백합의 원형질체 분리 및 배양에 관한 연구

박수영 제주대학교 대학원 1998 국내석사

본 연구는 백합육종의 기초자료로 삼고자 Longiflorum 계통의 Georgia 엽육조직으로부터 원형질체를 분리, 배양함으로써 재생여부를 확인하고 Georgia와 Macro polo의 원형질체 융합을 시도하였다. 1. 인편 배양 결과 shoot와 root의 수는 1.0 mg/L NAA와 5.0 mg/L BAP에서 높게 나타났고, shoot 길이는 1.0mg/L NAA와 0.1mg/L BAP, root 길이는 0.1mg/L NAA와 1.0mg/L BAP에서, 자구수는 1.0mg/L HAP 단용처리구에서 높게 나타났다. 그리고 캘러스 형성은 0.1mg/L NAA와 0.1mg/L BAP에서 양호하게 나타났다. 2. 캘러스에서의 기관 분화 유도는 MS배지와 1/2MS배지에 배양한 결과 2개의 배지 모두 shoot와 root 분화가 1.0mg/L NAA와 1.0mg/L HAP 혼용처리구에서 양호하게 나타났다. 3. 원형질체 분리 적정농도를 알아보기 위해 Onozuka cellulase R-10, Macerozyme H-10, 그리고 Pectolyase를 효소농도별로 처리해본 결과 삼투조절제는 0.5M mannitol, 효소농도는 1.0% Cellulase, 1.0% Macerozyme, 0.1% Pectolyase를 처리시 2∼3시간대로 분리가 가장 잘 되었다. 4. 원형질체 배양은 NH_(4)O_(3)를 첨가하지 않은 1/2MS수정배지에 1.0mg/L NAA와 1.0mg/L BAP를 혼용처리하였을때가 가장 좋았으며, 액체배지를 이용할 때가 원형질체의 생존율 및 세포분열이 가장 양호하였다. 초기배양 한달 후 세포괴가 형성 되었고, 그 후 한천배지로 계대배양하여 재분화를 유도하였다. 5. PEG에 의한 원형질 용합은 그 융합빈도는 높지 않았으나 PEG 50%용액에서 약20분간 처리시 융합 빈도가 가장 높게 나타났다. The study was carried out isolation and culture of protoplast from mesophyll tissues of lily(Lilium longiflorum Thunb), and protoplast fusion of Georgia and Macro polo for breeding of lily. In scale culture MS medium with 1.0mg/L NAA and 5.0mg/L BAP was the best for shoot number and root number, 1.0mg/L NAA and 0.1 mg/L BAP for the lengths of shoot, 0.1mg/L NAA and 1.0mg/L BAP for the lengths of root, 0.lmg/L BAP for the number of bulb, and 0.1mg/L NAA and 0.1mg/L BAP for the formation of callus. Plantlet regeneration from callus was the highest in the MS medium and 1/2 MS medium with 1.0mg/L NAA and 1.0mg/L BAP. The yield of protoplasts was the highest when cells are incubated in the enzyme solution of 0.5M mannitol, 1.0% Onozuka cellulase R-10, 1.0% Macerozyme R-10, and 0.1% Pectolyase for treatment of 2∼3 hours. The protoplasts was most effectively cultured in the modified 1/2 MS medium without NH_(4)NO_(3) with 1.0mg/L NAA and 1.0mg/L BAP, and also protoplasts survived the best on stabilized liquid layer. Colonies were obtained after 1 month of culture. The calli grew and regenerated shoots by transferring them on the same composition of the solidified medium. The protoplast fusion was performed with the PEG methods. The yield of protoplast fusion was the highest in the 50% PEG concentration treated for 20 minutes.

방사선 조사 후 담배(Nicotiana benthamiana) 원형질체 배양을 통한 내염성 돌연변이체의 신속 선발 체계 개발

진다몬 전남대학교 2021 국내석사

본 연구는 방사선조사 기술과 원형질체 배양 기술을 융합하여 돌연변이 세포주를 신속하게 선발할 수 있는 체계를 개발하고자 하였다. 내염성을 selection trait로 사용하였으며, 이는 원형질체 유래 cell colony로부터의 신속한 selection agent 로 원형질체 배양에 쉽게 적용 될 수 있다. 담배 원형질체의 내염성 정도를 조사하기 잎에서 분리된 원형질체를 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 mM NaCl이 첨가된 배지에서 배양하였다. ≥100 mM NaCl이 첨가된 처리구에서는 배양 4주 후 세포분열을 통한 cell colony 형성이 전혀 이루어지지 않았다. 방사선 세기에 따른 담배 원형질체의 세포분열 영향을 조사하기 위해 0, 50, 100, 200, 400 Gy로 조사한 후 배양한 결과 방사선 세기는 50 Gy 로 선정하였다. 내염성 담배 돌연변이주 식물체 개발을 위해 50 Gy 방사선이 조사된 원형질체를 100 mM NaCl이 첨가된 배지에서 배양하였다. 원형질체로부터 cell colony 형성 효율은 약 0.002% 정도이었다. 선발된 내염성 돌연변이 callus는 동일 배지에서 증식한 다음 줄기유도배지로 옮겨 배양하여 shoot을 유도하였다. 유도된 shoot은 200 mM 이 첨가된 배지로 옮겨 배양한 결과 정상적인 소식물체로 발달하였다. 본 연구에서 확립된 내염성 담배 돌연변이주의 신속 선발 기술은 다양한 환경스트레스 내성 작물 개발 수단으로 활용 가능할 것으로 기대된다. In this study, aimed to develop a novel technology capable of rapidly selecting mutant plant cell lines. Salt resistance was chosen as a rapid selection trait that is easily applicable to protoplast-derived cell colonies. Mesophyll protoplasts were cultured in a medium supplemented with 0, 50, 100, 150, 200, 250, and 300 mM NaCl. At NaCl concentrations ≥100 mM, cell colony formation was strongly inhibited after 4 weeks of culture. Tobacco protoplasts irradiated with 0, 50, 100, 200, and 400 Gy were then cultured to investigate the effects of radiation intensity on cell division. The optimal radiation intensity was 50 Gy. To develop salt-resistant tobacco mutant plants, protoplasts irradiated with 50 Gy were cultured in a medium containing 100 mM NaCl. The efficiency of cell colony formation from these protoplasts was approximately 0.002%. A salt-resistant mutant callus was selected and proliferated in the same medium and then transferred to a shoot inducing medium for adventitious shoot formation. The obtained shoots were then cultured in a medium supplemented with 200 mM NaCl and developed into normal plantlets. This rapid selection technology for generating salt-resistant tobacco mutants will be useful for the development of crop varieties resistant to environmental stresses.

곰팡이병 저항성 상업용 고추 개발을 위한 크리스퍼 유전자가위 적용 원형질체 배양에 관한 연구

박재형 강원대학교 대학원 2024 국내석사

벼의 原形質體 裸出과 최적배양배지 선발에 관한 연구

박정자 梨花女子大學校 敎育大學院 1985 국내석사

무우,배추 및 갓의 原形質體의 裸出과 融合

고갑천 全南大學校 1987 국내석사

本 硏究는 무우, 배추 및 갓의 體細胞 雜種生産을 爲한 基礎硏究로 原形質體 裸出을 爲한 適合한 試料의 選擇, 酵素溶液의 濃度 및 酵素의 處理時間을 究明했고 이로부터 얻어진 原形質體를 利用하여 融合을 實施한 結果는 다음과 같다. 1. 무우, 배추 및 갓 모두 Cellulase R-10 1∼2 % 範圍에서 原形質體의 收率이 良好하였고 무우, 배추 및 갓의 本葉에서 處理時間에 따른 原形質體의 收率은 6時間까지 比例的으로 增加하였으나 그 以後에는 減少하였다. 渗透調節制인 mannitol 濃度는 배추에서 0.6M, 무우와 갓은 0.7M에서 完全한 原形質體가 가장 많았으며 酵素溶液의 pH는 5.8이 이들 3種 植物 供히 가장 適合하였다. 2. 原形質體 裸出은 무우와 갓은 plastic house에서 裁培된 本葉과 子葉 및 器內培養된 子葉의 順으로 좋았으나 배추의 境遇 器內培養된 葉肉組織에서 가장 많은 原形質體를 얻을 수 있었다. 3. 裸出된 原形質體를 30% PEG(M. W. 6000) 存在下에서 融合시킨 결과 heteroplasmic fusion이 무우와 배추間은 12%, 배추와 갓間은 14%, 그리고 갓과 무우間은 11% 程度 이었다. This study was carried out to get fundamental information for the production of somatic hybrids between Raphanus sativus, Brassica camPestris ssp. Pekinensis and Brassica juncea. 1. Enzyme mixture of 1-2% Cellulase R-10 with CPW, 0.5% Macerozyme, 0.7 M mannitol and pH 5.8 was suitable for protoplast isolation from all the materials. Incubation time for 6 hrs. was best for the species to isolate protoplasts from green house cultured young leaves. Optimal concentration of mannitol was 0.7M for R. sativus and B. juncea but 0.6M for B. camPestric ssp. pekinensis when the protoplasts were isolated from leaf mesophyll. pH 5.8 was adequate for protoplast isolation of the three species. 2. Source materials used were in vitro cultured cotyledons and leaves, green house cultured cotyledons and young leaves. In vitro cultured leaf mesophyll was the most suitable to get the protoplasts of B. campestris ssp. pekinensis. As in vitro cultured leaf was not used for the isolation of protoplast of R. sativus and B. juncea, protoplast yield was high from green house cultured young leaf mesophyll. 3. The rate of heteroplasmic fusion was 12% from sativus+B. campestris ssp. Pekinensis, 14% from B. campestris ssp. pekinensis +B. juncea, and 11% from R. sati vus +B. juncea.

도라지와 더덕의 原形質體 培養 및 融合

오찬교 全南大學校 1988 국내석사

도라지와 더덕의 原形質體을 裸出하여 各各의 原形質體을 培養하고 또는 이들 原形質體를 融合 培養한 結果는 다음과 같다. 1. 도라지와 더덕의 原形質體 培養에서 MS와 B5培地 共히 0.3M glucose와 0.2M mannitol을 添加한 培地에서 가장 좋은 細胞分裂을 보였다. 2. 培養方法으로는 도라지는 Droplet Method 와 Nutrient Film Method에서 細胞分裂이 잘 되었고 Agar Plate Method에서는 細胞分裂이 일어나지 않았다. 한편 더덕은 세가지 培養方法 모두에서 細胞分裂이 잘 되었다. 3. 도라지의 葉肉細胞 原形質體와 더덕의 callus 原形質體는 30% PEG處理에서 heteroplasmic fusion이 13%이었고, homoplasmic fusion은 19%이었다. 4. 도라지와 더덕 兩種의 callus 原形質體의 融合頻度는 높았으나 同型 및 異型原形質體 融合은 區分할 수 없었다. 그러나 이들은 巨大細胞로 되어 分裂하며 子細胞를 形成, 다시 micro cell colony를 形成하였다. In order to assess the possibility of synthesizing somatic hybrids between Platycodon grandiflorum and Codonopsis lanceolata, protoplasts of the two species were isolated, and the protoplasts of individual species as well as their fusion products were cultured. The results are summarized as follows. 1. The best cell division was observed from the protoplast culture of P. grandiflorum and C. lanceolata on both MS and B5 media when 0.3M of glucose and 0.2M mannitol were supplemented. 2. Good cell division was observed from the protoplasts of both P. grand iflorum and C. lanceolata when Droplet Method or Nutrient Film Method were employed but only C. landceolata 'a protoplasts responsed to Agar Plate Method. 3. When p. grandiflorum mesophyll protoplasts and C. lanceolata callus protoplasts were induced to fuse by 30% polyethylene glycol, the rates of heteroplasmic and polyethylene aggregates were 13% and 19%, respectively. 4. The fusion rate between callus protoplasts of both species was high even though the heteroplasmic aggregates were not distinguished. However, the giant fusion products regenerated into cells and divided to form micro cell colonies.

Aspergillus niger의 원형질체 융합에 관한 연구

김무성 한양대학교 대학원 생물학과 1985 국내석사

Cellulomonas biazotea의 원형질체 융합에 관한 연구

백대우 漢陽大學校 大學院 1986 국내석사

Cellulomonas속 세균의 원형질체 형성과 전자현미경적 연구

이은주 梨花女子大學校 大學院 1985 국내석사

油菜(Brassica napus L.)와 무(Raphanus sativus L.)의 原形質體培養 및 體細胞雜種植物 生産

장영석 全南大學校 大學院 1996 국내박사

油菜(Brassica napus L.)에는 細胞質雄性不稔의 유전자원이 없으나 무(Raphanus sativus L.)에는 세포질웅성불임성(Ogura-CMS)계통이 있으므로 유채의 1대잡종 품종 육성을 위해서는 무의 웅성불임성을 도입하는 것이 바람직하다. 그러나 유채와 무는 屬이 다르기 때문에 有性交雜에 의한 遺傳子 移入이 어려우므로 原形質體 融合으로 體細胞雜種을 만들어 이용하는 방법이 개발되어야 한다. 따라서 본 연구에서는 유채와 무의 체세포잡종 식물을 獲得하는 체계를 확립코자 原形質體源으로 兩種植物體의 部位와 원형질체 分離를 위한 酵素液의 조합과 濃度에 따른 원형질체 生産效率과 原形質體 培養培地의 種類, 渗透壓調節劑 및 生長調節劑의 종류와 농도에 따른 원형질체의 배양효과, 유채와 무의 原形質體 融合方法, 식물체 再生에 미치는 생장조절제의 종류와 농도의 영향 등에 관하여 실험하였으며 그 결과 얻어진 體細胞雜種植物體의 雜種性을 調査 分析하였다. 1) 원형질체 분리에 최적인 효소조합과 농도조건에서 下胚軸으로부터 원형질체 生成頻度는 유채에서 0.18 × 10^5 protoplasts g^(-1) 무에서 0.06 × 10^5 protoplasts g^(-1)이었으며 자엽으로부터는 유채에서 5.8 × 10^5 protoplasts g^(-1) 무에서 4.2 × 10^5 protoplasts g^(-1) 엽육으로부터는 유채에서 4.6 × 10^5 protoplasts g^(-1) 무에서 2.8 × 10^5 protoplasts g^(-1) 줄기피층으로부터는 유채에서 3.0 × 10^5 protoplasts g^(-1) 무에서 2.3 × 10^5 protoplasts g^(-1)였다. 2) 유채와 무의 원형질체 배양에는 하배축, 자엽 및 줄기피층원형질체에서는 KM이나 NN배지가, 엽육원형질체에서는 Kao배지가 가장 좋았고, 최적인 삼투압조절제의 종류와 농도는 하배축과 자엽원형질체에서는 glucose 0.35M이었고, 엽육원형질체에서는 glucose 0.38M, 줄기피층원형질체에서는 sucrose 0.30M이었다. 3) 원형질체 배양시 최적의 생장조절제의 조합과 농도에서 세포집락 형성율은 하배축원형질체에서 유채는 1.8%, 무는 0.8%, 자엽원형질체에서 유채는 2.4%, 무는1.5%, 엽육원형질체에서 유채는 2.7%, 무는 1.0%, 줄기피층원형질체에서 유채는 2.8%, 무는 1.1%였다. 4) 식물체 재생에는 모든 원형질체에서 B5배지가 가장 효과적이었고, 최적의 생장조절제 첨가배지에서 식물체재생율은 하배축원형질체로부터 유채에서 0.8%, 무에서0.3%, 자엽원형질체로부터는 유채에서 24%, 무에서 16%, 엽육원형질체로부터는 유채에서 18%, 무에서 5%, 줄기피층원형질체로부터는 유채에서 15.4%, 무에서 4.6%였다. 5) 유채와 무의 원형질체 융합을 통한 체세포잡종 식물체획득은 PEG법으로는 불가능 하였고 전기융합법(교류시간 6∼8sec, DC pulse시간 20∼40 μsec)에 의하여 유채의 줄기피층원형질체와 무의 하배축원형질체 융합에서 3개체의 잡종 식물체가 얻어졌으며, 원형질체 공여 양친인 漢拏油菜와 Vitamin(무) 및 체세포 잡종 식물체의 DNA와 형태적 특성 및 염색체 수를 비교한 결과 체세포잡종임이 확인되었다. The genetic resource for cytoplasmic male sterility which would enable the F₁seed production is not available within rapeseed germplasm. Therefore, it has been highly desired to transfer the cytoplasmic male sterility by Ogura-CMS of radish to rapeseed. However, rapeseed and radish are so distantly related that gene transter by sexual hybridization over the inter-generic reproductive barrier would not be likely possible. Parasexual hybridization might be an alternative means. The present study examined, for the purpose of establishing an intergeneric somatic hybrid production system, the effects of tissue source and enzymes on protoplast recovery; response of protoplasts in culture to different media, osmoticums and plant growth regulators; methods of protoplast fusion between rapeseed and radish; and effects of frowth regulators on cell and plant regeneration from individual species and their hybrid protoplasts. The results are summarized as follows. 1. Under optimum condition for protoplast isolation, protoplast yield was 0.18×10^5 protoplasts g^(-1) in rapeseed and 0.06×10^5 protoplasts g^(-1) in radish from hypocotyl tissue; 5.8×10^5 protoplasts g^(-1) in rapeseed and 4.2×10^5 protoplasts g^(-1) in radish from cotyledonary tissue; 4.6×10^5 protoplasts g^(-1) in rapeseed and 2.8×10^5 protoplasts g^(-1) in radish from leaf mesophyll; and 3.0×10^5 protoplasts g^(-1) in rapeseed and 2.3×10^5 protoplasts g^(-1) in radish stem cortex. 2. For protoplast culture, KM or NN medium was best for hypocotyl, cotyledonary, or stem cortex protoplasts while Kao medium was best for leaf mwsophyll protoplasts, and the optium osmolality was 0.35M glucose for hypocotyl or cotyledonary protoplasts, 0.38M glucose for leaf mesophyll protoplasts, and 0.30M sucrose for stem cortex protoplasts. Interspecific variation for medium and osmolality was not noticed. 3. In the protoplast culture on the media containing optium combinations of growth regulators, the frequency of cell colony formation was 1.8% in rapeseed and 0.8% in radish from hypocotyl protoplasts; 2.4% in rapeseed and 1.5% in radish from cotyledonary protoplasts; 2.7% in rapeseed and 1.0% in radish from leaf mesophyll protoplasts; and 2.8% in rapeseed and 1.1% in radish from stem cortex protoplasts. 4. The B5 medium was most effective on plant regeneration from all the protoplasts of different sources. The frequency of plant regeneration on the media containing optium combination of growth regulators was 0.8% in rapeseed and 0.3% in radish from hypocotyl protoplasts; 24.0% in rapeseed and 16.0% in radish from cotyledonary protoplasts; 18.0% in rapeseed and 5.0% in radish from leaf mesophyll protoplasts; and 15.4% in rapeseed and 4.6% in radish from stem coryex protoplasts. 5. Somatic hybrid plant production through the fusion of rapeseed and radish protoplasts by polyethyleneglycol was not succesful. Three somatic hybrid plants were regenerated from the fusion products between rapeseed stem cortex protoplasts and radish hypocotyl protoplasts induced by electric shock with alternating current for 6 to 8 sec and direct current for 20 to 40 μsec. Their hybridity was authenticated by morphological, chromosomal and DNA analyses in comparison with the protoplast donor parents of rapeseed and radish.