또한 이 probe를 사용하여 Southern hybridization을 수행한 결과, 유제품 유래 젖산균들의 CEP 유전자가 Lactobacillus의 chromosomal DNA에서 확인된 것과 마찬가지로 김치 유래 Lb. pentosus KFRI 821의 CEP 유전자도 chromosomal DAN에 암호화 되어있다는 것을 확인했다. Kimchi is a group of traditional fermented vegetable foods in Korea and known to be the product of a natural mixed-fermentation process carried out principally by lactic acid bacteria (LAB). Since LAB are fastidious organisms with multiple amino acid auxotrophies, their growth is critically dependent on efficient systems for the degradation of proteins and the transport of amino acids and small peptides. In milk, LAB depend for their growth on a proteolytic system that allows degradation of milk proteins. Therefore, the action of cell-envelope proteinase (CEP) involved in the initial breakdown of the proteins is important for the growth in milk, which does not contain sufficient amino acids to support the optimal growth of these bacteria. It could be postulated that the CEP of Kimchi LAB influence the growth rate in similar action to that of dairy LAB, therefore, it would be very interested in studying the CEP. According to the results of 16S rDNA sequence determination, four out of six Leuconostoc strains tested in this study were incorrectly classified and turned out to be Lactobacillus. The existence of CEP in the LAB isolated from Kimchi was proved by the measurement of proteolytic activity. Lactobacillus strains showed higher activity of CEP than Leuconostoc strains did. Also, polymerase chain reaction (PCR) was conducted to illuminate the existence of cep gene. Lactobacillus strains possessed the cep genes which have strong homology with those of dairy LAB. Lactobacillus pentosus KFRI 821 had higher CEP activity than other strains had. The release of CEP from Lb. pentosus KFRI 821 was optimum at pH 7.5. It was also found that EDTA stimulated the release of other cell wall-bound proteins as well as CEP, and the addition of Ca2+ stabilized the CEP. The partial cep gene was amplified by PCR from the genomic DNA of Lb. pentosus KFRI 821, and the PCR product was cloned in pGEM-T Easy vector. The deduced amino acid sequence of PCR product from Lb. pentosus KFRI 821 showed 86% and 84% homology with those of PrtP from Lactobacillus paracasei and Lactocuccus lactic subsp. cremoris, respectively. Therefore, the PCR product was used as a probe for Southern blot analysis. The results of Southern blot analysis showed the existence of cep gene in chromosomal DNA of Lb. pentosus KFRI 821.