돼지증식성회장염 신속 진단 기법 개발 및 국내 분리 Lawsonia intracellularis 균주의 특성 분석

정희식 경상대학교 대학원 2008 국내박사

Porcine proliferative enteropathy (PPE), caused by the obligate intracellular bacterium Lawsonia intracellularis is a widely distributed disease throughout the world causing substantial economic loss. Most frequently, the disease appears subclinically in pigs at 6?20 weeks of age with occasional non-bloody diarrhea, decrease in the rate of weight gain, and weight loss. The pathogenic agent, L. intracellularis is gram negative, obligate intracellular bacteria and non-culturable in artificial medium, but culturable in several murine intestine derived cell line, such as IEC-18, McCoy, INT407 and so on. In this study, the prevalence of Lawsonia intracellularis, were investigated by molecular techniques PCR using fecal samples of pigs with diarrhea or a history of diarrhea in Gyeongnam province in Korea. Forty seven farms were investigated and overall herd prevalence of L. intracellularis, was 53.2% and the prevalence of L. intracellularis among all sampled pigs was 35.2%. To isolate wild type of L. intracellularis from pig, PCR-positive intestine lysate was infected in McCoy cell, and cultured until the 7th passages. From this result, the first pure isolation of L. intracellularis was established in Korea. The wild type of L. intracellularis was checked by molecular technique and immunostained method using rabbit anti-L. intracellularis and rabbit anti-LsaA polyclonal antibody. The characterization of wild type of L. intracellularis isolated from pig was performed. The DNA sequence and amino acid sequence homology comparison of LsaA, which is a high pathogenic protein, was tested, and resulted 98% homology and 97% homology to reference strain, respectively. The LsaA protein of isolated L. intracellularis was detected by immunoblotting assay. From this result, LsaA protein of isolated L. intracellularis was specifically reacted with rabbit anti-LsaA polyclonal antibody around 27.4 kDa region, suggesting that LsaA of L. intracellularis isolated from Korea would be an important role for pathogenic mechanism in PPE. To develope the serological diagnosis for PPE, the LsaA synthetic peptide was used for specific antigen. To synthesize LsaA peptide, non-cross reaction and specific predominant immunological epitope region of LsaA amino acid sequence was selected, and artificially synthesized. The synthetic LsaA peptide was infected in rabbit, anti-LsaA polyclonal antibody was produced. The synthetic peptide and anti-LsaA polyclonal antibody were used for PPE serological diagnosis as a specific antigen and antibody, respectively. To develop histoimmunostaining method, the intestine of naturally L. intracellularis infected pig were collected, fixed, stained with anti-LsaA polyclonal antibody and L. intracellularis was strongly reacted with anti-LsaA polyclonal antibody. This result was for the first time to detect L. intracellularis in the histoimmunostaining method using synthetic LsaA peptide. To develope a rapid serological diagnosis for PPE, direct fluorescence antibody test was performed using filtrated feces and intestine lysate. In this experiment, direct fluorescence antibody test showed a high sensitivity and rapid method for PPE diagnosis, suggesting that direct fluorescence antibody test would be a portable and economic diagnostic method for PPE. To develop a sensitive and available serological diagnosis method for PPE, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were performed. In this experiment, LsaA synthetic peptide was used as a specific antigen for L. intracellularis. Naturally L. intracellularis infected or not infected pig were selected by PCR, and blood samples were collected. LsaA synthetic peptide was used as a specific antigen for pig anti-L. intracellularis antibody. From this result, 25 sera of L. intracellularis infected pig showed high reactions with LsaA synthetic peptide. However, 25 sera of L. intracellularis free pig were not reacted with LsaA synthetic peptide. The optical density (OD) ranges were 0.24 to 0.62 in L. intracellularis infected pig and 0.01 to 0.09 in L. intracellularis free pig, respectively. From this result, it was confirmed that the critical OD range of cut off value for this ELISA was 0.1 at 492 nm. In conclusion, the prevalence of PPE in Gyeongnam province was more than 50% and it means the economic loss from PPE in pig farms would be more serious than other diseases of pig in Korea. Until now, specific eradication programs for PPE has not been established, so the economic loss would be increased in the future. In this study, wild type of L. intracellularis was isolated from pig and pure culture system was established. The bacterial characterizations, virulence factors, pathogenic mechanism, epidemiological agents and photogenic analysis are studied in the future. Moreover, this strain is able to be used for serological diagnostic method for PPE such as specific antigen, mono/poly-clonal antibody production, and be used for stable vaccine program establishment in Korea. Construction of serological diagnosis for PPE using synthetic peptide showed high sensitive diagnosis, suggested that LsaA synthetic peptide would be a useful material for PPE diagnosis such as enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence antibody test, histoimmunochemistry test and so on. 돼지증식성회장염 (Porcine proliferative enteropathy, PPE)은 세포내 기생 세균인 Lawsonia intracellularis에 의해 발병하는 돼지 소모성 질병으로서 전 세계적으로 발병하고 있으며 막대한 경제적 손실을 유발하는 양돈 산업에 있어 중요한 질병이다. 본 질병은 대부분 6-20주령의 돼지에서 발생하는 특징을 갖고 있으며 설사, 출혈성설사, 괴사성설사, 체중감소, 사료섭취 감소 등의 증상을 보이며 심각한 경우에는 폐사하기도 한다. 본 질병의 원인체인 L. intracellularis 균은 Gram 음성균으로서 간균의 형태를 보이고 있으며 편성 세포내 기생세균으로 알려져 있다. L. intracellularis 균의 특징 중 하나는 인공배지에서 배양이 되지 않기 때문에 배양이 상당히 까다롭고 배양을 위해서는 반드시 IEC-18, McCoy, INT407과 같은 세포에 감염을 통해서만 배양이 가능한 세균으로 알려져 있다. 본 연구에서는 국내 양돈장 돼지증식성회장염의 감염율을 조사하고자, L. intracellularis 균의 유전자에 기초한 PCR 방법을 사용하여 경남지역 양돈장내 PPE 감염율을 조사하였다. 돼지증식성회장염 감염율 조사를 위해 경남 도내 양돈장 47곳을 방문하여 각 농장의 분변에 대한 PCR 검사를 수행해본 결과 농장의 감염율은 전체 47곳 중 25 곳의 농장이 양성 반응을 나타내어 53.2%의 높은 감염율을 나타내었다. 또한 각 농장의 개체별 감염율을 조사하기 위해 31곳의 농장에서 총 155개의 분변 가검물에 대한 PCR 검사에서 54개의 양성 반응이 나타나 개체 감염율은 35.2%의 비교적 높은 감염율을 확인 할 수 있었다. 감염율 조사에 이은 돼지증식성회장염의 원인체인 L. intracellularis 균의 배양법 확립 및 야외주의 분리를 이하여 PCR 검사에서 돼지증식성회장염 양성을 보인 농장을 방문하여, 재차 개체별 분변을 채취하여 PCR을 수행하고, 양성반응을 나타낸 돼지를 선별하여 부검을 수행하고, PPE 감염 시 L. intracellularis 균이 다량 존재하는 것으로 알려진 회장 부위를 채취하여 야외주의 순수 배양법을 확립하였다. 기존의 발표된 자료에 의하면 L. intracellularis 균의 순수 배양을 위해서 야외주를 세포 내 감염을 수행한 후, 밀폐용기를 이용한 진공상태의 유지, 수소 가스로의 교환 등 복잡한 절차가 요구되었으나 본 연구에서는 기존에 발표된 이러한 과정을 생략한 채, 원심분리기를 이용한 균의 감염을 수행하여 순수 배양이 성공적으로 수행됨을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과로서 5대 배양까지는 항생제가 첨가된 배지에서 배양이 가능하였고, 그 이후의 배양에서는 항생제가 첨가되지 않은 배지에서 균의 증식이 인정되어, 순수한 L. intracellularis 균의 배양법이 확립되었음을 확인 하였다. 순수 분리된 L. intracellularis 균의 특성을 분석하기 위하여 L. intracellularis 균의 병원성 인자로 알려진 LsaA 단백에 대한 유전자 염기서열 및 amino acid 서열을 이미 발표된 균주와 비교 분석을 실시하였다. 이를 위해 L. intracellularis 야외 균주의 LsaA 유전자의 유무를 확인하기 위하여 LsaA 유전자에 대한 primer를 제작하여 PCR을 수행하여 본 결과, 야외주에도 LsaA 유전자가 존재함이 확인 되었고 PCR을 통해 증폭된 LsaA 유전자는 다시 염기배열을 확인하기 위하여 pMAL vector에 cloning을 수행하여 염기 서열을 확인해 본 결과 이미 발표된 균주와 비교하여 98% 이상의 상동성이 인정되었다. 또한 밝혀진 LsaA 유전자의 염기서열을 기초로 amino acid 서열을 확인해본 결과 기존 밝혀진 amino acid 서열과 비교하여 97% 이상의 상동성을 나타내었다. 또한 LsaA 단백의 분자량 조사를 위하여 야외주를 이용 immunoblotting을 수행하였다. 본 실험을 수행하기 위하여 사용된 항체는 LsaA amino acid 서열을 기초로 합성 LsaA peptide를 토끼면역을 수행하고 면역된 토끼의 혈청을 이용하여 야외주의 LsaA 단백과의 면역 반응을 유도하였다. 그 결과 기존에 밝혀진 27.4 kDa의 LsaA 단백이 Western blot 방법으로 확인 되었다. 본 결과를 토대로 국내 분리 L. intracellularis 균이 LsaA 단백을 발현 하는 것이 확인되었고, 이는 LsaA 단백이 중요 병원성 인자로 밝혀진 바, 국내 양돈장의 돼지증식성회장염을 유발하는데 LsaA 단백이 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 현재까지 돼지증식성회장염의 진단을 위해 일반적으로 사용하고 있는 방법은 균의 DNA에 기초한 PCR 방법이 가장 널리 사용되고 있는 실정이다. 최근 혈청학적 진단방법의 개발에 많은 연구가 진행되고 있으나 아직까지 상용화 되어있는 진단방법은 개발되지 않은 실정이다. 돼지증식성회장염에 대한 혈청학적 진단으로 소개되고 있는 방법으로는 Immunohistochemistry, Indirect ELISA, ELISA, Immunofluorescent antibody 등이 소개되고 있으며 상당히 민감도가 높은 것으로 보고되고 있다. 그러나 이러한 다양한 혈청학적 진단방법에 사용하고 있는 항원이나 항체는 L. intracellularis 균의 분리가 선행되고 야외주를 확보한 상태에서만 진단법이 가능하게 되기 때문에 전 세계적으로도 소수의 연구진에 의해서 보고가 이루어지고 있는 실정이다. 이러한 문제점을 개선하고자, 본 연구에서는 LsaA 합성 펩타이드를 이용 돼지증식성회장염 진단을 위한 항원 및 항체 생산에 이용하였다. PCR을 통해 PPE 감염돼지를 선별하고 감염돈으로부터 혈액 및 분변을 채취하여 LsaA 합성 펩타이드를 통해 생산된 항체와 직접형광 항체법을 수행하였다. 그 결과 PCR에서 양성 반응을 나타낸 25두의 돼지 분변에서 분리한 균이 모두 LsaA 합성 펩타이드를 통해 생산된 항체와 높은 면역 반응을 나타내었으며, 부검을 통해 얻어진 5두의 장관으로부터 얻어진 균과 높은 면역 반응이 나타남이 확인 되었다. 그러나 음성 대조군으로 사용된 25두의 PPE 음성 돼지에 대한 면역 반응은 거의 나타나지 않았으며 음성 돈 대조군으로 사용된 5두의 장관으로부터 분리한 균과 면역 반응이 나타나지 않아 돼지증식성회장염의 진단에 상당히 유효하게 사용될 것으로 사료된다. 직접 면역 형광 항체법 이외에 LsaA 합성 펩타이드를 항원으로 이용한 ELISA법을 확립하였다. 합성 펩타이드를 일정 양 항원으로 사용하고 PCR과 분변으로부터 분리한 직접형광항체법에서 양성으로 나타난 25두의 혈청을 이용 ELISA에 이용한 결과 양성돈의 경우 OD값이 0.24에서 0.59까지의 높은 반응이 나온 반면 음성 대조군으로 사용된 25두의 결과는 0.02에서 0.09까지의 낮은 반응이 나타난 것으로 밝혀졌다. 이상의 결과로서 경남도내 양돈장의 돼지증식성회장염은 농장 감염율이 50%이상의 높은 감염율을 나타내는 것으로 나타나 본 질병에 의한 경제적 손실이 상당히 클 것으로 사료되며, 현재까지 돼지증식성회장염에 대한 근절 프로그램이 확립되어 있지 않은바, 이에 대한 정책 마련이 시급할 것으로 판단되어진다. 또한 현재까지 국내 분리 L. intracellularis 균에 대한 정확한 정보가 마련되어 있지 않은 현 시점에서 본 연구를 통해 국내 분리 야외주의 분리 및 배양법이 확립 될 수 있었다. 또한 분리주에 대한 특성 분석을 통하여 LsaA 단백이 돼지증식성회장염의 발병에 상당한 영향을 미칠 것으로 사료되어 이에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한 현재까지 돼지증식성회장염에 대한 혈청학적 진단기법이 마련되지 못하여 진단 상에 큰 어려움을 겪고 있었으나, 균주를 이용하는 대신 합성 펩타이드를 이용하여 혈청학적 진단기법이 마련되어 보다 경제적이고 유용한 진단 방법으로 활용될 것이다. 본 결과를 토대로 얻어진 야외주 및 합성 펩타이드를 활용한 혈청학적 진단기법은 국내 양돈장의 증식성회장염에 대한 예방대책 및 근절 프로그램 확립에 중요한 역할을 담당할 것으로 사료된다.

Effect of epigallocatechin-3-gallate on intimal hyperplasia after vascular grafting

박한기 Graduate School, Yonsei University 2007 국내박사

목적 혈관내막과다증식은 혈관우회술 혹은 중재술 후 재협착의 주요한 원인으로, 혈관손상 후 중간막에 존재하는 혈관평활근세포가 내막으로 이동하며 과다증식하여, 세포외결체조직과 함께 축적되어 형성된다. 녹차추출물의 주요 성분 중 하나인 epigallocatechin-3-gallate (EGCG)는 혈관평활근세포의 이동 및 증식을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 따라서 EGCG가 혈관평활근세포의 활동을 억제함으로써 내막과다증식을 억제하는 효과가 있을 것으로 기대된다. 본 연구는 EGCG가 혈관수술 후 내막증식에 미치는 영향을 알아보기 위한 것이다.방법 인간제대정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)와 쥐의 대동맥평활근세포(rat aortic smooth muscle cell, RASMC)를 in vitro 환경에서 배양하고, 세포배양액에 EGCG(0 - 400 μM)를 첨가하였다. 3일간 세포배양 후 세포활성도을 측정하여 EGCG 농도에 따른 세포증식 억제효과를 비교하였다. 세포이동 측정을 위해서는 내피세포와 평활근세포가 단일층으로 배양된 배지에 세포가 없는 구역을 만들고 현미경관찰하에 세포배양하며 임의로 선택한 세포가 이동하는 것을 추적하여 세포의 이동 속도를 측정하였다. 내막증식에 미치는 효과를 확인하기 위해 개를 이용한 동물실험을 시행하였다. 20마리의 개의 양측 경동맥에 자가경정맥을 이식하였으며, 채취한 경정맥을 대조군(n=10)은 생리식염수에, EGCG군(n=10)에서는 EGCG를 포함하는 생리식염수에 30분 동안 담근 뒤 이식하였으며, EGCG군은 100 mM의 EGCG를 이식혈관주위에 도포하였다. 이식 후 30일 후에 경정맥이식편을 회수하여 내막과 중간막의 두께를 측정하였다.결과 혈관내피세포의 증식은 EGCG의 농도가 100 μM 이상에서, 혈관평활근세포의 증식은 400 μM 이상 농도에서 대조군에 비해 억제되었다 (p < 0.05). 200 μM의 EGCG가 첨가된 세포배지에서 혈관평활근세포의 이동성은 대조군에 비해 억제되었으나 (control 38.8 μm/hour vs EGCG group 24.3 μm/hour, p < 0.05), 내피세포의 이동성은 영향을 받지 않았다 (control 36.9 μm/hour vs EGCG group 34.4 μm/hour). 동물실험 결과 회수한 정맥도관의 내막에 다양한 정도의 내막과다증식이 관찰되었으며, 대조군에서 EGCG군에 비해 내막의 두께가 두꺼웠으나 (95 ± 43 vs 47 ± 37 μm, p < 0.05), 중간막의 두께는 두 군간에 차이가 없었고 (247 ± 95 vs 267 ± 224 μm, p = 0.67), 내막/중간막의 두께비는 EGCG군에서 낮게 관찰되었다 (0.41 ± 0.17 vs 0.21 ± 0.15, p < 0.05).결론 EGCG는 혈관우회술 후 혈관내막과다증식을 억제하는 효과가 있으며, 이는 혈관평활근세포의 증식 및 이동을 억제하여 효과를 나타낸다고 생각된다. 따라서 EGCG는 혈관이식술 및 중재술 후 발생하는 혈관내막과다증식의 억제에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. Background: Intimal hyperplasia is a major cause of stenosis after vascular grafting and intervention, and is characterized by proliferation and migration of medial smooth muscle cells with an associated deposition of extracellular connective tissue matrix in the intimal layer. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), the major constituent of green tea, is known to suppress the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (SMCs). We propose that EGCG may have a protective effect against the development of intimal hyperplasia through the suppression of vascular SMC behavior. The purpose of this study is to evaluate the effect of EGCG on the prevention of intimal hyperplasia after vascular graftingMaterials and Method: Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and rat aortic smooth muscle cells (RASMC) were cultured in vitro and EGCG was added to the culture media (0 - 400 μM). After culturing for 3 days, cell proliferation was measured and the dose-dependent suppressive effects were studied. For the cell migration assay, cell migration speed was measured by tracing randomly selected cells under the microscope after forming a denuded area in a single layer of cells in culture media. To evaluate the effect of EGCG on intimal hyperplasia, we performed in vivo experiments using a canine model. We interposed an autologous jugular vein graft into the bilateral carotid arteries in 20 dogs. The vein graft was stored for 30 minutes in normal saline (control group, n=10) or EGCG solution (EGCG group, n=10) before grafting. For the EGCG group, 100 mM of EGCG was applied in the perivascular space. After 30 days, the vein graft was retrieved and thickness of the intima and media was measured.Results: The proliferation of RASMCs and HUVECs was suppressed by the addition of EGCG to the media (concentration of 400 and 100 μM, respectively, p < 0.05). The migration of RASMCs was suppressed with 200 μM of EGCG (control 38.8 μm/hour vs. EGCG group 24.3 μm/hour, p < 0.05), however the migration of HUVECs was not affected by EGCG treatment (control 36.9 μm/hour vs. EGCG group 34.4 μm/hour). In the in vivo study, the intimal thickness of the retrieved vein graft was thicker in control group than in the EGCG group (95 ± 43 vs. 47 ± 37 μm, respectively, p < 0.05), however there was no difference in medial thickness between the groups (247 ± 95 vs. 267 ± 224 μm, respectively, p = 0.67). The intima/media thickness ratio was lower in the EGCG group than in the control group (0.41 ± 0.17 vs. 0.21 ± 0.15, respectively, p < 0.05).Conclusion: EGCG can suppress intimal hyperplasia after vascular grafting through the inhibition of the vascular SMC migration and proliferation. Treatment of EGCG may offer new intra-operative therapeutic modalities to reduce the development of intimal hyperplasia.

실리콘기름을 주입한 증식유리체망막병증과 증식당뇨망막병증에서의 시력결과

윤태진 부산대학교 대학원 2003 국내석사

유리체망막수술시 망막을 장기간 안정화할 목적으로 안구 내에 실리콘기름주입술을 시행하였던 증식유리체망막병증 45안과 증식당뇨망막병증 35안의 시력 예후 및 합병증에 대해 비교 검토하였다. 해부학적 성공은 증식유리체망막병증은 41안(91.1%), 증식당뇨망막병증은 32안(91.4%), 기능적 성공은 각각 37안(82.2%), 29안(82.9%)으로 비슷하였다. 증식유리체망막병증의 21안 (46.7%), 증식당뇨망막병증에서 15안 (42.9%)에서 시력 개선이 나타났다 (P=0.169). 최종 시력이 0.1 이상인 경우는 증식유리체망막병증에서 24안 (53.3%), 증식당뇨망막병증에서 12안(28.6%)로 증식유리체망막병증에서 의미 있게 높았다 (P=0.043). 합병증으로는 백내장, 망막전막, 지속적 안압상승, 실리콘기름 유화, 국소 망막박리, 띠모양각막병증, 전체 망막박리 순으로 나타났으며 원인 질환에 따른 유의한 차이는 없었다. 실리콘기름은 증식유리체망막증과 증식당뇨망막증의 수술적 치료에 있어 고식적인 방법으로 재유착을 얻기 힘든 경우에 시력 개선 및 유지를 위한 유용한 도구로 생각된다. The retrospective study of 45 eyes of the proliferative vitreoretinopathy (PVR) and 35 eyes of the proliferative diabetic retinopathy (PDR) which were underwent the pars plana vitrectomy with silicone oil tamponades was done to evaluate the visual outcomes and complications. Anatomic success was maintained in 41 eyes (91.3%) of the PVR and 32 eyes (91.4%) of the PDR, functional success was found in 37 eyes (82.2%) and 29 eyes respectively. Vision improvement was showed in 21 eyes (46.7%) and 15 eyes (42.9%) each group. The cases with final visual acuity 0.1 or better were twenty two eyes (53.3%) and twelve eyes (28.6%) respectively. Proliferative vitreoretinopathy was statistically significant improvement in the cases that visual acuity were better than 0.1 (P=0.04). Complications include cataract, epiretinal membrane, constant increased intraocular pressure, silicone oil emulsification, focal retinal detachment, band keratopathy, and total retinal detachment. There was no statistically significant difference in the complications between two groups. Silicone oil tamponade was useful in case of complicated retinal detachment to improve and maintain vision.

치성낭종 상피세포의 증식, 분화 및 세포능동사망현상에 관한 면역조직화학적 연구

정성훈 강릉대학교 대학원 1999 국내석사

치성낭종 상피세포에 있어서의 증식성, 분화 활성 그리고 세포능동사망현상(apoptosis)을 알아보고자, 강릉대학교 치과대학 구강악안면외과에 내원한 환자들에게서 적출된 치성낭종 19례에 대하여 상피세포 증식기전에 연관되어 있다고 알려져 있는 세포증식 관련인자인 증식세포핵항원(proliferating cell nuclear antigen, PCNA), Ki-67, Rb 단백질, c-erbB-2 단백, MPM-2와 세포분화인자인 transglutaminase C, 열충격단백질 70(heat shock protein 70), 그리고 세포능동사망현상에 대한 면역조직화학적 연구를 시행하였다. 본 연구에서는 치성낭종 상피의 각화상태, 증식상태 및 염증상태를 조직학적으로 판별한 후 이에 따른 각종 세포 증식인자, 세포 분화인자 및 세포능동사망현상을 관찰할 수 있는 인자의 발현을 정상 구강 점막세포에서의 발현과 비교, 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 치성낭종 상피의 증식성은 PCNA, Ki-67, MPM-2, c-erbB-2, Rb 단백질의 항체를 이용하여 관찰한 결과 정상 구강점막에 비하여 다소 낮게 관찰되었으며, 비각화성 낭종상피보다는 각화 낭종상피에서 훨씬 증가되어 있었고, 염증세포 침윤으로 인한 대상성 상피증식 부위에서는 세포 증식이 매우 증가되어 있었다. 2. 치성낭종 상피의 분화성은 transglutaminase C를 이용한 항원성을 관찰한 결과 일반적으로 정상 구강 점막상피에 비하여 낮은 양성 반응을 보였고, 단방성이고 각화가 잘 되었으며 상피의 두께가 20-30층으로 비후되어 있는 치성낭종 상피에서는 각화층에 국한되어 강한 양성 반응을 보였다. 또한 열충격단백질 70은 모든 치성낭종 상피세포에서 강한 양성반응을 보였다. 3. 세포능동사망현상은 비각화 낭종상피에서는 관찰되지 않았고, 각화 낭종상피의 부분적으로 탈락되는 상피세포에서 양성반응이 관찰되었다. 4. 다방성이고 얇은 상피층을 갖는 치성 각화낭종(odontogenic keratocyst)에서는 낭종상피 전반에 걸쳐 transglutaminase C의 발현이 증가되어 있으나, 세포 증식인자의 발현은 구강점막 상피세포와 비교하여 대부분 낮게 관찰되었다. 5.특히 염증성 증식을 보이는 낭종상피에서는 세포 증식인자가 전 세포층에서 미만성으로 발현되었다. 결론적으로 치성낭종 상피세포는 정상 구강 점막상피에서보다 세포 증식인자의 발현이 저조한 것으로 나타났으며, 낭종상피의 분화 활성도는 낭종 내부의 염증세포 침윤이나 간엽조직에서 발생되는 자극에 의하여 크게 영향을 받을 것으로 추론되었다. The epithelium of odontogenic cysts seems to be in a specific status of cellular proliferation and cytodifferentiation. With the discovery of various genes which might play essential roles in the specific stages of cellular proliferation and differentiation, the cellular conditions of odontogenic cyst epithelium should be reevaluated. This study aimed to estimate the degree of proliferating, differentiating and apoptotic activities of odontogenic cyst epithelium using antisera of PCNA, Ki-67, Rb protein, c-erbB-2 oncoprotein, transglutaminase C, heat shock protein 70 and ApopTag method in 19 cases of odontogenic cysts. Cellular changes of the cyst epithelium were measured by intensity of each immunohistochemical staining, and they were discussed with the influence of inflammatory cell infiltration into the cyst epithelium. Results were as follows: 1. In the immunohistochemical staining with primary antibodies against PCNA, Ki-67, Rb protein, c-erbB-2 protein and MPM-2, almost all cases of odontogenic cysts showed a diffuse weak positive reaction. 2. Expression of transglutaminase C in the non-keratinizing odontogenic cysts was weakly positive, but a strongly positive transglutaminase C expression was shown in the keratinizing layer of keratinizing odontogenic cysts. And heat shock protein 70 showed a strongly positive reaction in all of odontogenic cysts. 3. Occasionally, a few apoptotic body was observed in the superficial keratin layer. 4. In the odontogenic keratocysts, which are multilocular with a thin epithelial lining, proliferating factors were weakly positive, whereas transglutaminase C immunostaining was increased. 5. In the hyperplastic cyst epithelium due to inflammatory reaction, proliferating factors were diffusely positive in all epithelial layers, whereas proliferating and differentiating factors were almost negative in severe inflammatory condition showing degenerating lining epithelium. From the above results, we presumed that the endogenous proliferating activity of the cyst epithelium was lower than that of normal oral mucosa epithelium, and also supposed that the cyst epithelium could be reactivated for the further proliferation by the exogenous factors of inflammatory reaction and any chemicophysical irritations.

In vitro cultivation and maintenance of Lawsonia intracellularis isolated in Korea

예정용 건국대학교 2004 국내석사

파이어아벤트의 이론증식론을 위한 소극적 옹호

정원호 서울대학교 대학원 2017 국내석사

The aim of this thesis is to defend Feyerabend’s ideas on theory proliferation by rebutting criticisms of his ideas. One thing to consider is that the aim of this thesis is not to advocate Feyerabend actively. In other words, in this thesis I do not subscribe to Feyerabend’s thoughts, but claim that criticisms against Feyerabend’s methodology are ill-founded. In chapter 2, I look over Feyerabend’s arguments about theory proliferation. With historical cases Feyerabend argues that we may admit theory proliferation: invent, and elaborate, theories which are inconsistent with the accepted point of view, even if the latter should happen to be highly confirmed and generally accepted. That is because the evidence that might refute a theory can often be unearthed only with the help of an incompatible alternative. In chapter 3 and 4, I examine two of the most noticeable criticisms against theory proliferation and then respond to these objections. In chapter 3, I review Kuhn’s methodology of normal science which is incompatible with Feyerabend’s methodology of theory proliferation. The biggest difference between them is a view on the functional role of normal science. On the one hand, Kuhn claims that normal science has the functional role of leading to revolutions and thus is necessary presupposition of revolutions. On the other hand, Feyerabend argues that a character normal science, the principle of tenacity, does not enough to make revolutions and the principle of the proliferation of theories should be followed to lead to revolutions. For evaluating these methodologies, I examine historical studies on the exemplary scientific revolution, that is, Copernican revolution. These studies reveal that Feyerabend’s methodology is much closer to the process of Copernican revolution than that of Kuhn’s. In chapter 4 I review Laudan’s criticisms against Feyerabend and then respond to them. Laudan criticizes Feyerabend’s arguments in two ways. First, Laudan casts doubts on the Feyerabend’s historical argument based on several historical cases because they are small in number. Second, Laudan criticizes the Feyerabend’s general idea that the fact that might refute a theory can often be uncovered only with the help of an incompatible alternative. Laudan argues that even if a rival explains the observed phenomenon well, the phenomenon does not entail negation of the theory. That is because adherents of the theory can surely stick to their theory and deny that the decisive fact is a potential falsifier of the theory. However, Laudan’s criticisms have no effect on Feyerabend’s arguments. First, Feyerabend’s several cases are too significant to neglect. And second, Laudan misunderstands the term ‘refutation’ used by Feyerabend. 이 논문의 목표는 파이어아벤트의 이론증식론에 대한 비판들에 재 반론함으로써 이론증식론을 옹호하는 것이다. 한 가지 염두에 둘 점은 이 논문의 목표가 파이어아벤트를 적극적으로 옹호하는 것이 아니라는 점이다. 나는 파이어아벤트의 생각에 찬동하는 것이 아니라, 파이어아벤트의 방법론에 대한 비판들이 근거가 없는 것임을 주장한다. 본 논문의 2장에서 나는 이론증식론에 관한 파이어아벤트의 주장들을 살핀다. 역사적 사례들을 가지고 파이어아벤트는 ‘잘 입증되어 널리 수용된 이론일지라도 이와 양립불가능한 대안이론을 창안하고 정교화 하라’는 이론증식론을 허용할 것을 주장한다. 이론을 반박할 수 있는 증거는 종종 그 이론과 양립불가능한 대안이론의 도움으로 밝혀지기 때문이다. 본 논문의 3장과 4장에서는 파이어아벤트의 이론증식론에 대해 주목할 만한 두 비판들을 살펴보고 이에 대응한다. 3장에서 나는 이론증식론과 대립되는 토마스 쿤의 정상과학론을 다룬다. 이론증식론과 정상과학론은 정상과학의 기능적 역할에 관한 견해에서 차이가 있다. 쿤은 정상과학이 과학혁명을 이끄는 기능적 역할을 하기 때문에, 정상과학은 과학혁명에 필연적 조건이라고 말한다. 반면 파이어아벤트는 정상과학의 특성(고집의 원리)만으로 혁명을 만드는데 충분하지 않으며, 증식의 원리가 그와 함께 수행되어야 한다고 말한다. 두 방법론 사이에 판정을 내리기 위해 나는 과학혁명의 모범적인 사례라고 할 수 있는 코페르니쿠스 혁명에 관한 역사연구들을 살펴본다. 이 역사연구들은 코페르니쿠스 혁명과정이 파이어어벤트의 이론증식론과 더 가깝다는 것을 보여준다. 4장에서 나는 이론증식론에 대한 라우든의 비판을 다루고 이에 대응한다. 라우든은 파이어아벤트를 두 갈래로 비판한다. 라우든은 첫 번째로 제시된 사례의 수가 적다는 점에서 서너 가지 과학사 사례에 기반한 파이어아벤트의 역사적 논증에 의문을 제기한다. 두 번째로 라우든은 ‘이론을 반박할 수 있는 사실은 종종 그 이론과 양립불가능한 대안이론의 도움으로 밝혀진다’는 파이어아벤트의 논지를 비판한다. 라우든은 대안이론이 관찰된 현상을 아무리 잘 설명한다고 해도, 그 사실이 기존 이론의 부정을 함축하는 것은 아니라고 주장한다. 왜냐하면 이론의 신봉자들은 기존이론을 고수할 수 있으며 그 결정적인 증거가 이 기존이론의 잠재적 반박자라는 것을 거부할 것이기 때문이다. 그러나 라우든의 비판은 파이어아벤트의 주장에 해를 가하지 못한다. 첫 번째로 파이어아벤트가 든 서너 가지 역사적 사례는 과학에서 매우 중요한 사례이기 때문에 경시될 수는 없으며, 두 번째로 라우든은 파이어아벤트가 사용한 용어 ‘반박’을 오해하였다.

전립선비대증에서 세포증식과 고사 및 성장인자의 역할에 대한 연구

윤하나 梨花女子大學校 大學院 1996 국내석사

당뇨 모델 췌장도의 증식 관여 단백질에 대한 연구

김병무 인하대학교 대학원 1999 국내석사

본 실험에서는 여러 가지 당뇨병의 모델로부터 췌장세포의 증식을 일으키는 현상을 기초로 하여 이 증식현상에 관여하는 단백질을 확인하고 역할을 밝히고자 하였다. 이를 위하여 streptozotocin으로 흰쥐에 당뇨를 유발해 세포의 증식을 유도하였고, β세포의 증식 현상을 보이는 NIDDM 모델인 KKA^(y), db/db mouse의 췌장을 β세포의 결손이 있는 NOD mouse와 비교, 분석하였다. 이와 같은 실험을 통하여 증식 형태, 증식세포의 종류, 이때 발현되는 단백질의 변화 등을 면역세포화학법, in-situ hybridization 등의 조직학적인 방법과 northern blot, western blot 등의 분자 생물학적인 방법으로 비교 관찰하였다. 본 실험의 결과에 의하면, streptozotocin을 주입한 흰쥐의 췌장 islet는 1 주일이 지나면서 세포의 증식 현상을 관찰할 수 있었고, 이 때 증식되는 세포의 종류는 glucagon을 분비하는 α세포이었다. 또한, 이때 증식되는 α세포에서는 glucagon과 더불어 clusterin, B/K 단백질이 발현되었으며 당뇨가 진행되어 혈당이 올라갈수록 이들 단백질의 발현양도 증가하는 양상을 보였다. Northern blot의 결과 clusterin은 streptozotocin을 투여하면 즉각적으로 증가되는 반면 B/K는 α세포의 증식이 일어난 후에 다량 발현되었다. KKA^(y) mouse의 췌장 islet에서는 β세포의 증식이 나타나지만 clusterin과 B/K를 분비하는 세포는 α세포이었고 이 α세포는 islet 전체에 산재된 모습으로 존재하여 B/K 단백질을 발현하였다. 반면, 비만 당뇨쥐인 db/db mouse islet의 α세포는 clusterin과 B/K를 모두 많이 발현하였다. 이와 같은 실험 결과로 볼 때 clusterin은 외부 자극에 대하여 세포를 보호하는 역할을 하며, B/K는 조직의 세포를 재구성하는 요소로써 작용한다고 생각된다. 따라서 본 연구자는 이 단백질들이 특이하게 증식되는 α세포에서만 발현되어지는 점으로 보아 이들의 조절은 당뇨병의 치료에 기초가 될 것으로 생각된다. Destruction of. the pancreatic β-cells results in a kind of diabetes. Recently, it has been reported that clusterin involved tissue reorganization not only during embryonic development but also in damaged tissues. Therefore, islet β-cell proliferation may be crucial for the diabetic patients. The aim of this work was designed to determine the islet cell proliferation, and to describe the function of the molecules associated proliferation. In the present study, we have observed that islet cell population increases in the various diabetic models including streptozotocin induced diabetic model, NOD, KKA^(y), db/db mice. Therefore, we attempted to find the protein molecules in these diabetic animal models. Although, B/K, expressed in the islet, which was first recognized in the selected regions of the brain and kidney. However, the roles of B/K both in the brain and in the kidney has not been elucidated yet. In order to induce islet cell proliferation, we injected streptozotocin into the rat jugular vein. At 12-24 hr after treatment, islet cell death was evident with karyolysis and dissociation of the intracellular junctions in most β-cells. At 72 hr after streptozotocin treatment, however, the remaining cells showed a normal appearance and began to proliferate. From this time on, the volume of the islets gradually increased. In those streptozotocin treated animals, the proliferating cells were fumed out to be α-cells and expressed clusterin as well as B/K together with glucagon. Double immunolabeling showed co-localization of clusterin, B/K and glucagon in the same secretory granules of the cells. Clusterin and B/K were also strongly detected in the pancreatic islets of the NIDDM animal (KKA^(y), db/db) showing the islet cell proliferation. These results imply that the proteins play the important roles in cell protection as well as cell proliferation or tissue remodeling The expressions of clusterin and B/K mRNA were examined by the northern blot analysis. While the levels of clusterin mRNA in the rat pancreas were steadily increased from 1 hr after streptozotocin treatment, B/K mRNA was significantly increased at 14 day following streptozotocin injection. It suggests that both clusterin and B/K proteins may function as the molecules of the cell protection and cell proliferation leading to tissue remodeling. However, clusterin might be rather associated with cell protection than cell proliferation while the Bht takes mainly part in cell proliferation. We concluded that the protein, clusterin and B/K play the important roles in proliferation of α-cell, but not in β-cell growth. Therefore, it could be suggested that the regulation of the α-cell proliferation by depleting the proteins may induced the environment for β-cell growth.

Epigallocathechin gallate가 인체 유방암세포인 MDA-MB-231의 세포 증식과 사멸에 미치는 영향

홍은정 단국대학교 2006 국내석사

본 연구는 녹차의 성분인 epigallocatechin gallate (EGCG)가 인체 유방암 세포인 MDA-MB-231의 증식과 사멸에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. EGCG가 MDA-MB-231의 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 실시하였으며 세포증식 관련인자인 ErbB2, ErbB3 와 증식 신호 전달 단백질 Akt, 사멸억제 단백질 bcl-2, 사멸유도 단백질 bax 등을 western blot analysis를 통해 단백질 발현을 관찰하였다. RT-PCR을 이용하여 위 단백질의 mRNA 발현을 관찰하였다. 실험 결과 EGCG를 처리한 24시간 후에는, 세포증식 억제에 영향을 미치지 않았으나 48시간, 72시간 후에는 유의적으로 EGCG처리 농도가 증가할수록 세포증식이 억제 되었다. 세포 성장 신호를 전달하는 수용체인 ErbB2와 ErbB3 단백질의 발현은 10 ㎛ 이상일 때 유의적으로 감소하였으며 mRNA 발현은 5 ㎛이상일 때 유의적으로 감소하였고 세포 증식 신호 전달 단백질인 Akt 발현은 EGCG의 처리 농도가 10 ㎛ 이상일 때 단백질과 mRNA 발현이 유의적으로 감소하였다. 세포 사멸을 억제하는 단백질인 bcl-2의 단백질과 mRNA 발현은 EGCG 처리 농도 5 ㎛ 이상일 때부터 유의적으로 감소하였으며, 세포 사멸을 유도하는 단백질인 bax의 발현은 5 ㎛ 이상부터 유의적으로 증가하였다. 두 단백질의 비율인 bcl-2/bax는 10 ㎛이상의 농도에서 유의적으로 감소하였다. Caspase-3의 활성은 5 ㎛ 이상부터 유의적으로 증가 하였다. 그러므로 EGCG가 인체 유방암 세포인 MDA-MB-231에서 세포증식을 억제하고, 사멸을 유도하는 것을 확인하였다. EGCG, a principal antioxidant derived from green tea, is one of the most extensively investigated chemopreventive phytochemicals. However, the effect of EGCG on proliferation and apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cell are not currently well known. In this study, we examined possible mechanisms of regulator protein which is associated with proliferation and apoptosis and caspase activity by EGCG in MDA-MB-231 breast cancer cells. We cultured MDA-MB-231 cells in presence of various concentrations (0, 5, 10 ,20 ㎛) of EGCG. EGCG inhibited breast cancer cell growth in a does-dependent manner (p〈 0.05) by MTT assay. ErbB2, and ErbB3 protein expression were significantly decreased does-dependently in cells treated with EGCG (p〈 0.05). In addition, phosphorylated Akt levels and total Akt levels were significantly decreased in cells treated with EGCG. Bcl-2 protein and mRNA expression were also decreased does-dependently in cells treated with EGCG. However, bax protein and mRNA expression was increased (p〈 0.05). Caspase-3 activity was increased does-dependently in cells treated with EGCG. In conclusion, we have shown that EGCG inhibits cell growth and induces apoptosis in MDA-MB-231 human breast cancer cells

인체 위암세포주 AGS의 증식에 미치는 curcumin의 억제효과

김현주 고신대학교 2002 국내박사

배경/목적: curcumin (diferuloylmethane)은 동인도산의 생강과에 속하는 식물인 Curcuma longa Linn (Zingiberaceae)의 뿌리에서 추출하여 인도지역의 음식에 널리 사용되어 지고 있는 노란색 향신료인 심황(turmeric)의 주성분이다. 근래 이 물질이 동물실험에서의 연구결과 항발암 작용 및 항돌연변이 작용을 가지고, 대장암, 십이지장암, 간암 등 여러 종류 암의 발생을 예방하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 암에 대한 증식억제작용이나 치료제로서의 가능성에 대한 연구들은 비교적 적은 편이고, 이 중 위암에 대한 연구는 거의 없다. 이에 curcumin이 실제 위암의 치료에 도움이 될지를 자세히 구명하기 위해, 세포배양실험을 통하여 curcumin이 인체 위암세포 AGS의 증식에 미치는 효과를 조사하고, 기존의 항암제 5-fluorouracil (5-FU)과의 병용효과를 조사하였다. 또한 작용기전을 좀 더 자세히 구명하기 위해 증식억제에 따르는 각 세포주기별 비율을 flow cytometry를 이용하여 분석하였다. 재료 및 방법: 인체 위암세포 AGS는 10% 우태아 혈청을 포함한 RPMl 1640 배지에서 계대 배양하였으며, 증식기에 도달하였을 때 6 well plate에 각 well당 10x104개의 세포를 분주한 후 curcumin은 1 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM의 농도로, 5-FU는 0.1 μ g/㎖과 0.3 μ g/㎖의 농도로 각각 혹은 두 약제를 병용 첨가하여 2일 및 4일 째에 세포수를 측정하여 증식억제 정도를 비교하였다. 증식억제의 가역성은 6 well plate에 각 well당 2×104개의 세포를 분주하여, 10 μM의 curcumin을 첨가한 후, 2-9일에 걸쳐 조사하였다. 또한 curcumin 10 μM을 첨가한 배지에서 4 일간 배양된 세포에서 세포주기를 측정하였다. 결과: 1) curcumin 1 μM을 첨가했을 때는 2일 및 4일째 모두 대조군과 세포수의 유의한 차이가 없었으나, curcumin 5 μM을 첨가했을 때는 4일째 세포증식이 유의하게 억제되었다 (p<0.05). 2) 증식억제 효과는 curcumin의 농도에 비례하여, 배양 4일 째에 curcumin 5 μM에서는 33.9%, 10 μM에서는 50.9%, 25 μM에서는 92.4%의 증식억제 효과를 나타 내었고, 이러한 증식억제 효과는 가역적이었다. 3) curcumin과 5-FU 병용첨가의 경우에 curcumin 혹은 5-PU 단독 첨가의 경우보다 현저하게 더 암세포의 증식이 억제되었으며, 그 억제 효과는 상승적임을 나타내었다. 4) curcumin 10 μM을 첨가한 배지에서 4일 째 측정한 세포주기분석 결과, curcumin 10 μM 첨�봇【�대조군 보다 G2-M기의 세포수가 훨씬 많음으로써, G2-M기에서의 진행이 차단되어 세포 증식이 억제되어 있었다. 결론: curcumin은 농도에 비례하여 인체 위암세포의 증식을 억제하였고, 그 증식 역제 효과가 가역적이었으며, G2-M기의 세포주기를 차단하였다. 본 연구에 적용된 curcumin의 농도(5~50 μM)는 curcumin의 허용량인 1일 160mg~8g의 섭취로 도달할 수 있는 혈청 농도(2 ~100 μM)범위와 비슷한 경향을 보임으로써, curcumin이 상용량으로 위암환사의 치료에 유용하게 쓰여 질 수 있음을 나타내었다. 그리고 curcumin과 5-FU를 병용 투여하였을 경우 현저한 상승효과가 있어서 curcumin이 단독으로 뿐 아니라 5-FU와 병용 투여할 때도 위암의 좋은 치료제로 사용될 수 있음을 보여 주었다. 앞으로 동물 실험 및 임상 연구를 통해서 curcumin이 5-FU외의 다른 항암제와 같이 위암의 치료에 쓰여 질 수 있는 가능성에 대해서도 연구해야 할 것으로 생각되었다. Backgrounds/Aims : Curcumin, which is a major component of tumeric extracted from the rhizome of Curcuma longa, and is commonly used as a yellow coloring and flavoring agent in foods, has shown anti-carcinogenic and anti-mutegenic activity and chempreventive effects in animals, but only a small number of studies were done on its antiproliferative effects, especially in gastric cancer. In the present study the effects of curcumin on the growth of human gastric carcinoma cell line, AGS cells were examined and the effects of 5-fluorouracil(5-FU) were also studied. Cell cycle analysis was done to examine the mechanisms for the inhibitory effects of curcumin. Materials/Methods : The growth of AGS cells were examined by counting cell number on one and three days treatment with 1 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM curcumin, and 0.1 μg/ml, 0.3 μg/ml 5-FU, after plating AGS cells into 35-mm² plastic dishes at a density of 10x10⁴ cells/dish. The reversibility of the effects of curcumin was examined on one day to seven days treatment with 10 μM curcumin after seeding 2x10⁴ cells/dish. To examine the mechanisms for the inhibitory effects of curcumin, cell cycle analysis was done on the cells after four days treatment with 10 μM curcumin. Results : 1) Curcumin significantly inhibited the growth of AGS cells in a dose-dependent fashion(p<0.05). Thirty-four percent inhibition of growth was found at an curcumin concentration of 5 μM and fifty-one percent at 10 μM, ninety-two at 25 μM, after 4 days treatment. 2) The inhibitary effect of curcumin on the growth of AGS cells was firstly shown at the concentration of 0.4 p M. 3) The removal of curcumin by a media change after 24 hours treatment of curcumin was not different from that of control group, which was not treated by curcumin, which suggest reversibility. 4) Curcumin combined with 5-FU markedly inhibited the growth of AGS cells compared to curcumin or 5-FU alone (p<0.05), which suggested synergistic effect of the two drugs. 5) After four days treatment with 10 μM curcumin, the fraction of cells in G2-M phase was 60.5% in curcumin group, which was much higher than 22.0% of the control group, suggesting G2-M block by curcumin treatment. Conclusions : Curcumin significantly inhibited the growth of AGS cells in a dose-dependent fashion. The inhibitory effect of curcumin on the growth of AGS cells was reversible since the growth of AGS cells after removal of curcumin by a media change after 24 hours treatment of curcumin was not different from that of control group which was not treated by curcumin. The reversilbility of growth inhibition suggests that curcumin is not a non-specfic cytotoxin for AGS cells. This is the first report that curcumin may be very useful for the treatment of gastric carcinoma, especially in conjunction with 5-FU, because the concentrations(5~50 μM) used in our study were within the ranges of steady-state concentrations(2~100 μM) attainable in human serum by chronic administeration of recomanded dose (160mg~8gm/day) of curcumin and probable synergistic effect of curcumin and 5-FU. More studies by animal experiments and clinical trials are needed to establish curcumin as an anticancer drug for human gastric carcinoma.