CD34 monoclonal antibody immobilized small-diameter polyurethane vascular graft to enhance endothelialization

황인규 아주대학교 일반대학원 2009 국내석사

폴리우레탄은 뛰어난 기계적 물성과 생체적합성으로 인해 심혈관계 의료용 고분자로써 널리 이용 되지만, 소구경 인공혈관에 적용하기 위해서는 혈액적합성을 향상시키는 것이 매우 중요하다. 소구경 인공혈관의 주요 실패 원인은 혈관 내 혈전형성 및 평활근세포의 과량증식에 따른다. 최근, 이를 해결하기 위해, 혈관내피전구세포를 이용한 소구경 인공혈관에 많은 연구가 진행되고 있다. 혈관내피전구세포는 혈액과 함께 온몸을 순환하다가, 혈관 내 상처가 발생하면 상처부위에서 혈과내피세포로 분화되어 상처를 치료하게 하는 세포이다. 이 연구의 목적은 혈관내피전구세포와 항원-항체반응을 할 수 있는 CD34단클론항체를 폴리우레탄 표면에 고정하여, 혈액 내 혈관내피전구세포를 폴리우레탄 표면에서 붙잡는다. 이렇게 붙잡힌 혈관내피전구세포는 폴리우레탄 표면에서 혈관내피세포로 분화된다. 그 결과, 수 시간 내에 폴리우레탄 표면에 혈관내피세포를 분화하여 혈전생성 및 평활근세포의 과량 증식을 방지하여 소구경 인공혈관의 개통성을 높이고자 한다. 실험방법은 다음과 같다. 폴리우레탄 지지체를 전기방사법을 이용해 제조한 다음, 양 말단에 아이소시아네이트기를 가진 폴리에틸렌글라이콜을 그 표면에 도입한다. 그 다음 EDC로 활성화시킨 헤파린을 폴리에틸렌글라이콜 말단의 아민기와 반응시킨다. 그렇게 하여 도입된 폴리에틸렌글라이콜과 헤파린은 각각 산-염기 적정법, 톨루이딘 블루 분석법을 통하여 정량화 하였다. CD34단클론항체는 폴리에틸렌글라이콜의 아민기를 Sulfo-EGS로 활성화 시킨 후 항체표면의 아민기와 반응하였다. 이렇게 고정된 CD34단클론항체는 효소면역항체법을 이용하여 정량 하였다. CD34단클론항체로 개질한 표면의 물리-화학적 특징은 접촉각 측정, 원자력간 현미경, X선 광전자 분광법으로 분석하였다. 개질된 표면과 세포와의 상호작용은 CD34항원이 표면에 있는 조혈모세포를 이용하여 고정된 CD34단클론항체와 항원-항체반응을 하는 것을 확인하였다. 현재 CD34단클론항체가 고정된 폴리우레탄 인공혈관을 개에 삽입한 동물실험이 진행 중이다. 위와 같은 실험을 통해 얻어진 결과는 성공적으로 폴리에틸렌글라이콜, 헤파린, CD34단클론항체가 폴리우레탄표면에 고정되었으며 고정된 단 클론 항체는 활성을 유지함을 확인하였다. 결론적으로, CD34단클론항체가 고정된 폴리우레탄 인공혈관은 소구경 인공혈관에 응용 가능하다. Cardiovascular disease, including coronary artery and peripheral vascular pathologies, is the leading cause of mortality in the United States and Western countries. There is a pressing need to develop small-diameter vascular vessels for bypass surgery and other vascular reconstructive procedures. Good mechanical properties and blood compatibility make polyurethane (PU) frequently used components of cardiovascular implants. But poor endothelialization of PU surface has been a major drawback. To overcome this, recently there has been a growing interest in utilizing endothelial progenitor cell (EPC) as a luminal surface on vascular devices. After endothelial injury, EPC can contribute to vascular repair because EPC differentiated into mature endothelial cells (ECs). It is reported that EPC express CD34, CD133, CD31, VE-cadherin, VEGFR2, and c-Kit. Our approach by immobilizing CD34 monoclonal antibody (mAb) that can bind with CD34 antigen on EPC is to facilitate the formation of a monolayer of EC on the luminal surface in vivo. We have modified the surfaces of PU by immobilization of CD34 monoclonal antibody that can bind with CD34 antigen on EPC. The purposes of surface modification are for effective CD34 mAb immobilization and increasing biocompatibility by rapid endothelialization. The immobilized CD34 mAb was quantitative by ELISA. The surface modified substrates were characterized by contact angle measurement, atomic force microscopy (AFM) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). CD34+ cell test was performed on the modified surfaces via specific interaction by using hematopoietic stem cell. We observed unique surface properties of CD34 mAb immobilized PU and an antibody specific interact with antigen on CD34+ cell because CD34 cell attachment was remarkably greater on CD34 mAb coupled PU than on unmodified PU. The obtained results suggest that CD34 mAb immobilized PU matrices can be applied to blood compatible artificial small-diameter blood vessel.

사람 제대혈 CD34 양성 세포의 체외증폭과정에서 거핵구계열 세포분화에 관한 연구

최문희 이화여자대학교 1999 국내박사

최근 제대혈 이식이 골수이식을 대체할 수 이는 조혈모세포 이식 방법으로 각광을 받고 있다. 제대혈은 채취가 용이하고 저장이 가능할 뿐 아니라 이식편대숙주병의 빈도가 낮은 장점이 있지만, 제대혈 속에 포함된 조혈모세포의 수가 적고 면역학적으로 더 미성숙하기 때문에 생착에 걸리는 기간이 길며, 특히 혈소판의 회복이 느리다. 성인을 대상으로한 이식이 보편화되기 위해서는 조혈모세포의 수를 증가시키는 방법의 하나로 조혈성장인자를 이용한 체외증폭(ex vivo expansion)이 필요하다. 체외증폭과정에서 조혈모세포의 증폭과 함께 분화가 일어나는데, 분화 과정에 관한 연구는 아직 잘 안되어 있다. 본 연구에서는 효과적인 증폭방법으로 알려진 thrombopoietin(TPO), flt3-ligand(FL) 및 granulocyte-colony stimulating factor(G-CSF)를 사용한 액체배양 방법으로 제대혈 조혈모세포를 체외증폭시키는 과정중 거핵구계열 세포분화 과정을 알아보고자 거핵구계열 표지와 apoptosis의 변화 및 형태학적 분화를 관찰하였다. 연구방법은 만삭분만시 채취한 제대혈로부터 CD34 양성 세포를 분리하였고(순도 > 95%) TPO, FL 및 G-CSF를 조합하여 첨가한 액체배지에 5x104 cell/mL의 농도로 4주까지 배양하였다. 거핵구계열의 표지인 GPIII(CD61), GPIIb/IIIa(CD41) 및 GPIb(CD42b)의 발현 변화를 유세포분석기로 측정하였고 7-aminoactinomycin D(7-AAD) 염색을 이용하여 apoptosis를 측정함과 동시에 삼파장 유세포분석기를 이용하여 거핵구계열 표지와의 연관성을 알아보았다. 각 시기에 cytospin을 제작하고 Wright 염색, PAS 염색 및 dual esterase 염색으로 형태학적 분화를 관찰하였다. 연구결과는 다음과 같았다. 1. 세포의 수는 TPO + FL, FL + G-CSF, 및 TPO + FL + G-CSF를 첨가하였을 때 모두 효과적으로 증가하였다. 2. GPIII, GPIIb/IIIa 및 GPIb를 발현하는 세포는 TPO가 포함된 경우에만 배양 4일부터 2주까지 출현하였는데 최고점은 11일째였다. 3. 형태학적으로도 TPO가 첨가된 경우에 배양 4일에서 2주에 걸쳐 핵이 두개인 미성숙 거핵구가 소수 출현하여 11일째에 최고를 보였으며 성숙 거핵구 및 혈소판 생성은 관찰되지 않았다. 4. 세포질 bleb이 있고 핵이 한쪽으로 치우친 미성숙 세포들이 TPO가 첨가된 경우에만 배양 4일부터 17일째에 관찰되었고 최고점은 11일째였으며 TPO에 의해 나타나는 apoptotic 세포들로 추정되었다. 5. 세포질에 bleb이 있는 미성숙 세포들은 형태학적으로 분화되지 않아 명확한 계열 구분이 어려웠으나,PAS 염색에서 점상으로 양성이었고 nonspecific esterase 염색은 세포질의 한쪽에 양성인 소견을 보여 거핵구계열 세포의 특수염색 양상과 일치하였다. 6. TPO는 배양 4일에서 2주에 걸쳐 전체 세포의 50% 정도에서 apoptosis를 유발함이 알려져 있는데 7-AAD와 동시에 염색하여 이들 apoptotic 세포들이 GPIII, GPIIb/IIIa 및 GPIb를 발현하는 세포에서 출현함을 확인하였다. 본 연구에서 제대혈 CD34 양성 세포를 체외증폭할 때 TPO를 첨가하면 거핵구계열 세포가 출현하였고 그 최고점은 배양 11일째였으며 이들 미성숙 거핵구계열 세포는 apoptosis로 진행되었다. 또한 TPO에 의한 거핵구계열로의 세포분화에 FL이나 G-CSF가 길항작용을 나타내지 않았다. 따라서 TPO, FL 및 G-CSF를 병행함으로써 체외증폭의 상승작용과 더불어 거핵구계열 세포의 분화를 유도할 수 있음을 알 수 있었다. Human umbilical cord blood(CB) dells are an alternative source of hematopoietic stem cells(HSCs) for allogeneic bone marrow transplantation. However, the use of CB is limited by a delayed engraftment due to insufficient number of HSCs. Cytokine-mediated ex vivo expansion has been proposed as a means of increasing the number of CB HSCs for transplantation. As HSCs are self-renewing and differentiating constantly, some differentiated cells should be produced during ex vivo expansion. Meanwhile, prolonged thrombocytopenia resulting from inadequate megakaryocte(MK) progenitor cell is one of the serious problems after high-dose chemotherapy followed by transplantation. In this situation, infusion of MK progenitors that are expanded ex vivo could be clinically benificial. In this study, we investigated the ability to generate MK progenitors during ex vivo expansion of CB CD34+ cells using thrombopoietin(TPO), flt3-ligand(FL), and granulocyte-colony stimulating factor(G-CSF). CD34+ cell isolated from four human cord blood were cultured in a stroma-free liquid culture system using TPO, FL, and/or G-CSF. During ex vivo expansion which was up to four weeks, surface phenotypes of cultured cells including CD34, CD61(GPIII), CD41(GPIIb/IIIa), and CD42b(GPIb) were investigated by flow cytometry, along with simultaneous measurement of apoptosis by 7-aminoactinomycin D staining method. At the same time, morphologic differentiation was studied by cytospin preparation with Wright stain, PAS stain and the dual esterase stain. Total viable cells increased continuously in the culture with the cytokines until the 4th week. TPO, FL, and G-CSF were synergistic for expansion of total cells. The megakaryocytic cells with CD61, CD41, and CD42b expression appeared in the culture with TPO from the 4th day to the 2nd week of culture. The maximum expression of these markers was observed on the 11th day of culture. TPO also induced apoptosis during this period, and these apoptotic cells were generated from CD34-CD61+, CD34-CD41+, and CD34-CD42b+ fractions. Morphologically, the majority of the cells were poorly differentiated mononuclear cells with increased cytoplasm until the 2nd week of culture, except a few binuclear cells with large cytoplasmic volume even in the presence of TPO. Mature megakaryocytes and proplatelet displaying megakaryocytes were not observed. Some immature cells with cytoplasmic bleb, which were suggested as apoptotic cells appeared in the cultures with TPO from the 4th day to the 17th day of culture. These cells were positive for the PAS stain in block pattern and were also positive for nonspecific esterase, which suggests megakaryocytic lineage. In conclusion, during the ex vivo expansion of human cord blood CD34+ cell using TPO, FL, and G-CSF, TPO is able to induce megakaryocytic differentiation. MK progenitors generated ex vivo in this study were suggested to undergo apoptosis. Morpholoically, those cells were not fully differentiated. CD34+GP+ MK progenitors may be an appropriate cell population for transplantation for the prophylaxis of prolonged thrombocytopenia after transplantation. The efficacy of this procedure will be tested prospectively in a clinical trial.

제대혈 조혈모세포의 CD34 양성세포 체외증폭과 증폭세포의 특성에 관한 연구

정성룡 경희대학교 대학원 1998 국내박사

간세포암에서 CD34 발현의 임상적 의의

편준철 고신대학교 대학원 1999 국내석사

배경(목적): 혈관신생의 중요성에 대해서는 여러 가지 악성종양에서 광범위하게 연구되어 왔다. 그러나 간세포암에서의 혈관신생에 관한 연구는 아직까지 미미한 상태이다. 혈관신생의 정도는 CD34 항원의 발현으로 측정가능하다. 이 발현정도가 간세포암의 조직분화도, 크기 그리고 환자의 생존에 어떤 영향이 미치는가를 규명하기 위하여 다음과 같은 연구를 시행 하였다. 대상 및 방법: 간세포암으로 치료적 간절제술을 시행한 46 예 환자 들을 대상으로 하였다. 파라핀에 포매하여 보관하고 있던 간세포암과 그 주 변조직을 이용하여 헤마톡실린-에오진 염색을 실시하여 Edmondson-Steiner 의 기준에 따라 4등급으로 조직학적 등급을 구하였다. CD34 항원을 avidin-biotin complex (ABC) 방법으로 면역조직화학적 염색하여 신생혈 관의 수를 산정하여 CD34 항원의 발현정도를 계수적으로 나타내었다. 결과 : 1) CD34 항원은 전 예의 간세포암조직에서 뚜렷하게 나타났 으며 간세포암 주위 간경변 조직에서는 재생결절 주위로 약하게 발현했 다. 2) 신생 미세혈관의 밀도는 간세포암조직과 간세포암 주변 간경변 조직에서 각각 28.4±14.6, 6.6±5.6개로 간세포암 조직에서 유의하게 높 았다(p=0.001). 조직학적 등급이 저등급(Edmondson's grade I-II)인 조 직표본 30에서 25.9±15.5개 였고, 고등급(Edmondson's grade III-IV)인 조직표본 16 예에서는 33.1±11.8개로 고등급 군에서 증가하는 경향을 보였다(p=0.085). 종양의 크기가 5.0cm 미만인 군 27 예와 5.0cm이상인 군 19 예의 신생혈관 밀도는 각각 30.6±15.1개, 25.3±13.6개로 종양의 크기가 큰 군에서 낮았으나 통계적 유의성은 보이지 않았다. 3) 평균 신 생 미세혈관 밀도 28.4를 기준으로 한 저밀도 군과 고밀도 군 사이에 수 술후 생존률은 64주까지 저밀도 군에서 유의하게 높았다(p=0.043). 결론: 간세포암에는 CD34 항원의 발현정도는 간경변증에서 미세결절 의 간세포암인지 아닌지 구분하는 보조적 진단 도구로 이용할 수 있을 것이다. CD34 발현은 간세포암의 크기가 작은군에서, 간세포암의 조직분 화도 즉 조직학적 등급이 높은 군에서 신생혈관 밀도가 증가하는 경향을 보였다. CD34의 발현은 환자의 생존률에 영향을 미치는 것으로 나타났 으며, 이는 간세포암의 조직분화도나 크기와 관련없이 독립적으로 영향 을 미치는 것으로 생각되었다. Background/Aims : The significance of angiogenesis was extensively investigated in different human tumors, but its role in hepatocellular carcinoma has scarely been evaluated. It is known that the degree of angiogenesis could be evaluated by observing the CD34 expression. In the present study. We studied whether or not the expression of CD34 has the correlation with histopathological grade, size and survival in hepatocellular carcinoma patients. Patients and methods : In 46 patients who had undergone curative hepatic resection for hepatocellular carcinoma, the expression of CD34 in hepatocellular carcinoma and its surrounding cirrhotic tissue was presented by new microvessel density. Result : 1) The expression of CD34 was diffuse and strong in all hepatocellular carcinoma tissue and sparse in surrounding cirrhotic tissue and regenerating nodule, where the expression was noticed peripherally. 2) The mean new microvessel density was significantly higher in hepatocellular carcinoma tissue (28.4±14.6) than in the surrounding cirrhotic tissue (6.6±5.6)(p=0.001), was higher in the group of Edmondson's grade I-II (n=30;25.9±15.5) than in the group of Edmondson's grade III-IV (n=16;33.1±11.8;p=0.085). The new microvessel density in patients (n=27) with tumor smaller than 5.0cm in diameter was more numerous (30.6±15.1) than in patient(n=19) with larger than 5.0cm in diameter (25.3±13.6) (p=0.225). 3) Overall survival was better in patients (n=22) with high new microvessel density (>28.4) was better than in patients (n=24) with low new microvessel density significantly (p=0.043). Conclusion : The expression of CD34 may serve as the diagnostic tool in differentiating the hepatocellular carcinoma from benign regenerating nodule. but showed no significant correlation with size and histopathological grade of hepatocellular carcinoma. Intratumoral microvessel density was significantly related with patient's overall survival, and it seemed to be an independent prognostic factor.

Comparison of Red Blood Cell Marker Expression According to CD34 Expression Rate in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Hematopoietic Stem Cells

LEE Gill 건국대학교 대학원 2023 국내석사

연구배경: 현재 수혈이 필요한 경우에는 전량 헌혈에 의존하고 있으며 이에 따라 혈액 부족과 관련된 문제가 전 세계적으로 대두되고 있다. 저출산·고령화로 인해 헌혈에 의존한 현행 혈액 공급 체계로는 수요를 감당하기 어렵고, 코로나바이러스 감염증-19와 같은 질병으로 인해 수혈 부족현상이 나타나고 있다. 특히 빈혈 환자에게 주로 사용되는 적혈구는 치료를 위해 많은 양의 세포가 필요하다. 이러한 문제를 해결하기 위해 유도만능줄기세포 유래 적혈구 생산에 대한 연구가 이루어지고 있다. CD34는 조혈줄기세포를 확인하기 위해 사용하는 세포 표지자로 사용하고 있으며, 조혈줄기세포를 이동을 증가시킨다는 연구도 있다. 하지만 아직까지는 CD34의 기능에 대해서는 완벽하게 밝혀지지 않아서 기능과 관련된 추가적인 연구가 필요하다. 선행연구에서 조혈줄기세포를 증식시키는 과정에서 증식기간이 지남에 따라 CD34의 발현율이 낮아지는 것을 확인하였고 이에 따라 CD34발현율에 따른 인간유도만능줄기세포 유래 조혈줄기세포로부터의 적혈구 분화의 영향을 확인해보고자 하였다. 본 연구에서는 인간유도만능줄기세포유래 조혈줄기세포로부터의 적혈구 분화 과정에서 CD34 발현 차이에 따른 적혈구 마커의 발현 차이를 비교하여, CD34 발현율 차이에 따른 적혈구 마커의 발현의 영향을 확인하고자 한다. 연구방법: 인간유도만능줄기세포를 배양하여 유도만능줄기세포의 전분화능을 확인하고 대조군으로 인간유도만능줄기세포에서 적혈구로 분화를 시켰으며, 실험군으로 사용하기 위한 인간유도만능줄기세포 유래 조혈줄기세포를 제작한다. 제작된 인간유도만능줄기세포 유래 조혈줄기세포의 특성을 조혈줄기세포 세포표지자를 사용하여 확인하고, 조혈줄기세포 제작 직후와 증식배지가 사용된 조혈줄기세포 증식 3일차, 증식배지에 UM729가 첨가된 조혈줄기세포 증식 3일차군으로 나누어 CD34의 발현율의 차이를 확인한다. 각 실험군들을 적혈구로 분화시킨 후 적혈구 세포표지자를 사용하여 분화 및 마커 발현 차이를 확인한다. 모든 특성 분석 및 세포표지자는 유세포 분석을 통해 확인하였다. 연구결과: 내배엽, 중배엽, 외배엽 표지자를 사용하여 인간유도만능줄기세포의 증식과 전분화능을 확인하였고 인간유도만능줄기세포 유래 조혈줄기세포가 제작되었다. 제작한 인간유도만능줄기세포 유래 조혈줄기세포는 세포표지자인 CD34, CD43, CD45, CD59 그리고 CD90을 통해 특성을 확인하였다. 인간유도만능줄기세포에서 적혈구로 분화시킨 것을 대조군, 인간유도만능줄기세포 유래 조혈줄기세포 제작 직후의 실험군, StemPro-34 SFM을 사용하여 3일간 증식한 실험군, StemPro-34 SFM에 UM729를 첨가해 3일간 증식한 실험군으로 실험을 진행하였다. 대조군과 증식이 완료된 실험군들에 대한 CD34 발현율을 확인하였으며, 각 실험군들을 적혈구로 분화시켜 분화 14일 후 적혈구 세포표지자인 CD71, CD235a를 확인하였다. 그 결과 인간유도만능줄기세포 유래 조혈줄기세포 제작 직후의 실험군만이 대조군과 유사한 CD34 발현율을 나타내었으며, 적혈구 세포표지자 또한 유사하게 발현하였다. 증식된 실험군들은 대조군과 비교하여 CD34 발현율이 낮았으며 적혈구로 분화 후 적혈구 세포표지자 발현 또한 낮게 나타나는 것을 확인하였다. 결론: 본 연구에서는 인간유도만능줄기세포 유래 적혈구 분화에서 CD34 발현율의 차이에 따라 적혈구의 분화 후 적혈구 세포표지자 발현의 차이를 확인하였다. 인간유도만능줄기세포를 이용한 인공혈액을 혈액제제로 이용하기 위해서는 많은 수의 적혈구가 필요한데 본 연구를 통해 인간유도만능줄기세포 유래 조혈줄기세포의 CD34 발현을 높게 유지시키면서 증식이 되는 것이 혈액제제로서의 이용 가능한 적혈구로의 분화가 용이하다는 것을 확인하였다. 또한 향후 인간유도만능줄기세포 유래 조혈줄기세포의 CD34 발현율 차이로 혈소판, 자연살해세포 등 다른 혈액제제들의 분화를 유도할 수 있는 연구에도 적용할 수 있을 것으로 예상한다. Background: Blood transfusions rely entirely on blood donations, leading to emerging problems related to blood shortages worldwide. Due to the low birth rate and an aging population, meeting the demand with the current blood supply system has become challenging. In addition, diseases such as Covid-19 have exacerbated the shortage of blood for transfusions. Anemic patients, who primarily require red blood cells, need large amounts of these cells for treatment. To address this issue, efforts are being made to produce red blood cells through artificial blood products derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). CD34 serves as a surface marker of hematopoietic stem cells (HSCs), and some studies have shown that it promotes HSC migration. However, the exact function of CD34 has not been fully identified, necessitating further research on its role. Previous studies have revealed that the expression rate of CD34 decreases over the growth period, and the effect of CD34 expression on erythroid differentiation of hiPSC-derived HSCs has been confirmed. By comparing the variation in the expression of red blood cell markers according to the levels of CD34 expression during the differentiation process from hiPSC to erythroid, I aim to confirm the influence of CD34 expression rate on the expression of red blood cell markers. Materials and Methods: Human induced PSCs were cultured to confirm their tri-lineage characteristics. They were differentiated into erythroid cells to serve as a control group, and hiPSC-derived HSCs were generated to be used as the experimental group. The characteristics of the hiPSC-derived HSCs were assessed using HSC surface markers under three different conditions; (i) immediately after HSCs production, (ii) after three days of HSCs proliferation in proliferation medium, and (iii) after three days of HSCs proliferation in proliferation medium supplemented with UM729. The difference in CD34 expression rates among the three groups was confirmed. After the experimental groups underwent erythroid differentiation, the expression of erythroid surface markers was examined. All characteristics and surface markers were confirmed by flow cytometry analysis. Results: Endoderm, mesoderm, and ectoderm markers are used to confirm the proliferation and pluripotency of hiPSCs, and hiPSC-derived HSCs were generated. The characteristics of hiPSC-derived HSCs were confirmed by the surface markers CD34, CD43, CD45, CD59, and CD90. To establish a control group, hiPSCs were differentiated into erythroid cells. Three experimental groups were included: one immediately after the production of hiPSC-derived HSCs, one that underwent three days of proliferation with StemPro-34 SFM, and another that underwent proliferation for three days with the addition of UM729 to StemPro-34 SFM. The CD34 expression rate was confirmed for the control and experimental groups that completed proliferation. Furthermore, the experimental groups were differentiated into erythroid cells, and the erythroid surface markers CD71 and CD235a were detected 14 days after differentiation. The results showed that, only the experimental group that underwent differentiation immediately after the production of hiPSC-derived HSCs exhibited a similar CD34 expression rate to the control group, along with similar erythroid surface marker expression. It was also observed that the proliferated experimental groups had lower CD34 expression rates compared to the control group. Moreover the expression of the erythroid surface marker was also lower after erythroid differentiation. Discussion: In this study, the difference in the expression of erythroid markers after the differentiation of erythroid cells was examined in relation to CD34 expression rate. A large number of red blood cells is required to use hiPSC-derived artificial blood as a blood product. This study confirmed that maintaining a high CD34 expression rate in hiPSC-derived HSCs facilitates their differentiation into red blood cells that can be utilized as a blood product. In the future, it is expected that this approach could be used to induce the differentiation of other blood products, such as platelets and NK cells, by considering the variation in the CD34 expression rate of hiPSC-derived HSCs.

제대혈 유래 CD34 양성세포로부터 적혈구 분화유도와 microarray를 이용한 유전자 발현변화 분석

김창기 연세대학교 대학원 2005 국내석사

RBCs are produced by erythropoiesis in the bone marrow with a help of erythropoietin (EPO), which is a key factor for RBCs production. For Ex vivo generation of RBCs, a lot of studies used sequential culture protocols, which were consisted of the expansion period without EPO and the differentiation period with EPO. In this study, we have tried to generate RBC from CD34+ cells in cord blood using 3 steps culture protocol and also evaluated the changes in immunophenotypic characteristics and genetic profiles according to EPO concentration and culture duration.Using mini-MACS columns, CD34+ cells were isolated from cord blood. The culture procedure comprised three steps. For each step, cells were cultured sequentially for 7 days in a serum free liquid medium with specific combinations of growth factors for 21 days. [1st step: Flt3-ligand (Flt3-L), thormbopoietin (TPO) and stem cell factor (SCF); 2nd step: IGF-1, SCF, EPO; 3rd step: IGF-1, EPO] To evaluate the EPO effect on proliferation and differentiation, cells were cultured with three different EPO concentrations (0, 3, 10 & 20 UmL). Cell count and morphology were monitored during this period. For phenotyping, antibodies to CD34, CD38, CD45 and glycophorin A (GPA) were used and phenotype analyses were performed on an EPICS XL. The genetic profile of cultured cells was analyzed by 17,000-gene microarray analysis.As erythropoietin concentration increased, cell expansion was also increased, showing a maximum expansion at 20 Uml (233-fold amplification). The cell population showed a gradual decrease in expression of CD34 and CD45 whereas the expression of GPA was not prominent in any conditions (less than 3%). Through the SAM (significant analysis of microarray), 125 genes that showed significant results were selected. When we analyzed genes associated with erythropoiesis, we observed increased expression in glycophorin A, rhesus blood group, CcEe antigens, erythrocyte membrane protein band 4.2 and erythropoietin receptor gene as cultures progressed.Our study shows that erythropoietin enhance a proliferation of hematopoietic progenitor cells as well as a differentiation to erythroid lineage. Our culture system did not achieve pure production of RBCs, but induced genetic changes that indicated erythroid differentiation. 적혈구는 골수의 조혈모세포에서 여러 단계를 거쳐 생성되며, erythropoietin (EPO)은 적혈구 생성에서 가장 중요한 성장인자로 알려져 있다. 대부분의 적혈구 분화를 위한 시험관내 배양은 EPO를 첨가하지 않고 조혈모세포의 증식을 촉진하는 단계와 EPO의 자극을 통해 적혈구 분화를 유도하는 단계로 구성된다. 따라서 본 연구에서는 제대혈 유래 조혈모세포로부터 적혈구로 분화시키는 과정에서 EPO를 첨가하는 시기와 농도를 달리하여 첨가하는 방법을 통해 RBC 분화에 미치는 EPO의 효과를 평가하였으며, 연구의 최종목표는 제대혈 유래 CD34 양성 세포로부터 적혈구 분화를 유도하고자 하였다.건강한 산모의 제대혈에서 Ficoll-Hypaque 및 MACS system을 이용하여 CD34 양성세포를 분리하였으며, 배양은 여러 성장인자의 조합을 달리하여 세 단계로 총 21일간 진행하였다. 배양 첫 1주간은 stem cell factor, Flt-3 ligand, thrombopoietin을 첨가한 배지에서 CD34 양성세포의 증폭을 유도하였으며, EPO는 배양 8일부터 21까지 3 UmL의 농도로 첨가하였다. 또한 EPO의 농도에 따른 효과를 알아보기 위하여 배양 초기부터 EPO를 0, 3, 10 그리고 20 UmL의 농도로 첨가하여 배양을 진행하였다. 배양기간 동안 세포의 수와 형태를 관찰하였고 유세포분석기를 이용하여 CD34, CD38, CD45, glycophorin A (GPA)의 표현변화를 측정하였다. 또한 분화과정에서 유전자의 변화를 알아보기 위해서 high density microarray 방법을 이용하여 유전자의 발현 정도를 분석하였다.세포증식은 모든 배양 조건에서 배양 14일에 가장 높았고 그 이후 감소하기 시작하였다. EPO 농도에 따른 배양 효과를 비교하였을 때, EPO를 20 UmL 농도로 첨가한 경우에서 세포수가 가장 많이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 3주 배양 시 유핵 적혈구 및 적혈구의 전형적인 세포는 거의 관찰되지 않았으며 유핵세포에서의 GPA의 표현도 낮게 측정되었다. Microarray 분석에서 false detection rate (FDR)이 0.74%인 유전자는 총 125개였다. 이중 배양 7일에 비해 14일에서 그 발현이 3배 이상 증가한 유전자가 17개 있었으나, 적혈구 분화와는 상관성이 낮은 유전자였다. 그러나 적혈구 분화와 관련이 높은 유전자 항목을 개별적으로 분석한 결과 glycophorin A, Rhesus blood group CcEe antigens, erythrocyte membrane protein band 4.2 그리고 erythropoietin receptor 유전자의 발현이 배양이 진행되면서 증가함을 알 수 있었다.결론적으로 조혈모세포로부터 적혈구를 생산하고자 할 경우 EPO의 농도와 세포 증식간에는 양의 상관성이 있었다. 또한 배양 초기부터 EPO를 첨가하는 경우에서 더 많은 세포수가 증가하여 EPO를 후기 배양에 첨가하는 기존 방법보다 우수한 것으로 생각되었다. 그러나 3주 배양이 진행되는 과정에서 적혈구 분화에 관련된 유전자들의 발현은 증가하였으나 배양세포의 형태나 표현형 분석 결과 적혈구 계열 세포보다는 다른 계열 세포로의 분화가 더 많이 관찰되었다. 따라서 적혈구 분화배양의 순수도를 높이기 위하여 성장인자 조합 외에도 미세 환경 조성과 조혈모세포와 보급세포와의 상호작용 등 적혈구 분화에 미치는 요소에 대한 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.

소아 급성골수성백혈병에서 CD34 항원의 임상적 의의

임선주 부산대학교 대학원 2003 국내석사

목적 : 급성골수성백혈병에 대한 항암화학요법이 발달함에 따라 치료에 대한 반응이나 예후를 예측하여 치료 방법을 결정하고자 하는 노력이 있어 왔다. CD34 항원은 조혈 전구세포의 표지자로서 급성골수성백혈병의 불량한 예후인자로 알려져 있으나 근래에는 예후와 무관하다는 보고도 있어 논란이 있는 상태이다. 저자들은 소아의 급성골수성백혈병에서 CD34 항원의 발현에 따른 임상적 특징과 생존율 등을 조사하여 CD34 항원이 예후 예측인자로 고려될 수 있는지를 조사하였다. 방법 : 1996년 1월부터 2002년 12월까지 부산대학교 병원 소아과에 입원하여 골수 흡입 및 생검상 급성골수성백혈병으로 확진된 환아 중 관해유도화학요법을 시행받고 1년 이상 경과 관찰이 가능했던 21례를 대상으로 하였다. CD34 항원을 포함한 면역표현형 검사는 단클론 항체를 이용하여 직접 면역 형광법으로 염색을 하여 유세포기로 분석하였다. CD34 항원 발현 유무에 따라 진단 당시 나이를 포함한 임상적 특징, 진단 당시 백혈구수 등의 검사 소견, 치료 반응 및 생존률을 비교하였다. 결과 : 1) 대상 환아의 69.1%(16/23)에서 CD34 항원이 발현되었으며, CD34 항원 발현 유무에 따른 성별, 진단시 연령, 혈액학적 소견의 유의한 차이는 없었다. 2) FAB 분류와 염색체 이상은 양군간에 의의있는 차이를 보이지 않았으나 CD34 항원이 양성인 환자에서 M2 아형이 상대적으로 많았고, t(8:21)을 보이는 핵형이 43.7%(7/16)로 높은 비율을 보였다. 3) CD34 항원 양성군의 완전관해율은 68.7%(11/16), 음성군의 완전관해율은 80%(4/5)로 CD34 항원 음성군에서 완전관해율이 약간 높았으나 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. 4) CD34 항원 양성군에서는 11명 중 6명이 재발하여 55%의 재발율을 보였으나 음성군에서는 4명 중 1명이 재발하여 25%의 재발율을 보였으나 양군간에 통계학적인 의의는 없었다. 5) CD34 항원 음성군의 완전관해기간은 35.0±8.0개월로서 양성군의 26.8±7.5개월에 비하여 약간 길었으나 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. 6) 양군간에 무질병 생존률 및 전체 생존율은 의의있는 차이가 없었다. 결론 : 소아 급성골수성백혈병에서 CD34 항원은 약 70%의 환아에서 발현되며 CD34 항원 양성 유무는 소아 급성골수성백혈병의 전체 예후와는 큰 관련이 없는 것으로 생각되나 더 많은 증례를 통한 연구가 필요할 것으로 판단된다. Propose : Prognostic factors are useful to choose the most appopriate therapy for patients with acute leukemia. Previous data suggested that CD34 expression may be associated with poor prognosis factor in AML. But this still remain controversal. We retrospective investigated the relationship between CD34 expression and clinical characteristics and outcome in 21 childhood patients with AML. Methods : Twenty-one child patients with AML at the Department of Pediatrics in Pusan National University Hospital between January 1996 and December 2002 were included. Expression of CD34 antigen on the leukemic blasts was analyzed by flow cytometry using indirect immunofluorescence method. Samples were considered positive when more than 20% of cells were labeled. We compared the clinical features, laboratory findings and survival rates of CD34+ AML with those of CD34- AML. Result : CD34 was positive in 69.1% of patients with AML. There was no significant differences in clinical characteristics, laboratory finding and survival rate between the CD34+ and CD34- groups. The patients with CD34+ frequently had M2 subtype and cytogenetic abnormality of t(8:21) which is considered as a favorable factor in AML. Conclusion : This shows that there is no significant clinical and prognostic implication of CD34 expression in childhood AML.

자가 말초혈액 조혈모세포이식환자에서 CD34양성 세포 채집성공의 예측인자

김문자 경북대학교 대학원 2012 국내박사

Autologous peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT) has been used as a major treatment strategy for hematological malignancies. The number of CD34 positive cells in the harvested product is a very important factor for achieving successful transplantation. We studied the factors that can predict the number of CD34 positive cells in the harvested product of acute myelocytic leukemia (AML), multiple myeloma (MM) and non-hodgkin’s lymphoma (NHL) patients after mobilizing them with chemotherapy plus G-CSF. A total of 73 patients (AML 19 patients, MM 28 patients, NHL 26 patients) with hematological malignancies had been mobilized with chemotherapy and granulocyte colony-stimulating growth factor from April, 2000 to February, 2012. Group’s characteristics, checkup opinion of pre-peripheral blood on the day of harvest & outcome of PBSC were analyzed and evaluated using SPSS statistics program after grouping patients as below; group 1 : CD34 cell counts < 2×106/kg (n=15); group 2 : 2 ×106/kg ≤ CD34 cell counts < 6×106/kg (n=33); group 3 : CD34 cell counts ≥ 6×106/kg (n=25). We analyzed the clinical characteristics, the peripheral blood (PB) parameters and the number of CD34 positive cells in the PB and their correlation with the yield of CD34 positive cells collected from the mobilized patients. The total number of leukapheresis sessions was 263 (mean: 3.55 session per patient), and the mean number of harvested CD34 positive cells per patient was 7.37×106/kg. The number of CD34 positive cells in product was significantly correlated with the number of platelet and CD34 positive cells in peripheral blood (P<0.05). The number of PB CD34 positive cells was the best significant factor for the quantity of harvested CD34 positive cells on the linear regression analysis (P<0.05). Many factors could influence the mobilization of peripheral blood stem cells. Platelet count and PB CD34 positive cells count were the two variables which remained to be significant in multivariate analysis. Therefore, The number of platelet and CD34 positive cells in peripheral blood on the day of harvest can be used as an accurate predictor for successful peripheral blood stem cell collection.

신경초종과 신경섬유종의 감별진단에서 calretinin, CD56과 CD34의 유용성 : Utility of calretinin, CD56, and CD34 in differential diagnosis of schwannoma and neurofibroma

박지영 계명대학교 대학원 2010 국내석사

배경: 신경섬유종과 신경초종의 감별은 임상적으로 중요한 의미를 가진다. 이는 신경을 보존 혹은 절제할 것이냐는 수술적 치료 방침을 결정하는 지침이 될 뿐만 아니라 신경섬유종의 악성화 가능성 때문이다. 실험방법: 본 연구는 신경초종 101 예와 신경섬유종 103 예를 대상으로 하였다. 대상 증례의 H&E 염색표본을 병리의사가 재검사하여 대표적인 종양 부위에 해당하는 파라핀 블록으로부터 tissue microarray를 제작하였다. S-100 단백, calretinin, CD56, CD34, neurofilament 단백과 EMA를 일차항체로 사용하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 통계적 분석을 위해 SPSS 17.0 version을 이용한 피셔의 정확 검정법을 수행하였다. 결과: S-100 단백은 신경섬유종 3 예를 제외하고 모든 증례에서 양성반응을 보였다. Calretinin은 신경초종에서는 26.7%에서 양성이었으나, 신경섬유종에서는 모두 음성이었다. CD56은 신경초종의 77.2%에서 양성반응을 보였으나 신경섬유종에서는 9.8% 만이 양성이었다. CD34는 신경초종의 42.5%에서 양성이었고 신경섬유종에서는 80.2%가 양성으로 반응하였다. 통계학적 분석을 통해 calretinin은 신경초종에서 높은 특이도를 나타내었고(p<0.001), CD56은 신경초종에서 높은 민감도를 보였다 (p<0.001). CD34는 신경섬유종에서 높은 민감도를 가지고 있는 것으로 나타났다 (p<0.001) 결론: 신경초종과 신경섬유종을 감별하는데 있어 calretinin, CD56과 CD34 항체를 조합한 면역조직화학염색법이 매우 유용하게 사용될 수 있다고 생각된다. Background: Differentiation between schwannoma (SC) and neurofibromas (NF) in cases with overlapping histopathologic features is important to determine surgical rationale to preserve or sacrifice nerve and the possibility of malignant transformation of NF. Methods: We studied 101 cases of SC and 103 cases of NF. All the H&E slides were reviewed. Tissue microarrays were prepared from the representative areas. Immunohistochemistry was performed using antibodies of S-100 protein, calretinin, CD56, and CD34 using Labvision kit. Analysis of correlations was evaluated using Fisher exact tests with SPSS 17.0 software package. Results: S-100 protein was positive in all cases except 3 NFs. Calretinin was positive in 26.7% of SCs (27/101 cases), whereas negative in all NFs. CD56 was positive in 77.2% of SCs (78/101 cases) and 9.8% of NFs (10/102 cases). CD34 was positive in 42.5% of SCs (43/101 cases) and 80.2% of NFs (81/101 cases). Statistically, the SCs showed significantly high specificity for calretinin (p<0.001) and high sensitivity for CD56 (p<0.001). CD34 expression revealed a possibility of high sensitivity (p<0.001) to identify NFs. Conclusions: The immunohistochemistry of calretinin, CD56, and CD34 in combination may be very useful for differentiating SCs from NFs.

말초혈액 조혈모세포 채집에 있어 Stem-Kitⓡ를 이용한 채집전 말초혈액내 CD34+ 세포수 산정의 의의

김광진 전남대학교 대학원 2001 국내석사

최근 골수이식을 대치하여 널리 시행되고 있는 말초혈액 조혈모세포 이식술은 CD34+인 조혈모세포를 체중당 일정기준 이상으로 채집하여야 성공률이 높다고 알려져 있다. 유세포 분석기를 이용한 CD34+ 세포수의 측정은 최근 변형 ISHAGE protocol 이 발표됨에 따라 표준화가 가능하여졌다. 본 연구는 Stem-Kit^ (Coulter/Immunotech, Marseille, France)를 이용하여 말초혈액 조혈모세포 채집술을 시행한 채집산물의 CD34+ 세포수를 측정하여 이를 채접전 말초혈액의 백혈구, 단핵구 및 CD34+ 세포수와 비교함으로써 채접전 분석 결과가 채집산물의 CD34+ 세포수를 예측할 수 있는가를 평가해보았다. 관찰 대상은 자가 말초혈액 조혈모세포 이식술을 위해 대용량의 말초혈액 조혈모세포 채집술을시행한 26명의 고형 및 혈액종양 환자로부터 얻은 88예의 채집전 말초혈액과 채집산물이었다. 채집전 말초혈액과 채집산물내의 CD34+ 세포수는 Stem-Kit^� (coulter/Immunotech, Marseille, France)를 이용하여 측정하였고, 백혈구수와 단핵구수는 Coulter STKS^� (Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA)로 측정하였다. 88 예에서 각각의 채집전 말초혈액과 채집산물 검사성적간의 상관관계 및 회귀분석을시행하였다. 88 회의 말초혈액 조혈모세포 채집술 결과 채집산물내의 CD34+ 세포수는 1.59 土 2.61 (0.01∼17.35) × 10^6/Kg 였고, 채집전 말초혈액의 백혈구수, 단핵구수, CD34+ 세포수는 각각 10.57 ± 8.36 (1.50∼32.50) ×10³/μL, 1.85 ± 1.28 (0.39∼7.43) ×10³/μL, 17.21 ± 33.19 (0.12∼239.19) ×10³/μL 이었다. 채집전 말초혈액내 백혈구수, 단핵구수, CD34+ 세포수와 채집산물의 CD34+ 세포수를 비교한 결과 채접전 말초혈액내 CD34+ 세포수와 채집산물의 CD34+ 세포수는 높은 상관관계를 보였다(r=0.97, P<0.05). 말초혈액내 CD34+ 세포수가 3/μL 미만인 경우 0%, 3∼6개/μL 인 경우 50%에서 0.5 × 10^6/Kg이상을 채집할 수 있었고, 10∼20 개/μL 인 경우 89%에서 1.0 × 10^6Kg 이상을 채집할 수 있었고, 31%에서 2.0 × 10^6/Kg 이상을 채집할 수 있었다. 따라서 말초혈액내 CD34+ 세포수가 μL 당 3 개 이상인 경우 말초혈액 조혈모세포 채집술을 시행하는 것이 효과적이라 생각되었으며, Stem-Kit^�를 이용한 말초혈액내 CD34+ 세포수의 측정은 조혈모세포의 가동화 정도를 예측하고 효과적인 말초혈액 조혈모세포 채집시기 결정에 있어 예측인자로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. Peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT) has been widely used as a substitute of bone marrow transplantation for the treatment of various solid tumors or hematologic malignancies. The success of PBSCT is correlated with CD34+ stem cell counts per kilogram of recipient body weight. Standardization of flow cytometric CD34+ cell enumeration was improved by the modified International Society of Hematotherapy and Gene Engineering (ISHAGE) protocol. The purpose of this study was to evaluate the peripheral parameters (WBCs, mononuclear cells, CD34+ cells) that may predict the absolute CD34+ cell counts in the PBSC harvest, using the Stem-Kit^� (Coulter/Immunotech, Marseille, France). This study tested 88 PBSC harvests and peripheral blood (PB) on the day before collection from 26 patients. The CD34+ cells were analyzed by Stem-Kit^�. The WBC and MNC counts were measured by Coulter STKS^� (Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA). The correlation and regression analysis between peripheral parameters (WBCs, MNCs, CD34+ cells) and absolute CD34+ cell counts in harvest were performed. The CD34+ cell counts per body weight (Kg) of 88 PBSC harvests were 1.59±2.61 (0.01∼17.35). The WBC, MNC, and CD34+ cell counts in PB were 10.57 ± 8.36 (1.50∼32.50) × 10³/μL, 1.85 ± 1.28 (0.39∼7.43) × 10³/μL, and 17.21 ± 33.19 (0.12∼239.19), respectively. The CD34+ cell count in PB significantly correlated with CD34+ cell per body weight in the harvest (r=0.97 , P<0.05). In conclusion, the peripheral blood stem cell collection was efficient when mobilized PBSC counts were 3 cells/μL or more in the peripheral blood.