핵산당을 이용한 저분자 화합물의 시알산화를 포함한 당화 : GLYCOSYLATION INCLUDING SIALYDATION OF SMALL MOLECULE BY ADDITION OF NUCLEOTIDE-SUGARS

김대희 선문대학교 대학원 2011 국내박사

Sugars are the most widely and abundantly distributed class of biomolecules in nature and the molecules most commonly involved in cell recognition and communication. Most sugar units can be attached to aglycon when they are activated by nucleotide diphosphates. Nucleotide-sugars are the activated forms of monosaccharides. Nucleotide-sugars act as glycosyl donors in glycosylation reactions by a group of enzymes called glycosyltransferases. However, it still has several drawbacks on efficacy, including poor activity of glycosyltrasferase and limited availability of various activated glycan units. To overcome several drawbacks, we have studied to producce of various nucleotide-sugars from cheap starting material by one-pot reaction system and adapted glycosylation including sialydation of oligosaccharides and small molecule such as vancomycin and flavonoids. We have obtained GlcNAc-2-epimerase (NANE) enzyme, which is responsible for the production of a key intermediate ManNAc in the biosynthesis of CMP-NeuAc, from Bacterodes fragilis. The GlcNAc-2-epimerase required ATP and Mg2+ for activation, but the results show that our GlcNAc-2-epimerase (NANE) is independent ATP and Mg2+. Moreover, our study indicates that CMP-NeuAc can be synthesized on a large scale from GlcNAc and CMP using five recombinant enzymes including GlcNAc-2-epimerase. Above 90% of yield was achieved based on the amount of CMP. Enzymatic synthesis of TMP and 2-deoxy-glucose could successfully produce large amount of TDP-2-deoxy-glucose in one pot by employing phosphomannomutase. Based on all the preliminary experimental results, the one-pot enzymatic synthesis of TDP-2-deoxy-glucose was performed . GerS is TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose aminotransferase enzyme, which is responsible for the production of a key intermediate TDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose in the biosynthesis of deoxyaminosugar (D-desosamine) and, although the L-glutamin shows substrate activity in the transamination, L-glutamic acid is better source of C4-amino group for conversion to TDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose. Moreover, our study indicates that TDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose can be synthesized on a preparative scale from glucose-1-phosphate and TMP using five recombinant enzymes. Enzymatic synthesis of UMP and glucosamine could successfully produce large amount of UDP-glucosamine in one pot by employing phosphomannomutase, N-acetyl-glucosamine kinase and glucose-1-phosphate uridyltransferase. The optimal metal ion concentration for the overall reaction was Mg2+ 20 mM, and the optimal pH was pH8.0. Therefore, this study can help to synthesize various nucleotide-deoxysugars and nucleotide-aminosugars based on generation of in vitro metabolic pathway. Large scale production of CMP-NeuAc has been greatly desired for enzymatic synthesis of sialyloligosaccharides. And production of various nucleotide-sugars can help to study new antibiotics with sugar moiety in vivo and in vitro combinatorial biosynthesis. Sialyloligosaccharides in glycoproteins and glycolipids and Fucose-containing glycans especially play very important roles in a large variety of biological processes. Sialyllactose was produced from cheap substrates, i.e. GlcNAc, pyruvate, and CMP by one-pot reaction in vitro. The conversion yield of sialyllactose was 650% from CMP and 81% from GlcNAc under the conversion rate of CMP-NeuA between 7.5 mM/hr and 8.5 mM/hr. The purification yield of sialyllactose sodium salt, minimum 98% by Bio-LC analysis, was 75% from reaction mixture. Sialyllactose production with in situ CMP regeneration system was successfully carried out using the cell free extracts. We selected a candidate for 1,3-fucosyltransferase (FucT3) gene from Bacteroides fragilis 9343 through the homology search using the amino acid sequence of H. pylori enzyme. We could successfully produce to Lewis X from LacNAc using 1,3-fucosyltransferase. Furthermore, We will could produce to various functional oligosaccharides such as sialy Lewis X (SLex) . We used an enzymatic approach to generate novel vancomycin derivatives using two glycosyltransferases (β1,4-GalT and α2,3-SiaT) from other origins and demonstrated the incorporation of galactose and Sia onto the D-glucose glycone of both vancomycin and pseudo-vancomycin. In addition, the MIC test results showed that the antibiotic activities of galactose-containing derivatives against the MRSA and VSEF are the same or better than those of galactose/Sia containing derivatives. This enzymatic glycosylation strategy utilizing the relaxed substrate specificity of glycosyltransferases,β1,4-GalT and α2,3-SiaT, may also be applicable to other glycopeptide antibiotics and other glycosylated natural small molecules, including polyketide and nonribosomal peptide. Key words : glycosylation, sialydation, nucleotide-sugar, glycosyltransferase, sialyltransferase, one-pot reaction, oligosaccharide, vancomycin, small molecule 당 (sugar)은 자연계에서 가장 넓고 풍부하게 존재하는 생체분자 중에 하나이며, 세포에서 인식 및 신호전달에 관여하는 가장 일반적인 분자이다. 대부분의 당 구성단위는 핵산에 의해서 활성화 될 때 aglycon에 부가 될 수 있다. 핵산당 (nucleotide-sugar)은 단당류들의 활성화된 형태이며, 당전이효소 (glycosyltransferase)에 의한 당전이 반응에서 공여체로써 역할을 한다. 그러나 당전이는 아직까지 능률에서 당전이효소의 약한 반응성, 다양한 활성화된 glycan 구성단위들의 제한적인 활용성등 몇 가지 문제점을 가지고 있다. 우리는 몇 가지 문제점을 극복하기 위하여 단일 용기내 반응 (one-pot reaction) 시스템으로 저렴한 출발 물질로부터 다양한 핵산당 생산을 위한 연구를 하였고 올리고당 및 반코마이신와 플라보노이드 같은 분자에 핵산당을 이용한 당전이 및 시알산화를 활용하였다. CMP-NeuAc의 생합성에 중요한 중간체 ManNAc (N-acetyl-D-mannosamine)의 생산에 관련된 GlcNAc-2-epimerase (NANE)을 Bacterodes fragilis로 부터 얻었다. 일반적인 GlcNAC-2-epimerase는 ATP와 Mg2+ 이 요구되지만 연구결과를 보면 NANE는 ATP와 Mg2+ 에 영향을 받지 않는다. 게다가 NANE을 포함한 5개의 재조합 효소를 이용하여 GlcNAc와 CMP 출발 물질로부터 CMP-NeuAc를 대량으로 합성할 수 있으며, CMP 량을 기준으로 90% 이상의 수율을 보였다. TMP와 2-deoxy-glucose의 효소적 합성으로 Phosphomannomutase를 이용한 one-pot 반응에서 TDP-2-deoxy-glucose을 성공적으로 대량 생산 할 수 있다. 앞의 실험 결과들을 바탕으로 TDP-2-deoxy-glucose의 one-pot 효소적 합성을 수행하였다. GeiS는 deoxyaminosugar (D-desoamine)의 생합성에 중요한 중간체인 TDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose의 생산에 관여하는 TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose aminotranferase 효소이다. L-glutamic aicd가 L-glutamin 보다 TDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose로 전환을 위한 C4의 더 나은 아민 소스이다. 더욱이 TDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-glucose는 5개의 재조합 효소들을 이용하여 glucose-1-phosphate와 TMP로부터 합성이 가능하다. UMP와 glucosamine의 효소적 합성으로 phosphomannomutase, N-acetyl-glucosamine kinase, glucose-1-phosphate uridyltransferase를 이용한 one-pot 반응에서 UDP-glucosamine을 성공적으로 대량 생산 할 수 있다. 전체 반응에 대한 최적의 금속 이온 농도는 20mM Mg2+ 이며, 최적의 pH는 8.0이다. 그러므로 이 연구는 다양한 핵산당들과 in vitro 의 대상경로에서 생성을 기반으로한 핵산당들의 합성에 도움을 줄 수 있다. CMP-NeuAc의 대량 생산은 시알릴올리고당 (sialyloligosaccharide)들의 효소적 합성에 대한 큰 바램이였다. 그리고 다양한 핵산당들의 생산은 in vivo, in vitro의 조합 생합성 (combinatorial biosynthesis) 에서 당 부분을 가지는 새로운 항생제 연구에 도움을 준다. 당단백질, 당지질에 시알릴올리고당들과 푸코스 (fucose)당이 포함된 glycan 들은 생물학적 과정에서 여러가지로 매우 중요한 역할을 한다. 시알릴락토스 (sialyllactose)는 in vitro 에서 저렴한 기질인 GlcNAc, pyruvate, CMP로부터 one-pot 반응으로 생산한다. 7.5mM/hr~8.5mM/hr의 CMP-NeuAc 생성 속도하에서 시알릴락토스의 전환율은 CMP 기준으로 650%이고 GlcNAC로부터 81%이다. 98% 이상의 순도를 가지는 시알릴락토스의 정제 수율은 75%이다. In situ의 CMP 재사용 시스템에 의한 시알리락토스 생산은 세포 추출액 효소를 이용하여 성공적으로 수행되었다. 우리는 H. pylori의 아미노산 서열을 이용하여 Bacteroides fragilis 9343로부터 1,3-fucosyltransferase (FucT3)를 선별하였으며, 이를 이용하여 LacNAc로부터 Lewis X을 성공적으로 얻을 수 있었다. 앞으로 우리는 sialyl Lewis X (SLex)와 같은 다양한 기능성 올리고당들을 생산 할 수 있다. 새로운 반코마이신 (vancomycin) 유도체들을 합성하기 위하여 β1,4-GalT와 α2,3-SiaT 2개의 당전이효소을 이용한 효소적인 접근방법을 사용하였고, 반코마이신과 반코마이신 유사체 (pseudo-vancomycin)의 글루코스 (glucose) 부분에 갈락토스 (galactose)와 시알산의 결합을 증명하였다. 게다가 MIC 시험 결과 갈락토스를 포함한 유도체들의 MRSA와 VSEF에 대한 항생제 활성은 갈락토스/시알산을 포한한 유도체보다 같거나 나았다. 느슨한 기질 특이성을 가지는 전이효소를 활용한 효소적인 당전이 전략은 다른 glycopeptide 항생제들이나 polyketide와 nonribosomal peptide 같은 당이결합된 자연계의 작은 분자들에 적용 될 수 있다. 주요어 : 당화, 시알산화, 핵산당, 당전이효소, 시알산전이효소, 단일용기내 반응, 올리고당, 반코마이신, 저분자 화합물

전처리 된 옥수수 대 가수분해물로부터의 xylitol 생산

김두섭 아주대학교 2015 국내석사

섬유성 농산 폐자원인 corn stover은 주로 cellulose와 hemicellulose로 구성되어있다. 이는 biomass 중 하나로서 생화학적인 방법으로 고부가 가치의 기능성 물질인 xylitol을 생산하기 위하여 원료로서 사용될 수 있다. Corn stover로부터 NaOH 전처리 및 효소당화 후, 이를 베이스로 하여 Candida tropicalis XK12K로 발효하여 xylitol을 생산하였다. 본 연구에서는, NaOH 전처리 최적화, 효소가수분해 최적화, xylitol 생산최적화, 그리고 xylitol crystallization에 대해서 연구하였다. 전처리의 최적 조건은 1% NaOH solution으로 부터, 반응온도 60 °C, 180rpm에서 반응시간 1시간 일 때 최대 total sugar recovery에 도달하였다. 또한 효소당화는 반응시간 48h, 반응온도 50°C, 180 rpm에서 수행하였으며, 효소는 Celluclast BG(1.67 FPU/g substrate)와 Novozyme 188(5 CBU/g substrate)을 사용하였다. 효소당화에서는 기질의 농도가 10%(w/v) 일 때 가장 높은 당 함유량을 보였으며 glucose의 당화율은 90%, xylose는 80%의 당화율을 보였다. Corn stover hydrolyzate의 당 농도는 glucose 21.0g/L, xylose 8.6g/L, arabinose 1.3g/L 이었다. Xylitol 배양조건은 corn sotover hydrolyzate에 추가로 유기질소원과 무기질소원인 yeast extraxt 10g/L, KH2PO4 5g/L, MgSO4∙7H2O 0.2g/L를 넣어준 뒤에 Candida tropicalis XK12K를 접종하여 180rpm, 30°C, 48시간 배양한 결과 모든 당을 소모한 뒤 최종 산물로서 xylitol을 생산되었고, 농도는 7.9g/L였으며, xylitol의 수율은 0.92g/g-xylose였다. 그 후 배양액은 활성탄을 이용하여 색소를 제거하였고, 증발을 통해 xylitol을 농축 후 크리스탈 생성 실험을 수행하였다. 그러나 citrate buffer로 인하여 xylitol 결정핵이 생성되지 않아 크리스탈이 되지 않았다.

Bioconversion and characterization of aesculetin and resveratrol glucosides using glycosyltransferase

박현수 부산대학교 2013 국내석사

식물체에서 생산되는 폴리페놀인 에스큘레틴과 레즈베라트롤은 식물체가 합성하는 이차 대사산물이다. 폴리페놀은 식물체에서 식물 조직을 보호하고 지지하는 역할을 하며 화분 매개자인 곤충, 동물을 유인할 뿐만 아니라 다른 식물의 생장과 발달을 저해하기도 한다. 더구나 폴리페놀은 식물과 주위 환경과의 상호 작용에서 신호전달 물질이며 식물이 죽은 뒤에도 몇 주 또는 몇 달간 분해되지 않고 유지되면서 토양에 존재하는 분해자와 분해 과정에 영향을 끼쳐 생태계에서도 중요한 역할을 가진다. 최근 들어 이러한 폴리페놀의 건강식품과 약품으로서 연구가치가 증대되고 있으며, 이미 체내에 유익한 항염증, 항산화와 항암 등의 잠재성이 확인되고 있다. 그러나 폴리페놀의 체내에 적용은 낮은 수용성 때문에 양보다 오히려 배설되는 양이 많고 세포독성을 가질 수 있다는 문제점이 한계로 지적된다. 이런 문제점은 폴리페놀의 당화과정 (glycosylation) 을 통하여 합성된 배당체를 이용하여 극복할 수 있다. 배당체의 합성은 화학적 방법으로 가능하지만, 이런 방법은 고온, 고압을 포함하는 조건이 필수적이고 합성된 아노머 (anomer) 물질의 분리 및 환경문제 등을 일으켜 최근에는 생물체가 지니는 당 전이 능력을 갖추는 효소를 이용한 당 전이 반응 (transglycosylation) 을 통하여 빠르고 쉽게 생산하고 있다. 더욱이 효소적 방법은 위치특이적, 입체특이적인 배당체 생산을 만들고 동시에 합성 반응이 일원화된다는 장점이 있다. 당 전이 효소로는 기존에 당 분해 활성이 있는 glycosidase를 이용하는 방법과 glycosyltransferase를 이용하는 방법이 있는데, glycosidase를 이용한 당 전이 반응은 공여체로 넓은 기질 특이성과 다양한 결합 구조를 갖는 전이산물을 합성할 수 있는 장점이 있지만 합성된 배당체가 효소에 의하여 다시 가수분해될 수 있어 전이산물의 수율이 낮다는 문제점이 있다. Glycosyltransferase의 경우 전이 산물의 수율이 높지만 대부분 알려진 전이효소는 공여체로 산업화하기에는 비싼 기질인 뉴클레오티드가 결합된 복합기질을 이용한다는 점이 단점이다. 당 전이 효소 중에서도 뉴클레오티드가 결합된 복합기질이 아닌 sucrose나 malto-oligosaccharide를 기질로 이용하는 효소인 amylosucrase (ASase) 나 maltosyltransferase (MTase) 를 통해 알파 1,4 글루코사이드 결합을 통하여 다당류인 아밀로오스를 생산한다. ASase는 수용체로서 글루칸 뿐만 아니라 카테킨, 살리신, 그리고 알부틴을 수용체로 활용하여 포도당을 전이하는 능력이 있음이 확인되었다. 또한, MTase는 daidzein과 같은 폴리페놀을 전이하여 높은 수용성을 가지는 maltosyl daidzein을 합성함을 확인하였다. 본 연구에서는 고온성 미생물인 Caldicellurosiruptor bescii 균주로부터 유래한 MTase와 심해 미생물인 Alteromonas macleodii Deep ecotype에서 유래한 ASase 효소의 기본 특성을 확인하고 이를 산업적으로 응용하기 위하여 난용성 천연물인 에스큘레틴과 레즈베라트롤을 이용하여 배당체를 합성하였다. 당 전이 효소에 의해 합성된 에스큘레틴과 레즈베라트롤의 배당체는 본래의 비당체보다 수용성이 당쇄 결합을 통해 크게 향상되는 것을 확인하였다. 특히 MTase에 의해 합성된 maltosyl piceid는 본래의 레즈베라트롤보다 수용성이 8.54 103 배 향상되어 식품첨가제 및 건강식품제재로서 이용가치가 기대된다. ASase에 의해 합성된 α-cichoriin과 α-piceid isomers의 항증식 효과 및 미백 효과가 각각 확인되었으며 glycosynthase인 β-glucosidase N291T에 의해 합성된 glucosyl aesculin의 경우 aesculin보다 항염증 효과가 향상하였음을 대식세포인 RAW264.7 cells를 통해 in vitro상에서 확인하여 항염증제제로서 이용될 수 있을 것이다. 이런 연구 결과를 토대로 당 전이 효소가 식품, 화장품, 및 제약산업에서 높은 잠재성을 갖는 폴리페놀 배당체의 효소적 합성에 매우 효율적인 촉매로 활용될 수 있다는 것을 보여준다.

Cellulolytic and xylanolytic enzymes-producing fungi in rice straw and its enhanced enzymatic hydrolysis

이상준 Graduate School, Korea University 2011 국내석사

전처리 한 볏짚 당화에 사용된 균주는 전국11 개 지역의 볏짚에서 분리 및 동정하여 확보였다. 총511개의 분리 균을 형태 및DNA 염기서열의 분석을 실시한 결과 16 속 25 종의 곰팡이가 분리 되었다. 이들25종이 갖는 섬유소 분해능력을 조사하고 우수한 균주의 선별을 위하여 두 가지 단계를 통해서 실험을 실시하였다. 1차 선별을 위해서는 25종의 곰팡이를 볏짚과 물만 함유된solid-state조건에서 배양을 한 후 세가지 섬유소 분해 효소(Total cellulase, Endoglucanase, Xylanase)의 활성을 측정하였다. 측정결과 최종적으로Aspergillus niger KUC5183, A. ochraceus KUC5204, A. versicolor KUC5201, Trichoderma harzianum KUC5182, unknown basidiomycete KUC8721 그리고 Mucor circinelloides KUC6014이 선발되었다. 선발된 6종은 선별과정에 적합한 배지의 영양 조건을 찾기 위해 무기염류가 함유된 액체배양 조건에서 단일 탄소원의 종류(볏짚, 포도당, 셀룰로오스, 자일란)를 달리하여 배양하였다. 그리고 단백질과 6가지 효소(Total cellulase, Endoglucanase, Cellobiohydrolase, beta-glucosidase, Xylanase그리고 beta-xylosidase)의 활성을 측정하였다. 탄소원의 종류에 따라 균마다 더 적합한 탄소원이 존재 했다. xylan의 경우에는 모든 균이 xylanase와 beta-xylosidase 모두 가장 적합한 탄소원임을 확인했으며Trichoderma harzianum KUC5182와 Unknwon basidiomycete KUC8721 은 볏짚을 이용한 배지가 가장 적합했다. 6종의 균 중에서는Trichoderma harzianum KUC5182가 가장 우수한 효소 활성을 보여주었다. 선발된 균들은 실제 암모니아 침지법으로 전처리한 볏짚의 당화능력 평가를 위해 실험에 다시 이용하였다. 활성이 낮은 접합균(Mucor circinelloides KUC6014)과 동시 배양에 적합하지 않은 담자균(Unknwon basidiomycete KUC8721)을 실험 대상에서 제외하고 Penicillium oxalicum KUC5184을 추가하여 실험을 실시하였다. 먼저 효소생산에 적합한 조건을 찾기 위하여 고체배지와 액체배지의 비교실험이 진행되었다. 실험결과 5종의 균 모두 액체 배지에서 더 좋은 활성 결과를 보여주고 있었다. 그 다음으로 동시배양 효과 실험을 실시하였다. Trichoderma harzianum KUC5182 와Aspergills versicolor KUC5201을 같이 접종하여 배양한 균이 단일 접종하여 키운 경우보다 더 높은 활성을 보여주었다. 따라서 동시 배양하여 생산한 효소와 상업효소와의 효소칵테일을 이용한 당화실험을 하였다. 동시배양한 효소와 상업용 효소의 비율을 (100: 0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100)으로 하여 전처리한 볏짚의 당화율을 비교 하였다. 50:50으로 혼합한 효소 칵테일이 일반적으로 사용하는 상업용 효소간의 칵테일 보다 더 높은 당화 효과를 나타내었다. 따라서 동시배양한 균주를 안정적으로 대량배양을 하여 사용할 경우 산업에서 상업용 효소비용의 절감효과와 함께 더 높은 효율의 당화가 가능하다는 정보를 제공하였다. Filamentous fungi colonizing rice straw were collected from 11 different sites in Korea and were identified based on characterization of their morphology and molecular properties. The fungi were divided into 25 species belonging to 16 genera, including 14 ascomycetes, one zygomycete, and one basidiomycete. Fungal celluloytic and xylanolytic enzymes were assessed through a two-step process where in highly active cellulase and/or hemicellulase producing fungi were selected in a first screening step followed by a second step to isolate the best enzyme-producer through optimization of media conditions. Twenty-five fungal species were first screened for the production of total cellulase (TC), endo-β-1,4 glucanase (EG), and endo-β-1,4 xylanase (XYL) using solid-state fermentation. From this screening, six species, namely, Aspergillus niger KUC5183, A. ochraceus KUC5204, A. versicolor KUC5201, Mucor circinelloides KUC6014, Trichoderma harzianum KUC5182, and an unknown basidiomycete species KUC8721, were selected for the media optimization step. These six species were then incubated in liquid Mandel’s media containing cellulose, glucose, rice straw or xylan as the sole carbon source and the activities of six different enzymes were measured. Enzyme production was highly influenced by media conditions and in some cases significantly increased. Through this screening process, Trichoderma harzianum KUC5182 was selected as the best enzyme-producer. Rice straw and xylan were the best carbon sources for the production of cellulase and hemicellulase enzymes, respectively. The potential of co-culturing and the efficiency of enzymatic hydrolysis by an enzyme cocktail were investigated. Aspergillus niger KUC5183, Aspergillus ochraceus KUC5204, Aspergillus versicolor KUC5201, Penicillium oxalicum KUC5184 and Trichoderma harzianum KUC5182 isolated from rice straw (RS) were used as enzyme producers. RS was pretreated by soaking in aqueous ammonia (SAA). In submerged fermentation (SmF), the β-glucosidase and endo-β-1,4-xylanase activities of all fungal strains were 2.5-7.7- and 1.3-7.0-fold higher, respectively, than those observed in solid-state fermentation (SSF). Enzymes were produced by co-culture, and the strongest synergistic effect was observed with the combination of T. harzianum KUC5182 (A) and A. versicolor KUC5201 (D). The combined enzyme cocktail was used to hydrolyze pretreated RS in conjunction with commercial enzymes (Celluclast 1.5 L, Novozyme 188). A 50:50 ratio of co-cultured enzyme (AD) and Celluclast 1.5 L exhibited the highest hydrolysis rate (67.2%).

CMP-NeuAc 생성을 위한 다효소 고정화 방법의 개발 전략과 2-fucosyllactose의 생합성

박일향 서울대학교 대학원 2012 국내석사

본 연구는 바이러스 감염억제 및 면역강화로 알려진 sialyllactose와 fucosyllactose의 생합성 메커니즘을 통해 좀 더 효율적으로 합성하고자 수행하였다. Sialyllactose의 경우, 현재 존재하는 생합성 메커니즘을 토대로 효소 고정화 방법을 도입하여 대량생산에 대한 가능성을 도모하였으며, 2-fucosyllactose의 경우, salvage pathway(회수경로)를 통한 생합성 방법을 선택하여 기존에 존재하는 de novo pathway(신생합성경로)와는 또 다른 방법으로 생합성 될 수 있는 가능성을 보여주었다. Sialyllactose의 생합성에 필요한 공여체 기질인 CMP-neuraminic acid(CMP-NeuAc)을 합성하기 위해서는 N-acetylglucosamine, CMP, ATP, pyruvic acid, acetyl phosphate의 5종류의 기질과 cytidylate kinase, acetate kinase, NeuAc aldolase, CMP-NeuAc synthease, glcNAc 2-epimerase의 5종류의 효소가 필요하다. 효소의 반복 사용을 통해 비용을 절감하고 효소의 효율적 사용을 도모하고자 고정화 방법을 적용해 보았다. 효소 고정화에 사용한 재료는 알긴산(alginate)비드, 실리카 코팅된 알긴산 비드, 키토산(chitosan)비드, 표면개질을 위한 아세틸화 키토산 비드를 다효소 고정화에 적용해보았다. 알긴산 비드의 경우, CMP-NeuAc을 합성하는데 필요한 기질 중 acetyl phosphate, CMP와 같은 음전하를 띄는 물질로 인해 반응하는 과정 동안 이온 결합으로 형성되어 있는 알긴산 비드의 물성이 유지되지 못하는 현상을 관찰할 수 있었다. 키토산 비드에 다효소를 고정화한 경우, CMP와 같은 기질이 흡착되는 문제점을 보였으나 키토산 비드의 표면에 존재하는 아민기를 차단하는 표면 개질을 통해 아세틸화 키토산 비드를 사용 할 경우 기질의 흡착을 줄일 수 있었고 동시에 기존의 키토산 비드에 비해 더 높은 재사용률을 얻을 수 있었다. 2-Fucosyllactose를 salvage pathway를 통해 생합성 하고자 L-fucokinase / GDP-L-fucose pyrophosphorylase (FKP)와 2-fucosyltransferase (2-FT)를 이용하였다. 2-FT의 경우, 활성이 알려진 균주는 많이 존재하지만 FKP와 사용된 연구와의 선례가 없었으므로 2-FT의 활성을 가진 균주를 확보하는 것이 우선적인 목표였다. 2-FT의 활성을 갖고 있는 균주를 CAZY사이트를 통해 조사한 결과, Helicobacter pylori 26695, Helicobacter pylori J99, Bacteroid fragilis 3688의 균주를 확보하였다. 세 가지 균주로 부터 얻은 2-FT의 활성이 가장 높았던 H. pylori 26695를 통해 2-FT의 염기서열의 최적화 및 발현조건의 최적화 및 샤페론과의 발현조건을 최적화한 결과 GroEL/ES 샤페론을 이용한 발현조건하에 IPTG 농도가 0.01 mM, 발현온도는 18℃일 때 세포 추출액으로의 단백질 발현율이 가장 높았음을 알 수 있었고, 반응조건에서의 2-FT의 수율 역시 증가함을 알 수 있었다. 또한 L-fucose로부터 연속 반응(One pot reaction)을 수행한 결과 12시간까지 50% 반응이 진행됨을 확인할 수 있었으며, 12시간 이후 반응이 더 이상 진행되지 않음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 L-fucose로부터 2-fucosyllactose를 연속 반응을 통해 생산할 수 있음을 확인하였다.

粉碎摩擦媒體含有 酵素反應系에서의 生澱粉 酵素分解 Mechanism과 生澱粉의 高濃度 酵素糖化

박동찬 慶北大學校 1991 국내석사

초본계 바이오매스의 유기용매 전처리 효율향상을 위한 물리-화학 융합 공정

박장한 경기대학교 대학원 2017 국내석사

세계적으로 지구온난화에 대한 관심이 급증하면서 온실가스 배출을 줄일 수 있는 새로운 에너지원의 개발이 중요해지고 있다. 그 중 바이오매스는 ‘탄소중립(carbon neutral)’에너지원으로 각광받고 있으며 이를 활용하기 위해 다양한 연구가 진행중에 있다. 바이오매스는 신재생에너지원 중 수송용 연료를 대체할 수 있는 몇 안 되는 에너지원으로 바이오에탄올, 바이오디젤등 으로 전환할 수 있는 특징이 있다. 하지만 바이오에너지가 가격 경쟁력을 확보하기 위해서는 전체 공정비용의 40%이상 차지하는 전처리 과정의 개선이 요구된다. 따라서 본 연구는 전처리 공정 중 촉매를 사용하지 않으면서 전처리 효율을 유지시키고, 용매의 재사용을 고려한 유기용매 전처리를 수행하였다. 용매의 재사용에 용이한 에탄올을 유기용매로 사용하였으며, 촉매를 사용하지 않고 전처리 효율을 높이기 위해서 물리적 전처리와 화학적 전처리의 융합을 시도하였다. planetary mill의 경우 물리적 전처리만 적용한 결과, 전처리하지 않은 바이오매스와 비교했을 때 40%이상 당화효율이 증가하였고, 화학적 전처리를 연계 할 경우 90%이상의 당화효율을 보였다. planetary mill을 이용하여 물리-화학적 전처리의 연계 가능성을 확인하고, 좀 더 공정에 적용하기 쉬운 attrition mill을 적용해 보았다. attrition mill의 경우 당화효율은 화학적 전처리만 적용한 결과와 비슷한 수준이었지만, 화학적 전처리의 반응시간을 약 1시간 단축시킬 수 있었고 반응온도 역시 190℃에서 170℃로 단축시킬 수 있었다. 용매 재사용의 효과를 알아보았을 때 40%이상 용매를 절감할 수 있는 것으로 나타났으며, 전처리 고액비는 1:3까지 낮출 수 있는 것으로 확인되었다.

Characterization of glycosyltransferases from Actinomycetes and application towards biosynthesis of carbohydrate-containing antibiotics

Hong, Jay Sung-Joong 서울大學校 大學院 2007 국내박사

분취마찰 효소반응계에서의 생전분의 효소당화 Kineticg에 관한 연구

박진서 경북대학교 1989 국내석사

인돌린진계 당분해효소 저해제 개발 : 6-Epicastanospermine과 1,6-Diepicastanospermine의 합성

최성준 경상대학교 2003 국내석사