Statistical Optimization for Production of cellulase and Application of cellulase for Isolation of Functional Materials from Hovenia Dulcis Fruit

김혜진 동아대학교 대학원 2018 국내박사

In this study, microorganisms producing carboxymethylcellulase (CMCase) were isolated from soil and seawater in Kyungsang Province of Korea, identified by analyses of 16S rDNA and partial sequences of gyrA, and named as B. amyloliquefaciens DL-3, B. velezensis A-68, and C. lytica LBH-14. The optimal conditions for production of CMCase by the microorganism were established using one-factor-at-a-time experiment and response surface methodology (RSM). The optimal carbon and nitrogen sources for CMCase production by B. amyloliquefaciencs DL-3 were found to be 50.0 g/L rice hull and 2.0 g/L peptone. The optimal temperature and initial pH for CMCase production were 37°C and 6.8, respectively. The highest productions of CMCase by B. amyloliquefaciencs DL-3 under optimal conditions was 367.3 U/mL. Additionally, the best carbon source for CMCase production by B. velezensis A-68 was found to be rice hull. The optimal conditions of rice hull, yeast extract, initial pH, and temperature for production of CMCase were 50.0 g/L, 5.0 g/L, 7.3, and 35°C, respectively. The highest production of CMCase under the optimized conditions was 83.8 U/mL. However, CMCase activity by B. velezensis A-68 was lower than that of B. amyloliquefaciens DL-3. The optimal conditions of rice bran, ammonium chloride, and initial pH of the medium for CMCase production were 79.9 g/L, 8.5 g/L, and 6.1, respectively. The highest production of CMCase was 110.8 U/mL. Optimal conditions for cell growth and CMCase production by all microorganisms were different. The commercial method for isolating of ampelopsin is simple hydrothermal extraction at a temperature above 100 °C. To improve the ampelopsin isolation process, the effect of treatment with cellulase on hydrolysis of the dried fruit of A. grossedentata was investigated. The effect of temperature on the hydrolysis of dried fruits following treatment with cellulase produced by B. amyloliquefaciens DL-3 were similar at 50, 60, 70, and 80 °C. The process involving cellulase treatment decreased the temperature from 100 to 50°C and time from 24 to 6 h for the hydrolysis of the dried fruits of A. grossedentata. Based on the conversion rate and production of reducing sugars, the optimal amount of dried fruits of A. grossedentata weas determined to be 40.0 g/L. The conditions for filter pressing and continuous flow centrifuge for removing insoluble materials from the hydrolysate of the dried fruit were optimized. First, the filtrate was first separated by a membrane with a MWCO of 300 kDa. The permeate with a molecular weight less than 300 kDa was separated by the membrane with a MWCO of 15 kDa. The recovery yield of ampelopsin from the dried fruits of A. grossedentata was 39.5% according to HPLC chromatographic analysis. A peak for ampelopsin was identified by comparison of the chromatographic retention time with that of the standard of ampelopsin. A safe and economic process at a lower temperature involving cellulase treatment for isolating ampelopsin was developed in this study. 본 연구에서는 대한민국 경상도 지방의 토양과 해양에서 섬유소분해효소를 생산하는 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 16S rDNA partial sequencing 및 gyrase A 유전자 염기서열을 분석을 통해 B. amyloliquefaciens DL-3, B. velezensis A-68, C. lytica LBH-14로 각각 명명하였다. 각 균주의 섬유소분해효소 생산조건을 최적화하기 위해 One-factor-at-a-time 실험법과 response surface method (RSM)를 사용하였다. B. amyloliquefaciens DL-3의 의해 생산되는 섬유소 분해효소는 50.0 g/L Rice hull, 2.0 g/L peptone, initial pH 6.8, 37 °C 일 때 367.3 U/ml 로 최고의 활성을 보였다. B. velezensis A-68 역시 섬유소분해효소의 생산을 위한 최적의 탄소원이 Rice hull 로 밝혀졌다. 50.0 g/L Rice hull, 5.0 g/L Yeast extract, initial pH 7.3, 35 °C에서 83.8 U/ml 의 활성을 나타냈는데, B. amyloliquefaciens DL-3에 비하면 다소 낮은 활성값을 보였다. C. lytica LBH-14 는 Bacillus 균주와 달리 Rice bran을 탄소원으로 하여 112.0 U/mL의 활성을 나타냈다. 질소원은 Ammonium nitrate 8.5 g/L, initial pH 6.1, 25 °C 의 최적조건을 선별하였다. 세 균주 모두 섬유소 분해효소를 생산의 최적조건과 cell growth 최적의 조건이 다르다는 사실을 확인했다. 분리한 각각의 미생물이 생산하는 cellulase를 이용하여 헛개나무 열매의 유효성분을 분리, 추출하는 공정을 확립하고, 헛개나무 열매의 유효성분 분리에서 cellulase의 영향과 최적의 균주 및 조건을 선별하였다. 열에 의한 가수분해로 유효성분을 추출할 경우에는 추출 온도가 50°C 이상부터 효율적으로 추출됨을 알 수 있었다. 추출 온도 및 시간이 증가함에 따라 헛개나무 열매로부터 추출되어 환원당으로 측정되는 양도 증가되었다. 섬유소 분해효소의 첨가가 헛개나무 유효성분 추출에 미치는 영향은 섬유소 분해효소를 처리한 경우 50, 60, 70 및 80°C에서 유효성분 추출양이 비슷함을 보였다. 이는 섬유소 분해효소를 첨가함으로 기존에 섬유소 분해효소를 처리하지 않은 경우의 100°C 고온에서 얻은 추출률과 50°C의 비교적 낮은 온도에서의 추출률이 비슷함을 알 수 있었다. 그리고 섬유소분해효소를 생산하는 균주 중 B. amyloliquefaciens DL-3가 헛개나무 열매의 유효성분 추출률이 가장 높게 나타나 최적의 균주로 선별했다. 그리고 유효성분 분리를 위한 헛개나무 열매의 최적의 농도는 40 g/L 로 나타났고, 반응시간은 기존의 24시간에서 6시간까지 단축할 수 있었다. 헛개나무 열매의 농도가 40 g/L 일 경우에 최적의 추출온도 및 시간은 50°C, 6h 으로 34.5 g/L의 최고 추출률을 보였다. 헛개나무 열매의 불용성 물질 제거를 위해 필터프레스와 연속원심분리기를 사용하였다. 불용성 물질을 제거한 수용성 물질을 먼저 UF system을 사용하여 300kDa 이하의 물질만 분획하였다. 그리고 두번째로 15kDa 이상의 물질은 제거하고 최종적으로 15kDa 이하의 물질만 분리, 정제하였다. 이렇게 분리된 물질을 고능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용해 분석하였으며, 암페롭신의 표준물질과 비교하여 본 연구를 통해 분리된 물질이 암페롭신임을 확인하였다. 즉, 헛개나무에서 유효성분을 추출하는 공정에 섬유소 분해효소를 첨가함으로서 추출 온도를 낮추고, 반응시간을 줄임으로 인해 유효성분의 열 손실을 줄이고 공정의 안전성을 높일 수 있으며 추출비용의 절감을 효과를 가져올 수 있다

알파사슬 글루타민 잔기의 치환이 섬유소원 기능 및 섬유소응괴 구조에 미치는 영향

서주영 순천향대학교 일반대학원 2013 국내박사

섬유소 응괴는 활성화된 혈액응고인자 XIII (FXIIIa)에 의해 섬유소 분자 간의 공유 결합(ε-lysyl-γ-glutamyl)이 형성되고 교차연결되어 견고해 진다. 이러한 교차연결이 알파사슬 간에 일어나면 알파중합체가 형성되고, 감마사슬 간에 일어나면 감마이합체가 형성된다. 섬유소의 교차결합은 각각 전자를 주고 받는 리신(lysine)과 글루타민(glutamine) 사이에 일어나며, 다수의 리신 잔기들과 두 개의 주된 글루타민 잔기인 AαQ328와 AαQ366 이 관여하는 것으로 알려져 왔다. 임상적으로는 2006년에 이상섬유소원 Seoul II (heterozygous variant AαQ328P)가 보고되어 AαQ328이 알파사슬의 교차연결에 중요한 잔기임을 뒷바침 하였다. 이상섬유소원 Seoul II는 알파사슬의 교차연결뿐만 아니라 섬유소의 중합반응에도 이상을 나타내었다. 본 연구에서 저자는 세 가지 재조합 섬유소원, AαQ328P, AαQ366P, AαQ328,366P을 Chinese hamster ovary (CHO) 세포주를 이용하여 발현, 합성, 정제하고 트롬빈에 의한 섬유소중합반응, 응고인자 XIIIa에 의한 알파사슬 교차연결반응, 섬유소 응괴의 전자현미경구조 등을 통하여 Aα328Q와 Aα366Q 잔기가 섬유소 중합 반응, 알파사슬 교차연결 및 섬유소 응괴의 구조 등에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 세가지 재조합 변이 섬유소원 모두에서 트롬빈에 의한 섬유소 중합반응에 장애를 보였고, 특히 이중 변이가 있는 섬유소원(AαQ328,366P)에서 제일 큰 장애를 관찰할 수 있었다. FXIIIa에 의한 섬유소 교차연결반응은 정상에 비해 세 가지 재조합 섬유소원에서 모두 지연되는 양상을 보였다. 이중변이의 섬유소원(AαQ328,366P)은 FXIIIa에 의한 섬유소 교차연결반응을 예상하지 않았지만 흥미롭게도 SDS-PAGE후 Coomassie brilliant blue염색에서 정상과 단변이의 섬유소원에 비해 지연되었지만 교차연결반응에 의해 형성된 알파중합체로 생각되는 밴드가 관찰되었다. 이 밴드들은 Western blot을 통해 섬유소의 알파중합체로 판명되었다. 결론적으로, 본 연구를 통해서 섬유소원 잔기 AαQ328과 AαQ366은 정상 섬유소 응괴 형성에 중요한 역할을 하고 이들 잔기가 없을 때에는 알파사슬의 다른 글루타민 잔기가 FXIIIa에 의한 섬유소 교차연결에 관여함을 알 수 있었다.

고온기 다산성 모돈 사료 내 섬유소 첨가 및 냉방시설이 모돈의 생산성과 스트레스 지표에 미치는 영향

오승민 강원대학교 대학원 2022 국내박사

본 연구는 고온기 다산성 모돈 사료 내 섬유소 첨가 및 냉방시설이 모돈의 생산성과 스트레스 지표에 미치는 영향을 조사하기 위해 실시하였다. 실험 1은 고온기에서 다산성 모돈(후보돈) 사료 내 섬유소를 수준별로 첨가하였을 때 모돈성적, 번식성적, 분특성, 태반 내 유전자 발현, 호흡수, 직장온도, 행동특성, 코티졸, 혈중 인슐린 및 글루코스에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 본 실험을 위해 초산돈(Landrace×Yorkshire) 30두를 공시하였으며, 섬유소 수준(3 vs. 4.5 vs. 6%)에 기반하여 처리구를 설정하였다. 개체간 변이를 줄이기 위해 개시체중에 기반하여 3처리 10반복, 반복당 1두씩 완전임의법에 따라 배치하였으며, 시험기간은 임신 90일령부터 포유기간(21일) 동안 진행하였다. 포유기간 동안 모돈의 사료섭취량, 분만시간 및 변비지수는 섬유소 수준이 증가할수록 개선되었으며(p<0.05), 자돈의 이유체중과 복당 이유체중은 섬유소 수준이 증가할수록 높게 나타났다(p<0.05). 태반 내 글루코스 수송체의 발현은 섬유소 수준이 증가할수록 높게 나타났으며, HSP70의 발현은 섬유소 수준이 증가할수록 낮게 나타났다(p<0.05). 모돈의 호흡수는 99일령부터 104일령까지 섬유소 6% 첨가구에서 가장 낮게 나타났지만(p<0.05), 직장온도는 처리구간 유의적인 차이가 나타나지 않았다(p>0.05). 행동특성에서 섬유소 수준이 높아질수록 눕기 행동 비중이 증가하고 서있기 행동 비중이 감소하였으며, 헛씹기 행동 빈도수가 감소하였다(p<0.05). 코티졸 수치는 섬유소 수준이 증가할수록 감소하였으며(p<0.05), 혈중 인슐린 수치는 사료 급여 90분 후 6% 첨가구에서 가장 높게 나타났고, 혈중 글루코스 수치는 사료 급여 후 60분에 섬유소 수준이 낮을수록 높게 나타났으며, 식후 180분에는 섬유소 수준이 증가할수록 높게 나타났다(p<0.05). 섬유소 수준이 증가할수록 분내 아세테이트와 총 단쇄지방산 수치는 증가하는 것으로 나타났다(p<0.05). 대사체 분석 결과 섬유소 수준별 처리구에서 중복 없이 군집이 형성되는 것으로 나타났다. 6% 처리구에서 분 내 25개 대사체의 변화가 확인되었다. 대사경로(metabolic pathway)에서 대사체 수준의 변화를 분석 결과로는 3%처리구와 비교하였을 6% 처리구에서 주로 pyruvate metabolism, citrate cycle metabolism, glyoxylate, dicarboxylate 및 thiamine metabolism의 영향을 받았으며, 4.5% 처리구와 비교하였을 때 pyruvate metabolism에서 변화가 나타났다. .이러한 결과를 토대로 고온기 임신말기 사료 내 섬유소 수준이 증가할수록 모돈의 생산성과 스트레스 지표를 개선시킬 수 있는 것으로 사료된다. 실험 2는 고온기 다산성 모돈 임신말기 사료 내 섬유소 종류(소맥피 vs. 팜박 vs. 비트펄프) 및 수준(4.5 vs. 6.0%)이 모돈성적, 번식성적, 분특성, 태반 내 유전자 발현, 호흡수, 직장온도, 행동특성, 코티졸, 혈중 인슐린 및 글루코스에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 본 실험을 위해 경산돈(Landrace×Yorkshire; 236.95±2.79kg) 60두를 공시하였으며, 섬유소의 종류(4.5 및 6%)와 수준(소맥피, 팜박 및 비트펄프)에 기반하여 6처리 10반복, 반복당 1두씩 완전임의배치법에 따라 배치하였다. 사양시험은 임신 90일령에 개시하여 분만 직전까지 시험사료를 급이하였으며, 포유기간(21일) 동안에는 일반사료를 급이하였다. 포유기간 동안 모돈의 사료섭취량, 분만시간 및 변비지수는 수용성 섬유소 수준이 높을수록 개선되었으며(p<0.05), 자돈의 이유체중과 복당 이유체중은 비트펄프 첨가구에서 가장 높게 나타났다(p<0.05). 호흡수는 100일과 102일령에 섬유소 6% 첨가구에서 낮게 나타났으며(p<0.05), 비트펄프 처리구에서 100일, 106일, 112일령에 유의적으로 낮게 나타났다(p<0.05). 행동특성에서 눕기 비중과 서있기 비중이 6%처리구와 비트펄프 처리구에서 개선되는 것으로 나타났으며(p<0.05), 헛씹기 빈도수가 비트펄프 처리구에서 가장 낮게 보고되었다(p<0.05). 분내 단쇄지방산은 비트펄프 처리구에서 아세트산의 수치가 증가하였으며(p<0.05), 코티졸 수치는 비트펄프 처리구에서 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 혈중 인슐린 수치는 사료 급여 후 90분과 120분에 6% 첨가구에서 높게 나타났고(p<0.05), 비트펄프 처리구에서 사료 급여 후 60분부터 계속 높은 것으로 나타났다(p<0.05). 혈중 글루코스 수치는 6% 처리구에서 사료 급여 후 60분에 가장 낮고, 식후 240분에 가장 높게 나타났으며(p<0.05), 비트펄프 처리구에서 사료 급여 후 60분부터 계속 가장 높게 유지되었다(p<0.05). 이러한 결과를 바탕으로 고온기 임신말기 사료 내 수용성 섬유소가 많은 비트펄프 첨가는 모돈의 스트레스 지표를 낮출 수 있는 것으로 판단되며 섬유소 첨가 수준에 따라 모돈의 생산성과 스트레스 지표의 개선효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 실험 3은 고온기 분만사 내 냉방시설의 종류가 모돈의 번식성적 및 스트레스 지표에 미치는 영향을 구명하기 위하여 실시되었다. 본 실험을 위해 경산돈(Landrace×Yorkshire; 242.84±2.89 kg) 40두를 공시하였으며 냉방시설에 기반하여 4처리 10반복, 반복당 1두씩 완전임의 배치하였다. 실험 처리구는 쿨링패드(CP; Cooling pad), 에어컨(AC, Air conditioner), 스나웃 쿨링(SC, Snout cooling) 및 안개분무(MS, Mist spray)로 구성되었으며, 포유기간(21일) 동안 진행되었다. 모돈의 성적에서 일일사료섭취량은 포유기간에서 CP 및 AC 처리구가 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 이유 시, 자돈의 체중은 AC 처리구가 유의적으로 가장 높게 나타났으며(p<0.05), SC 처리구가 유의적으로 가장 낮게 나타났다(p<0.05). 모돈의 코티졸 농도는 SC 및 MS 처리구가 CP 및 AC 처리구보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 자돈의 코티졸 농도는 MS 처리구가 유의적으로 가장 높게 나타났으며(p<0.05), CP 처리구가 유의적으로 가장 낮게 나타났다(p<0.05). 모돈의 호흡수 및 직장온도는 MS 처리구가 유의적으로 가장 높게 나타났으며(p<0.05), AC 처리구가 유의적으로 가장 낮게 나타났다(p<0.05). 결론적으로, 고온기에 쿨링패드 및 에어컨 냉방시설이 스나웃 쿨링 및 안개분무 냉방시설보다 모돈의 생산성을 개선시킬 수 있을 것으로 사료된다. The purpose of present study was to investigate the effects of dietary fiber and cooling systems on reproductive performance and stress status in sows in high ambient temperature. In experiment 1, a total of 30 primiparous sows (Landrace×Yorkshire; 191.66±1.17kg average initial body weight) were randomly allotted into 3 treatments, each with 10 replicates (1 sow per pen). Sows were divided into 3 levels of fiber (3, 4.5 and 6%). The feed intake of during lactation was increased in the sows fed HF(high fiber) compared with sows fed MF(middle fiber) and LF(low fiber). The HF sows had a lower farrowing duration and a higher constipation index compared with others sows (p<0.05). The HF sows had the highest piglet and litter weight at weaning (p<0.05). The hair cortisol accumulation was decreased in the HF treatment compared with the MF and LF (p<0.05). HF sows spent a higher proportion of time lying position, lower proprotion of time standing position and times of sham-chewing rather than other treatments. sows in the HF treatment showed the highest concentration of acetate and total SCFA. The HF diet increased the pyruvate, citrate cycle, glyoxylate, dicarboxylate, and thiamine metabolism compared with the MF. Plasma insulin levels of 90 min after meal at d 112 of gestation, the HF sows had markedly higher than LF (low fiber) sows. Moreover, plasma glucose concentrations were lower in HF than in LF sows 60 min after the meal delivery and higher at 180 min (p<0.05). The respiration rate between 98 and 104 was decreased in the sows fed HF compared with other treatments (p<0.05). In conclusion, dietary HF in late pregnancy affected reproductive performance and stress status in high ambient temperature. In Experiment 2, a total of 60 multiparous sows (Landrace×Yorkshire; 236.95±2.79kg average initial body weight) were randomly allotted into six treatments, each with 10 replicates (1 sow per pen). Sows were divided into 2 fiber levels (4.5 and 6% crude fiber) and 3 fiber sources including wheat bran (WB), palm kernel meal (PM), and beet pulp (BP). The feed intake of during lactation was increased in the sows fed BP compared with sows fed WB and PK (p<0.05). The BP sows had a lower farrowing duration and a higher constipation index compared with PK sows (p<0.05). The BP sows had the highest pilget and litter weight at weaning (p<0.05). The hair cortisol accumulation was not affected fiber level (p>0.05), fiber sources affected corticosterone level and decreased in the BP treatment compared with the PK and WB (p<0.05). A lower laying and sitting behavior proportion of time was observed in low fiber diets. However, the standing position was increased in low fiber diet (p<0.05). Sows in the BP treatment showed higher laying and sham chewing behavior a lower standing behavior rather than sows in the WB and PK treatments (p<0.05). Short chain fatty acids (SCFA) concentration in feces was not affected by fiber level (p>0.05), sows in the BP treatment showed the highest acetate and total SCFA concentration (p<0.05). Plasma insulin levels between 90 and 120 min after meal at d 112 of gestation, the HF (high fiber) sows had higher than LF (low fiber) sows. Moreover, between 60 and 240 min after insulin, the BP sows had markedly higher than other sows (p<0.05). Plasma glucose concentrations were lower in HF than in LF sows 60 min after the meal delivery and higher at 240 min (p<0.05). Additionally, plasma glucose concentrations between 60 and 240 min after meal at d 112 of gestation (p<0.05), the BP sows had higher plasma glucose levels than WB and PK treatments (p<0.05). The respiration rate of d 100, 106, 112 was increased in the sows fed BP compared with WB and PK (p<0.05). Also, The HF sows had higher respiration rate on d 100, 102 of gestation (p<0.05). The concentration of phthalic acid, succinic acid, phenylethylamine, hydrocinnamic acid, iron, linoleic acid, glycerol, ketone, and formamide were increased in the BP treatment compared with the WB. In Experiment 3, a total of 40 multiparous sows (Landrace×Yorkshire; 242.84±2.89kg) were allotted to 4 treatments, each with 10 replicates (1 sow per pen). The experimental treatments were CP (Cooling pad), AC (Air conditioner), SC(Snout cooling), and MS (Mist spray). We observed an increase in the average daily feed intake during lactation (p<0.05) in the CP and AC treatment groups. AC treatment had the highest (p<0.05) and SC treatment had the lowest (p<0.05) piglet weight at weaning. During lactation, sows administered SC and MS treatments had higher (p<0.05) hair cortisol accumulation, as compared with the AC and CP treatments. Hair cortisol accumulation in piglets during lactation was highest with MS treatment (p<0.05), and lowest after CP treatment (p<0.05). MS treatment had the highest (p<0.05), and AC treatment had the lowest (p<0.05) respiratory rate and rectal temperature during lactation. In conclusion, our results indicate that dietary fiber and cooling system on reproductive performance and stress status in sows in high ambient temperature increases the reproductive performance and decreased stress status of sows.

재조합 변이 섬유소원의 발현을 통한 생화학적 성상의 규명

송재우 연세대학교 대학원 2011 국내박사

섬유소원 D 부위(D region)의 γ-결절 (γ-nodule)은 칼슘 결합 부위, ‘A’마디(‘A’ knob) 결합 부위인 ‘a’ 구멍(‘a’ hole) 및 D-D 접촉면 등 섬유소 응괴 형성에 기능적으로 중요한 구조를 포함하고 있다. γAla341 은 ‘a’ hole에 위치하며, 돌연변이에 의해 아미노산이 치환된(γA341D, γA341V, γA341T) 이상섬유소원증 증례가 세가지 보고되었다. 연구자는 국내에서 보고된 γA341D과, 아직 생화학적 성상이 보고되지 않은 γA341V 재조합 변이섬유소원을 발현 및 정제하여 이상섬유소원증과 관련된 생화학적 성상을 규명하였다. 트롬빈에 의한 변이 섬유소원 FpA의 유리는 정상 섬유소원과 다르지 않았으나, FpB의 유리는 유의하게 감소되었으며, 특이상수는 γA341V이 1.7 ± 0.4 (mean ± SD, 106 M-1s-1), γA341D가 1.4 ± 0.3 (정상 섬유소원 3.6 ± 1.1, p < 0.01)이었다. 두 변이섬유소원의 섬유소 중합반응은 칼슘 농도에 의존적이었으며, 지연기(lag period)가 γ341V는 2500 ± 150 (mean ± SD, sec), γ341D는 1200 ± 40로 모두 정상(110 ± 40)에 비해 유의하게 길었고, Vmax는 γ341V가 15 ± 3 (mean ± SD, 10-5s-1), γ341D는 3 ± 1로 정상 섬유소원(81 ± 26)에 비해 유의하게 감소되어 있었다. 응고인자 13번에 의한 두 변이 섬유소 간 교차결합 역시 정상에 비해 유의하게 감소되어 있었다. 두 변이 섬유소원의 플라즈민 방어능 또한 칼슘과 GPRP 펩타이드 모두에 대해 현저하게 떨어져, 변이 섬유소원과 칼슘 및 ‘A’knob 간 결합에 결함을 확인하였다. 주사전자현미경 소견은, 정상 섬유에 비해 변이 섬유의 직경이 더 굵고 심하게 염전되었으며, 섬유간 공간이 크고 섬유망 구조 형성이 엉성하였다. 이상의 결과들은 γ341A가 칼슘 및 A-a 결합에 중요한 역할을 함을 증명한다. 따라서 두 변이 섬유소원의 아미노산 치환에 의한 단백 구조의 변화는 칼슘 및 A-a 결합 이상을 초래하고, 이로 인해 이상섬유소원을 유발할 것이다.

纖維素廢棄物을 利用한 Trichoderma harzianum FJ1의 纖維素分解酵素의 生産

유승수 전남대학교 대학원 2003 국내석사

섬유소 분해효소의 생산을 검토하기 위하여 썩은 나무로부터 분리한 Trichoderma harzianum FJ1을 이용하였다. T. harzianum FJ1은 CMCase, Xylanase, β-glucosidase, Avicelase와 같은 다양한 섬유소분해효소를 생산한다. T. harzianum FJ1은 섬유소분해효소를 생산하기 위하여 탄소원으로서 섬유소폐기물인 볏짚을 사용했을 때 톱밥과 펄프보다 높은 효소활성을 나타내었다. 이때 CMCase, Xylanase, β-glucosidase, Avicelase의 효소활성은 각각 2.95, 5.89, 0.45, 그리고 0.12U/ml이었다. 효소생산을 증가시키기 위하여 볏짚과 탄소원으로서 상업용 물질들을 혼합하여 연구를 수행하였다. 그 결과 볏짚과 Avicel을 50 : 50으로 혼합했을 때 CMCase, β-glucosidase, 그리고 Avicelase의 효소활성이 가장 높았고, 볏짚과 Avicel을 각각 71 : 29로 혼합했을 때 Xylanase는 가장 높은 효소활성을 나타내었다. Bacto peptone은 0.1%를 첨가했을 때 최적이었고, 이때의 CMCase, Xylanase, β-glucosidase, Avicelase의 효소활성은 각각 19.23, 27.18, 1.28, 0.53U/ml 이었다. 경제적인 섬유소분해효소를 생산하기 위해 섬유소 폐기물인 볏짚과 펄프를 혼합배양하여 CMCase, Xylanase, β-glucosidase, Avicelase의 활성을 각각 24.3, 38.7, 1.5, 0.6U/ml를 얻었다. 고체배양을 통한 효소생산은 섬유소 폐기물인 주정박과 볏짚, 콩비지를 1 : 1 : 1로 혼합하여 사용하였다. 기질초기 함수율 및, 최적 온도, pH, 접종물 농도를 각각 70%, 30℃, pH 5.0, 0.5ml/g로 배양하였을 때 가장 높은 효소활성을 나타내었다. 이때의 효소 활성은 15.22FPA(U/g-SDW)이었다. 기질높이에 따른 공기공급의 영향을 검토하기 위하여 공기공급이 가능한 고체배양기(30L)를 제작하였다. 배양결과 10mm의 기질높이에서 공기를 2liter/min로 공급했을 때 10.32FPA(U/g-SDW)의 효소활성을 얻었다. T. harzianum FJ1은 탄소원으로서 다양한 섬유소물질을 이용하여 높은 활성의 섬유소분해효소를 생산할 수 있었고, T. harzianum FJ1을 이용한 섬유소폐기물의 생물학적 당화기술에 크게 기여하리라 사료된다. A filamentous microorganism was isolated from completely rotten wood for the production of cellulolytic enzyme. The Trichoderma harzianum FJ1 producted a large amount of cellulolytic enzymes, such as CMCase, Xylanase, β-glucosidase, and Avicelase. For the production of the enzymes, when cellulolsic wastes were used as carbon sources of T. harzianum FJ1 rice straw showed higher enzyme activities than sawdust and pulp. The activities of CMCase, Xylanase, β-glucosidase, and Avicelase were 2.95, 5.89, 0.45, and 0.12U/ml in use of rice straw, respectively. To enhance production of the enzymes, the mixture substrate of rice straw and commercial cellulosic materials was investigated as carbon sources. The highest activities of CMCase, β-glucosidase, and Avicelase were found in the mixture of rice straw and avicel, particularly rice straw : avicel(50 : 50), and the highest Xylanase was obtained in the mixture ratio of 71 : 29. Bacto peptone addition of 0.1% showed enhanced production of the cellulolytic enzymes in which the activities of CMCase, Xylanase, β-glucosidase, and Avicelase were 19.23, 27.18, 1.28, and 0.53U/ml, respectively. To enhance production of the enzymes, the mixture substrate of rice straw and pulp was investigated. The activities of CMCase, Xylanase, β-glucosidase, and Avicelase were 24.3, 38.7, 1.5, and 0.6U/ml, respectively. The cellulase production using cellulolsic wastes in solid state fermentation(SSF) was investigated. The fermentation conditions, such as moisture content, initial pH, and composition of mixed substrate(wine waste, rice straw and soybean flow) on FPA(Filter paper activity) production were examined. The enzyme production was optimized in conditions of moisture content of 70%, pH 5.0, 30℃ and mixed substrate containing wine waste : rice straw : soybean flow of 1 : 1 : 1, respectively. The optimized condition showed 15.22FPA(U/g-SDW) in 5 day cultivation. The positive influence of air supply was unambiguously show as results increased cellulase productivity. The effect of bed depth on cellulase activities were investigated with defined moisture content of 70% in solid state fermenter. The bed depth and air amplitude were defined as 10mm and 2liter/min respectively. The enzyme production in solid state fermenter by T. harzianum FJ1 was 10.32FPA(U/g-SDW). Consequently, the filamentous microorganism, T. harzianum FJ1 utilized various cellulosic wastes as carbon sources and showed high cellulases productivity, suggesting that the T. harzianum FJ1 will be expected as a favorable candidate for biological saccharification of cellulosic wastes in further.

사료섭취량과 섬유소원이 육성돈의 외관상 회장 및 전장 소화율과 후장 소실율에 미치는 효과

하동욱 건국대학교 대학원 2022 국내석사

Two experiments were conducted to determine the effects of feed intake (FI) and fiber source on digestibility of energy and nutrients in growing pigs. In Exp. 1, twelve barrows with an initial body weight (BW) of 34.0 ± 2.6 kg were allotted to a replicated incomplete 6 × 4 Latin square design with 6 treatments and 4 periods. The 6 treatments were consisted of a 2 × 3 factorial treatment arrangement with 2 amounts of FI (9.0 and 4.5% × BW0.75) and 3 fiber sources. Three diets were 1) a corn-soybean meal-based basal diet (BD), 2) a diet replacing 30% of corn and soybean meal in BD with sugar beet pulp (SBP) as a source of soluble dietary fiber, and 3) a diet replacing 15% of corn and soybean meal in BD with corn cobs as a source of insoluble dietary fiber (IDF) to obtain a similar IDF concentration as in the SBP diet. Following a 6-d adaptation, feces were collected for 5 d. The apparent total tract digestibility (ATTD) of energy, dry matter (DM), organic matter (OM), neutral detergent fiber (NDF), and acid detergent fiber (ADF) in diets was greater (P < 0.05) for pigs fed at 4.5% of BW0.75 compared with those fed at 9.0% of BW0.75. The ATTD of energy, DM, OM, NDF, and ADF in SBP diet was greater (P < 0.01) than that in the corn cob diet. The ATTD of energy, DM, OM, crude protein (CP), NDF, and ADF was greater (P < 0.01) in SBP. However, there was no interaction between FI and fiber source on energy and nutrient digestibility. Low FI increased (P < 0.01) the digesta passage time. In Exp. 2, ten canulated barrows with initial BW of 38.3 ± 5.4 kg allotted to a replicated incomplete 5 × 4 Latin square design with 5 treatments and 4 periods. A BD and 4 treatments in a 2 × 2 factorial treatment arrangement with 2 amounts of FI (9.0 and 4.5% × BW0.75) and 2 fiber sources (SBP and corn cobs) were prepared. Each period consisted of a 7-d adaptation, a 2-d fecal collection, and a 2-d ileal collection. The apparent ileal digestibility (AID) of NDF in SBP diet was greater (P < 0.001) than that in corn cob diet whereas, the AID of energy, DM, OM, and CP in SBP diet was less (P < 0.001) than that in corn cob diet. Hindgut disappearance of energy, DM, OM, NDF, and ADF in SBP diet was greater (P < 0.05) than that in corn cob diet. Hindgut disappearance of energy, DM, OM, NDF, and ADF in SBP was greater (P < 0.05) that in corn cobs. Overall, the digestibility of energy and nutrients was different according to the feed intake level and fiber sources. Hindgut disappearance of energy and nutrients was greater in sugar beet pulp diet. However, the effect of feed intake level or the interaction between feed intake level and fiber source was not observed. 사료섭취량과 섬유소원이 육성돈의 외관상 소화율에 미치는 효과를 확인하기 위하여 총 2개의 실험을 수행하였다. 첫 번째 실험에서는 개시체중이 34.0±2.6 kg인 총 12마리의 거세수퇘지를 개체별로 대사틀에 사양하였으며, 6가지 처리 및 4기간의 6 × 4 불완전반복라틴방격법에 따라 실험구에 배치하였다. 6가지 처리는 2종류의 사료섭취량 (대사체중의 9.0% 및 4.5%)과 3가지 섬유소원으로 구성되었다. 3가지 실험사료는 옥수수-대두박 위주의 기초사료와, 사탕무우잔사가 수용성섬유소원으로써, 옥수수속대가 불용성 섬유소원으로써, 각각 30% 및 15%씩 기초사료를 대체하도록 배합하여, 비슷한 수준의 불용성섬유소를 함유하도록 배합하였다. 6일의 적응기간 후, 5일동안 분샘플을 채취하였다. 에너지, 건물, 유기물, 중성세제 불용성 섬유소, 및 산성세제 불용성 섬유소의 외관상 전장소화율은 대사체중의 9%만큼 사료를 먹은 돼지보다, 대사체중의 4.5%만큼의 사료를 먹은 돼지에서 더 높았다 (P < 0.05). 사탕무우잔사 실험사료의 에너지, 건물, 유기물, 중성세제 불용성 섬유소, 및 산성세제 불용성 섬유소의 외관상전장소화율은 옥수수속대 실험사료에서보다 더 높았다 (P < 0.001). 에너지, 건물, 유기물, 조단백질, 중성세제 불용성 섬유소, 및 산성세제 불용성 섬유소의 외관상 전장소화율은 사탕무우잔사 원료사료에서 더 높았다 (P < 0.001). 하지만, 사료섭취량과 섬유소원이 에너지 및 영양소 소화율에 미치는 상호작용은 없었다. 낮은 사료섭취량은 장내용물의 장 통과시간을 증가 (P < 0.001)시켰다. 실험 2에서는, 개시체중이 38.3±5.4 kg 인 10마리의 캐눌라가 장착된 거세수퇘지를 펜에서 사양하였으며, 5가지 처리 및 4기간의 5 × 4 반복불완전라틴방격법에 따라 실험구에 배치하였다. 5가지 처리는 기초사료와, 2종류의 사료섭취량 (대사체중의 9.0% 및 4.5%)과 2가지 섬유소원 (사탕무우잔사 및 옥수수속대)으로 구성된 2 × 2 요인배치법을 준비하였다. 3가지 실험사료는 옥수수-대두박 위주의 기초사료와, 사탕무우잔사가 수용성섬유소 원으로써, 옥수수속대가 불용성섬유소원으로써, 각각 30% 및 15%씩 기초사료를 대체하도록 배합하여, 비슷한 수준의 불용성섬유소를 함유하도록 배합하였다. 각 기간은 7일의 적응기간, 2일의 분 채취기간, 그리고 2일의 회장내용물 채취기간으로 구성되었다. 중성세제불용성섬유소의 외관상 회장소화율은 옥수수속대 실험사료에 비해, 사탕무우잔사 실험사료에서 더 높았지만 (P < 0.001), 에너지, 건물, 유기물 및 조단백질 외관상회장소화율은 사탕무우잔사 실험사료에서 더 낮았다 (P < 0.001). 에너지, 건물, 유기물, 중성세제불용성섬유소 및 산성세제불용성섬유소의 후장 소실율은 옥수수속대 실험사료에서보다 사탕무우잔사 실험사료에서 더 높았다 (P < 0.05). 에너지, 건물, 유기물, 중성세제불용성섬유소 및 산성세제불용성섬유소의 후장 소실율은 옥수수속대보다, 사탕무우잔사에서 더 높았다 (P < 0.05). 결론적으로, 에너지 및 영양소의 소화율은 사료섭취수준 및 섬유소원에 따라 달랐다. 에너지 및 영양소의 후장소실율은 사탕무우잔사의 실험사료에서 더 높았다. 하지만, 사료섭취수준의 효과나 사료섭취수준과 섬유소원 간의 상호작용은 발견되지 않았다.

혼합효소에 의한 섬유소-가수분해반응 속도론과 공기리프트 생물반응기에서 글루코소스의 생산

손민일 명지대학교 대학원 1997 국내박사

본 연구는 혼합효소(셀룰라아제/베타글루코시다아제)를 사용한 섬유소-가수 분해반응으로부터 글루코오스의 생성을 증대시키기 위하여 회분식 교반반응기에서 효소-기질반응의 최적조건(효소선택, pH, 활성혼합비, 혼합효소의 농도, 섬유소의 농도, 온도범위)을 결정하였다. 그리고 최적 반응조건하에서 섬유소-가수분해반응과 셀로바이오스-가수분해반응에 대한 실험과 반응 생성물의 억제실험을 통하여 혼합효소를 사용한 섬유소-가수분해반응의 메카니즘을 규명하고 속도론을 해석하였다. 또한 공기리프트 생물반응기(ALR)에서 효소-가수분해반응 실험을 수행하여 제시된 반응속도식의 적용성을 검토하였고 섬유소로부터 글루코오스를 생산하기 위한 모사실험을 통하여 반응기의 성능해석과 실제 공정에서의 응용에 대하여 해석하였다. 실험결과, Penicellium funiculosum으로부터 추출한 셀룰라아제와 Almond로부터 추출한 베타글루코시다아제를 혼합한 혼합효소를 사용한 섬유소-가수분해반응으로부터 글루코오스를 생성하기 위한 반응의 최적조건은 pH 4.2, 셀룰라아제와 베타글루코시다아제의 활성혼합비 10:4, 혼합효소의 농도 0.8 U/mL, 섬유소의 농도 40 g/L, 그리고 온도범위는 약 37±3 ℃이었다. 이때 반응의 최적조건에서 혼합효소를 사용한 경우에는 섬유소로부터 글루코오스의 생성이 단일효소에서보다 증가하였다. 그리고 섬유소의 가수분해반응은 반응 생성물인 셀로바이오스와 글루코오스에 의해 비경쟁 억제반응을, 그리고 셀로바이오스의 가수분해반응은 생성물인 글루코오스에 의해 경쟁 억제반응을 각각 나타내었으며 이때 제시된 섬유소-가수분해반응에 대한 속도식의 매개변수들을 산출하여 실험값을 모사한 결과, 효소의 비활성화를 고려한 경우에는 전 실험범위에서 실험값과 비교적 잘 일치하였다. 공업적으로 섬유소로부터 글루코오스를 대량으로 생산하기 위하여 ALR에서 섬유소-가수분해반응 실험을 수행한 결과, 약 24시간이내의 반응초기에서는 회분식 교반반응기에서와 거의 비슷한 반응속도를 나타내었으나 반응이 진행됨에 따라 베타글루코시다아제의 비활성화가 회분식 교반반응기에서보다 상당히 증가하여 글루코오스의 생성이 감소하였다. 또한 ALR에서 글루코오스를 연속적으로 제거하는 반회분식으로 조업할 경우에는 글루코오스의 생산이 회분식계의 경우보다 섬유소의 농도가 증가할수록 증대되어 본 실험범위에서는 약 20 %를 보다 많이 얻을 수 있었다. To Increase production of glucose from the cellulose-hydrolysis reaction with mixed enzymes(cellulase and β-glucosidase), optimum conditions(selections of enzymes, pH, activity ratio, concentration of mixed enzymes, concentration of cellulose, temperature range) were determined. From experiments for cellulose- and cellobiose-hydrolysis reactions and for product inhibitions on these reactions in the batch stirred reactor, reaction mechanisms were identified and kinetics were analyzed. Also, from experiments and simulations of reaction kinetics for cellulose-hydrolysis reactions in the airlift bioreactor(ALR), the applicability of proposed reaction kinetics, the reactor performance, and the application of operation method to real process were investigated to produce glucose from cellulose. Experimental results showed that optimum conditions of cellulose-hydrolysis reaction with mixed enzymes(mixed with the cellulase extracted from Penicellium funiculosum and the β-glucosidase extracted from Almond) were as follows: pH=4.2, activity ratio of cellulase to β-glucosidase=10:4, concentration of mixed enzymes=0.8 U/mL, concentration of cellulose=40 g/L, and temperature range=37±3℃. In these conditions, quantities of glucose productions by using mixed enzymes were larger than those by using single enzyme in optimum reaction conditions. From fitting the experimental data to theoretical reaction kinetic models, we found that the cellulose-hydrolysis reaction was noncompetitive inhibition by products of cellobiose and glucose, but the cellobiose-hydrolysis reaction was competitive inhibition by glucose, respectively. At the same time, simulation results showed that theoretical concentrations of products estimated from proposed reaction kinetics with enzyme deactivation by using parameters of reaction rates were well fitted with experimental values. To increase quantities of glucose production in the real industry, experiments for the cellulose-hydrolysis reaction was performed in the batch ALR. As a result, we found that for the case of short reaction times(<24 hours), reaction rates were nearly equal to those in the batch stirred reactor, but for the case of long times, the glucose production in ALR was smaller than that in the batch stirred reactor because of the higher deactivation of β-glucosidase. Furthermore, quantities of glucose productions from the sime-batch system operating continuous elimination of glucose in the ALR were increased with increasing cellulose concentrations and they were about 20 % larger than those from the batch system.

식이내탄수화물 종류와 섬유소 섭취시기를 달리하였을때 흰쥐의 체내대사에 미치는 영향

원은주 梨花女子大學校 大學院 1982 국내석사

Medpor^(®)에서 초기 혈관화 촉진을 위한 지방줄기세포의 효과와 섬유소의 적정농도

이슬기 고신대학교 대학원 2007 국내박사

연구배경 및 목적: 안와내 충전물로 사용되는 다공성 폴리에틸렌(Medpor^)에서 인체 지방줄기세포와 혈관전구세포의 혈관화 촉진 효과를 비교하여 보았으며 이미 혈관생성증가 효과가 밝혀진 섬유소를 농도를 달리하여 함께 처리하여 최적농도를 알아보고자 하였다. 연구대상 및 방법: Medpor^(®) 판에 지방줄기세포와 섬유소 (0.25%, 0.5%, 1. 25%) 및 혈관전구세포와 섬유소 (0.25%, 0.5%, 1.25%)를 혼합하여 처리한 후 20마리의 누드마우스 등에 무균적인 방법으로 삽입하였다. 삽입 후 10일째 마우스를 희생 후 Medor^(®) 판을 적출하여 두 군의 섬유혈관 형성정도를 혈색소, 콜라겐, Cellular DNA의 정량분석을 통해 비교하였다. 결과: 혈색소는 지방줄기세포와 섬유소를 혼합한 군에서 혈관전구세포군에 비하여 의미있는 증가소견을 보였으며 (p=0.026), 0.5% 섬유소와 지방줄기세포를 혼합한 군에서 가장 큰 증가 소견을 보였다 (p=0.0007). 콜라겐은 지방줄기세포와 혈관전구세포군 간에 유의한 차이가 없었고 (p=0.8016), 섬유소 농도별 비교에서는 0.25% 섬유소와 혈관전구세포를 혼합한 군에서 가장 큰 증가 소견을 보였다 (p=0.0048). Cellular DNA는 두군 간 유의한 차이를 보이지 않았고 (p=0.05463), 0.25% 섬유소와 혈관전구세포를 혼합한 군에서 가장 큰 증가 소견을 보였다 (p=0.0150). 결론: 지방줄기세포와 혈관전구세포는 Medpor^(®)에서 섬유혈관증식을 향상시킨다는 것을 확인할 수 있었고 0.25%~0.5%의 섬유소 농도 하에서 섬유혈관증식이 가장 많이 상승하였다. 향후 안와삽입물 수술시 지방줄기세포 및 혈관전구세포와 섬유소를 사용한다면 유착력 향상 및 합병증 감소에 도움이 될 것이다. Background: The effect of adipose stem cells (ASCs) was compared with endothelial progenitor cells (EPCs) on fibrovascular ingrowth into porous polyethylene orbital implant (Medpor). Differently concentrated fibrin was treated together to know the optimum concentration of fibrin on vascularization. Materials & Methods: ASCs, EPCs and fibrin(0.25%, 0.5%, 1.25%) mixture was treated on Medpor^(®) sheet, and implanted in back of twenty athymic nude mice. After 10 days, implants were removed and observed for fibrovascularization and stability. Hemoglobin, collagen and cellular DNA contents were measured for quantitative analysis. Results: Hemoglobin contents were significantly higher in the group treated with ASCs than EPCs(p=0.026). The group treated with 0.5% fibrin and ASCs showed highest hemoglobin contents(p=0.0007). Collagen contents had no significant difference between ASCs and EPCs groups(p=0.8016), and the group treated with 0.25% fibrin and EPCs showed highest collagen level(p=0.0048). Cellular DNA had no significant difference in both groups(p=0.5463). The group treated with 0.25% fibrin and EPCs showed highest level of cellular DNA contents(p=0.0150). Conclusion: ASCs, EPCs applied to Medpor^(®) improved fibrovascularization and implant stability. From 0.25% to 0.5% fibrin showed most abundant fibrovascularization. Using ASCs, EPCs and fibrin will facilitate vascularization in Medpor^(®), thus improve implant stability and reduce complications.

반추위로부터 분리된 혐기성 섬유소분해 박테리아의 혼합배양에 의한 발효특성에 관한 연구

이기영 韓京大學校 生物·情報通信專門大學院 2006 국내석사

반추위내에 서식하는 미생물 중 섬유소 분해력이 강한 혐기성 박테리아를 혐기적으로 순수 분리하여 분리된 미생물들을 동정하고 이들 미생물들을 in vitro 상에서 단독 또는 혼합 배양을 통해 기질 분해율과 효소 분비량에 대한 특성을 구명하고 미생물 성장률과 단백질 합성량에 미치는 영향을 구명하여 최종적으로 가장 우수한 미생물군을 선발하기 위한 것이 본 연구의 목적이다. 시험 1. 반추위로부터 혐기성 섬유소 분해 박테리아의 분리 및 동정 Roll tube법에 의해 Holstein 젖소의 반추위로부터 26균을 분리하여 colony 형태를 알아보기 위해 2% agar 함유된 DA medium 상에서 2~4일간 배양하였다. Colony의 크기는 지름 1~3mm 사이였으며 분리된 colony 중 H8, 13, 19, 20, 21, 24균들은 colony가 불규칙한 형태였고 나머지 균들은 원형의 형태 이었다. Colony로부터 순수분리하여 계대배양 한 후 filter paper를 탄수화물 공급원으로 하는 DA medium에 26균주를 24시간 배양한 결과 H8, 20, 23 및 25균들이 filter paper를 분해하였다. 섬유소 분해력이 확인된 H8, 20, 23, 25균들을 16s rDNA 분석을 통해 동정한 결과 H8, H20 과 H25균은 섬유소 분해균인 Ruminococcus flavefaciens으로 확인되었으며, H23균의 경우 Fibrobacter succinogenes로 동정 되었다. 비록 filter paper를 분해하지 못하였으나 starch, glucose 및 cellobiose를 탄수화물 공급원으로 한 DA medium에서 높은 활력을 보인 H7, 16 및 21균은 동정결과 Megasphaera elsdenii로 동정되었다. 시험 2. 선발된 혐기성 박테리아의 단독 배양이 filter paper의 분해율과 가스발생량 및 효소 분비 활력에 미치는 영향 Holstein 젖소의 반추위로부터 혐기성 섬유소 분해 박테리아들을 분리한 후 이들의 단독배양을 통해 기질분해율, 가스발생량 및 효소 분비 능력을 조사하였다. 공시균주는 H8(Ruminococcus flavefaciens), H20(R. flavefaciens), H23(Fibrobacter succinogenes), H25(R. flavefaciens) 및 RF(R. flavefaciens sijpesteijn, ATCC 19208) 5개의 균을 filter paper disk(Whatman No.1, Whatman, England)를 기질로 한 Dehority's artifical (DA) medium에서 0, 1, 2, 3, 4, 6 및 8일 동안 교반 없이 39℃ incubator에서 배양하였으며, 각 시간대 별로 시료채취 및 시험을 수행하였다. 건물 분해율 및 가스 발생량은 배양 초기에 H20균이 높았으며, 배양 후기에는 H25균이 높았다. 배양 8일째 가스발생량은 H20, H23, H25 및 RF균이 유의적 차이 없이 높았으나 H8균의 경우 가장 낮은 가스 발생량을 나타냈다. 누적가스 발생량의 경우 H20균이 전 배양기간 동안 높았으며, H25균의 경우 배양 4일과 6일에 높은 누적가스 발생량을 나타냈다. 가수분해효소 활력조사 결과 H20 및 H23균이 높은 효소활력을 나타내었다. 시험 3. 선발 혐기성 박테리아의 단독 배양이 볏짚의 분해율과 가스발생량 및 효소 활력에 미치는 영향 시험 3은 각 섬유소 분해균들을 순수 배양하여 그 발효특성을 조사한 것은 시험 2와 동일하지만 이들 균을 배양하는데 이용하는 기질을 볏짚으로 사용하였다는 것이 차이점이다. 시험결과 건물분해율의 경우 시험시 오차에 의한 변이가 많아 적절한 결과의 설명이 어려웠다. 가스발생량의 경우 배양 초기 H23균이 가장 높았으며, 배양 후기에 가서 RF균의 가스 발생량이 높게 나타났다. 누적가스 발생량은 배양 마지막인 8일을 제외하고 전 배양 기간동안 H23균이 가장 높은 가스 발생량을 나타냈다. 가수분해효소 활력 조사결과 기질에 차이가 있었으나 H20 및 H23의 효소 활력이 높게 나타났으며, 시험 2와 시험 3의 결과로 보아 filter paper와 볏짚을 기질로 이용했을 때 H20 및 H23균의 섬유소 분해 활력이 높은 것을 알 수 있었다. 시험 4. 선발 혐기성 박테리아의 혼합 배양이 filter paper의 건물 분해율, 가스발생량 및 효소활력에 미치는 영향 I 시험 2와 시험 3의 단독배양을 통해 효소 활력이 우수한 H20과 H23균을 선발하여 공시하였으며, 표준균주인 RF균과 Ruminococcus albus hungate(RA, ATCC27211)를 공시하였다. 4개의 균을 RA-RF-H20-H23, RF-H20-H23, RF-H20-RA, RF-H23-RA 및 RA-H20-H23의 5개 처리구로 혼합하여 DA medium에 탄소원으로 filter paper(Whatman No.1)를 기질로 한 배지에서 0, 1, 2, 3, 4, 6일 및 8일 동안 교반 없이 39℃ incubator에서 배양하였으며 각 시간대별로 시료채취 및 시험을 수행하였다. 시험결과 건물 분해율, 가스발생량 및 누적 가스발생량의 경우 배양 초기에는 RF-H20-H23 그룹이 높았으며 배양 후기에는 RA-RF-H20-H23과 RF-H23-RA 그룹이 높았다. 반면 RF-H20-RA 그룹의 경우 가장 상호억제효과가 있었다. 가수분해효소 활력조사 결과 RF-H20-H23과 RA-RF-H20-H23 그룹이 높은 효소활력을 나타내었다. 배양액 내 총 단백질 생성량은 배양 전 기간 동안 RA-H20-H23 그룹이 가장 높은 단백질 생산량을 나타냈으며 배양 후기에는 RA-RF-H20-H23 그룹이 RA-H20-H23 그룹과 유의적 차이 없이 높은 단백질 생산량을 나타내었다. 최종적으로 우수한 미생물 군은 기질 분해율, 가스발생량, 단백질 합성량 및 가수분해 효소의 활력이 가장 높게 나타난 RF-H20-H23을 선발 할 수 있었다. 시험 5. 선발 혐기성 박테리아의 혼합 배양이 filter paper의 건물 분해율, 가스발생량 및 효소 활력에 미치는 영향 II 시험 4에서 기질 분해율과 효소활력이 우수한 혼합군인 RF-H20-H23를 선발하여 혼합정도를 단순화 하면서도 더욱 효과적인 미생물 그룹을 찾고, 시험 4에서 RF균과 RA균의 antagonism이 있는 것으로 조사되어 이것을 확인하고자 RF-H20-H23, RF-H20, RF-H23, H20-H23 및 RA-RF의 5개 처리구로 혼합 조합하여 각각의 균들을 0, 1, 2, 3, 4, 6 및 8일 동안 교반 없이 39℃ incubator에서 배양하였으며 각 시간대 별로 시료채취 및 시험을 수행하였다. 시험결과 건물 분해율의 경우 배양 전 기간동안 RF-H20 높은 분해율을 나타냈으며, RF-H20-H23 및 H20-H23 그룹의 경우 유의적인 차이 없이 높은 건물 분해율을 나타내었다. 가스 발생량은 배양 2일째를 제외한 H20-H23균이 가장 높았으며, RF-H20-H23 와 RF-H20의 경우 배양초기에 높은 가스 발생량을 나타냈다. 반면 RA-RF의 경우 다른 그룹들과의 비교시 낮은 건물 분해율과 가스 발생량을 나타냈으며, 이것으로 보아 RA 와 RF간의 억제작용이 뚜렷함이 증명 되었다. 누적가스 발생량의 경우 전 배양기간 동안 RF-H20-H23 그룹이 높은 누적가스 발생량을 나타냈으며, RF-H20 그룹에서 배양 6일과 8일째를 제외한 배양기간 동안 높은 누적 가스발생량을 나타냈다. H20-H23 그룹은 초기 배양에서 높은 누적가스 발생량을 나타냈다. 가수분해효소 활력은 RF-H20-H23, RF-H20 및 H20-H23 그룹에서 높았으며, 배양액 내 총 단백질생성량은 배양 전 기간 동안 H20-H23 그룹이 가장 높았으며 배양 후기에는 RF-H20-H23 그룹이 RF-H20 그룹과 유의적인 차이 없었다. 시험 4에서와 같이 기질 분해율, 가스발생량, 단백질 합성량 및 가수분해 효소의 활력이 높게 나타난 RF-H20-H23을 선발 할 수 있었다. 시험 6. 섬유소 분해 박테리아 혼합균의 첨가에 의한 in vitro 혼합반추위 미생물의 볏짚 분해율 및 발효특성에 미치는 영향 시험 5에서 최종 선발된 RF-H20-H23 그룹을 이용하여 혼합 정도를 단순화 하면서 RF-H20-H23, RF-H20, H20-H23 및 H20의 4개 처리구로 혼합 조합하였으며 in vitro 상에서 반추위액에 첨가하여 0, 6, 12, 24, 48 및 72시간 동안 교반 없이 39℃ incubator에서 배양하였다. 각 시간대 별로 기질 분해율, 가스발생량, 가수분해 효소의 활력, 단백질 생산량, 배양액내 암모니아, pH 및 VFA 발생량을 조사하였으며 최종적으로 가장 우수한 군을 선발하였다. 건물분해율운 H20-H23 그룹이 전 배양 기간동안 가장 높았으며, 단독으로 반추위액에 접종한 H20균보다 혼합배양하여 접종한 RF-H20-H23, RF-H20 및 H20-H23 그룹의 건물분해율이 높게 나타났다. 가스 발생량 및 누적가스 발생량은 건물분해율과 같이 H20-H23 그룹에서 가장 많이 발생되었다. 가수분해효소 활력은 배양 초기에 control, RF-H20-H23, RF-H20, H20-H23 및 H20 그룹간 유의적인 차이는 없었으나 배양 후기에는 RF-H20, H20-H23 및 H20 그룹에서 높은 효소 활력을 나타냈다. 특히 xylanase 활력의 경우 H20-H23 그룹에서 가장 높은 효소 활력을 나타냈다. 배양액 내 총단백질 함량은 모든 처리에서 유의적인 차이는 없었으나 배양 72시간에서는 H20, H20-H23 및 RF-H20-H23 그룹에서 높은 단백질 생성량은 나타냈다. 배양액내 pH 변화는 배양 후기에 H20-H23 그룹이 다른 그룹에 비해 높았으나 유의적인 차이는 없었으며, ammonia-N 농도는 RF-H20, H20-H23 및 H20 그룹이 배양 6시간부터 24시간까지 높았다. 그러나 배양 48시간과 72시간 때에는 모든 그룹 간에 유의적인 차이가 없었다. 배양액내 acetic acid의 농도는 배양 초기에 H20 그룹에서 가장 높았으며, 배양시간이 증가하면서 모든 처리에서 증가하였다. Propionic acid 와 butyric acid는 H20-H23 그룹에서 높았으며, valeric acid의 생성량은 H20 그룹에서 높았다. 시험 7. 섬유소 분해 박테리아 혼합균의 첨가에 의한 in vitro 혼합반추위 미생물의 알팔파 분해율 및 발효특성에 미치는 영향 시험 7은 각 섬유소 분해균들을 순수배양하여 그 발효특성을 조사한 것은 시험 6과 동일하나 이들 균을 배양하는데 이용하는 기질을 알팔파를 사용하였다. 건물분해율은 배양 초기 H20 그룹이 가장 높았으며, 배양 12시간부터 72시간까지 H20 그룹을 제외한 모든 그룹의 건물 분해율은 유의적으로 차이가 없었다. 가스발생량의 경우 RF-H20 그룹이 전 배양 기간동안 가장 높은 가스발생량을 나타냈으며, 배양 72시간대 RF-H20 그룹을 접종한 처리구가 28.53 ml/0.1g 으로 가장 높은 가스 발생량을 나타냈다. 누적가스 발생량은 control과 RF-H20 그룹에서 높게 발생하였으며 H20-H23 그룹이 배양 24시간 때부터 배양 72시간까지 가장 낮았다. H20 그룹이 높은 효소활력을 나타냈으며, H20-H23 그룹의 경우 xylanase 활력에서 높은 효소활력을 나타냈다. 모든 처리구의 단백질 생성량을 측정한 결과 배양 12시간을 제외하고 유사한 경향이었다. pH는 배양 0시간부터 배양 12시간까지 모든 처리구에서 유의적으로 차이가 없었으나 배양 24시간부터 H20-H23 과 H20 그룹이 다른 그룹에 비해 pH가 높았다. Ammonia-N는 배양 6시간째 H20-H23 과 H20 그룹이 가장 높았으며, 배양 12시간부터 24시간에는 모든 그룹에서 유의적인 차이가 없었다. 배양 시간이 증가 할수록 acetic acid의 농도가 증가하여 모든 처리구에서 배양 72시간대에 가장 높았다. RF-H20 그룹이 50.01mM로 배양시간 중 가장 높은 acetic acid의 농도를 나타냈다. Propionic acid의 농도는 acetic acid와 같이 배양시간이 증가함에 따라 증가 하였으며, 배양 72시간대에 전체 그룹에 대해 유의적으로 차이가 없었다. Butyric acid의 생성은 acetic acid와 propionic acid의 농도와는 다르게 H20-H23 과 H20 그룹에서 가장 높은 농도를 나타냈다. Valeric acid는 배양 6일째 전체 그룹간 유의적인 차이가 없었으며, 배양 12시간부터 배양 마지막인 72시간까지 RF-H20-H23 과 RF-H20 그룹에서 가장 높았다. 따라서 시험 6과 시험 7의 결과에서 기질분해율과 효소활력이 높은 H20-H23 그룹의 혼합균이 미생물제제로서 이용 가능성이 높을 것으로 기대된다. This study was to isolate and identify anaerobic cellulolytic bacteria inhabiting from the rumen of Holstein cows, and then to select the most effective bacterial group on cellulose degradation. The isolated cellulolytic bacteria(Ruminococcus flavefaciens H8, H20, H25 and Fibrobacter succinogenes H23) were mono and co-cultured to assess the relative contributions of interactions between cellulolytic bacteria on filter paper, rice straw and alfalfa degradation. Experiment 1. Isolation and identification of anaerobic cellulolytic bacteria from the rumen Experiment 1 was carried out to isolate and identify cellulolytic bacteria from the rumen of Holstein cows. Twenty six bacteria were isolated from colonies grown in Dehority's artificial(DA) medium with 2% agar. The size of colonies was ranged between 1 to 3 mm diameters. The isolated bacteria were cultured in DA medium containing filter paper at 39℃ for 24h and H8, H20, H23 and H25 strains were higher in degradability of filter paper. The results of 16s rDNA gene sequencing of isolated bacteria of four strains showed H8, H20 and H25 strains identified as Ruminococcus flavefaciens and H23 strain as Fibrobacter succinogenes. Experiment 2. Effects of isolated anaerobic bacteria cultured with filter paper as a single carbon source on dry matter(DM) degradation, gas production and cellulolytic enzyme activities Experiment 2 was conducted to characterize the isolated anaerobic strains. H8(Ruminococcus flavefaciens), H20(Ruminococcus flavefaciens), H23(Fibrobacter succinogenes), H25(Ruminococcus flavefaciens) and RF(Ruminococcus flavefaciens sijpesteijn, ATCC 19208) were cultured in DA medium with filter paper (a single carbon source) for 0, 1, 2, 3, 4, 6 and 8 days without shaking at 39℃. Their DM degradability, gas production and enzyme activities were examined. Strain H25 degraded filter paper to 62% at 8 days after incubation, while the dry matter degradation rate of H8 was lower than the other strains. The cumulative gas production of isolated cellulolytic bacteria increased during the prolonged incubation time. In all incubation times, the cumulative gas production was highest in H20 strain. The CMCase and Avicelase activities in the culture supernatant for the H20 strain was significantly higher than for the H8, H23, H25 and RF in all incubation times. Experiment 3. Effects of isolated anaerobic bacteria cultured with rice straw on DM degradation, gas production and cellulolytic enzyme activities Experiment 3 was conducted to examine rice straw degradation by monoculture of the isolated bacteria (H8, H20, H23 and H25) and RF. The experimental design of Experiment 3 was same as that of Experiment 2 except the isolated bacteria was cultured in DA medium containing rice straw. In all incubation times, the cumulative gas production was highest in the culture of H23 strain. The CMCase and Avicelase activities in the culture supernatant for the H20 and H23 strains were significantly higher. Experiment 4. Effects of the co-culture of isolated anaerobic bacteria on filter paper DM degradation, gas production and cellulolytic enzyme activities I Experiment 4 was conducted to investigate the relative contributions of interactions between isolated cellulolytic bacteria. Considering the results of Experiment III, H20 and H23 strains were selected and type strains of RF and Ruminococcus albus(RA, ATCC27211) were used for comparison with the isolated strains. Bacteria were grouped with 5 co-cultures of RA-RF-H20-H23, RF-H20-H23, RF-H20-RA, RF-H23-RA and RA-H20-H23. Five groups were cultured in DA medium containing filter paper as a sole carbon source and incubated at 39℃ for 0, 1, 2, 3, 4, 6 and 8 days without shaking. In an early stage of incubation, DM degradation and gas production were higher in the RF-H20-H23 group and in late stages of incubation, they were higher in the RA-RF-H20-H23 and RF-H23-RA groups than the other groups. The co-culture with RF, H20 and RA showed an antagonistic effect for all parameters. Hydrolytic enzyme activities were higher in the RF-H20-H23 and RA-RF-H20-H23 groups. Experiment 5. Effects of the co-culture of isolated anaerobic bacteria on filter paper DM degradation, gas production and cellulolytic enzyme activities II From the results of Experiment 5, the RF-H20-H23 group was selected due to its higher DM degradability and enzyme activities. Experiment V was conducted to investigate an optimal co-culture group from those 3 strains. Bacterial groups were divided 5 groups with RF-H20-H23, FR-H20, RF-H23, H20-H23 and RA-RF. They were incubated at 39℃ for 0, 1, 2, 3, 4, 6 and 8 days without shaking. Throughout the incubation periods, The RF-H20 group showed the higher DM degradability than the other groups except the RF-H20-H23 and H20-H23 groups. Gas production was higher in the H20-H23 group than in the other groups except at 2 days after incubation. The RA-RF group was lower in DM degradability and gas production compared with the other treatments, indicating that both RA and RF strains inhibited their growth each other. Enzyme activities were higher in the RF-H20-H23, RF-H20 and H20-H23 groups than the other groups. Total protein content in the culture supernatant was higher in H20-H23. Experiment 6. Effects of mixed inoculation of isolated anaerobic bacteria to the in vitro culture of mixed rumen microorganisms on rice straw DM degradation and fermentation patterns Experiment 6 was conducted to examine effects of addition of cellulolytic strains (RF, H20 and H23) on rice straw degradability, enzyme activities and fermentation patterns of mixed rumen microorganisms. Five inoculation treatments were divided with a group without inoculation (control), RF-H20-H23, RF-H20, H20-H23 and H20 groups. Bacteria in each groups were inoculated into in vitro culture of rumen mixed microorganisms just before incubation. Incubation was carried out for 0, 6, 12, 24, 48 and 72h at 39℃. DM degradation was highest in the culture inoculated with H20 and H23 strains, while DM degradation was higher in the cultures inoculated with more than one strain(H20). Gas production was higher in the H20-H23 group. Xylanase activity was highest in the H20-H23 group. There was no difference between treatments for total protein content in the culture supernatant except that at the 72h of incubation the total protein content in the culture was higher in the H20, H20-H23 and RF-H20-H23 groups than the others. Although it was not significant, pH in the culture of mixed rumen microorganisms was higher in H20-H23 group at the late stages of incubation. Ammonia-N in the culture was higher in the RF-H20, H20-H23 and H20 groups at the 6 and 24h of incubation than in the other groups, while there was no significant difference between all treatments at 48 and 72h incubation times. In early incubation, acetic acid concentration was higher in the H20-inoculated culture than in the other cultures. Propionic and butyric acids concentrations were higher in the H20-H23 group and valeric acid concentration was higher in the H20 group compared with the other groups. Experiment 7. Effects of mixed inoculation of isolated anaerobic bacteria to the in vitro culture of mixed rumen microorganisms on alfalfa DM degradation and fermentation patterns Experiment 7 was same as Experiment 6, but alfalfa was used instead of rice straw for a single substrate. After start of incubation, DM degradation was higher in the H20 group, while from 12h to 72h incubation periods there were no significant differences between all treatments. Gas production was highest in the RF-H20 group during the whole incubation periods, especially at the 72h of incubation the gas production was highest(28.53 ml/0.1g). Xylanase activity was higher in the H20-H23 group compared with the other groups. During the incubation period ranged from 0 to 12h, pH was not different between all treatment, while the H20-H23 and H20 groups were higher in pH than the others beyond the 24h incubation. Ammonia-N content in the culture was higher in the H20-H23 and H20 groups at the 6h incubation. Acetic acid content was highest(50.01mM) in the RF-H20 group at the 72h incubation. Butyric acid content was higher in the H20-H23 and H20 groups, and valeric acid content was higher in the RF-H20-H23 and RF-H20 groups in the incubation periods from 12 to 72h. Therefore, the cellulolytic bacteria group containing H20 and H23 strains would be used as an most effective direct-fed microbial additive due to its higher DM degradability and enzyme activities.