만성 간질환 및 간경변증에 동반된 간세포암 환자에서 혈청 보체치 측정의 의의

신창록 漢陽大學校 1990 국내석사

유산균이 생산하는 보체계 활성화 물질의 특성

김장현 경기대학교 대학원 2000 국내석사

김치 및 발효유 제품으로부터 분리한 유산균과 공시 유산균주들을 대상으로 보체 용혈 분석법을 이용하여 면역계에서 중요한 역할을 담당하고 있는 보체계 활성화(항보체 활성, TCH_(50)) 정도를 검토하였다. 총 12종의 유산균의 세포질획분을 대상으로 활성을 측정한 결과 L. plantarum, L. delbrueckii KCTC 1047, L. plantarum KFRI 464, L. casei KCTC 3109 및 L. acidophillus IFO 3025의 유산균에서 대조구에 비해 70% 이상의 TCH_(50)의 감소를 일으키는 비교적 강력한 항보체 활성이 관찰되었으며 특히, L. delbrueckii KCTC 1047과 L. plantarum의 세포질획분은 타 유산균종에 비해 높은 활성을 나타내었다. 또한 이들 균주로부터 조제된 세포벽획분의 경우 세포질획분 보다도 높은 활성을 보였으며, 농도별로 세포벽획분을 조제하여 활성을 측정한 결과 농도 의존적으로 활성이 증가하였다. 또한 L. delbrueckii KCTC 1047과 L. plantarum의 세포질획분 중의 저분자와 고분자 물질을 나누어 활성을 비교한 결과로부터 고분자 물질이 항보체 활성을 나타냄을 알 수 있었다. L. plantarum의 세포질획분과 세포벽획분의 경우 pronase 소화 후에는 활성의 변화가 없는 반면 과요오드산 산화에 의해서는 급격한 활성의 감소를 나타냄으로써 L. plantarum에 의한 보체계 활성화는 단백질 부위가 아니라 다당 부위에 기인함을 알 수 있었다. L. plantarum의 세포질 및 세포벽획분을 Ca^(++) 이온을 제거한 상태에서 각각 정상인의 혈청과 반응시킨 후, anti-human C3 serum을 이용한 면역전기영동을 행한 결과 C3의 분해 산물을 관찰할 수 있었다. 또한 L. plantarum의 세포벽획분에 의한 항보체 활성은 Ca^(++) 이온 부재 조건에서 활성을 유지한 반면 세포질획분에 의한 활성화 정도는 동일 조건에서 상당히 감소하였다. 이상의 결과로부터 L. plantarum 세포벽획분의 보체계 활성화 양식은 주로 alternative pathway의 활성화에 의한 것이며, 세포질획분에 의한 활성화 양식은 classical pathway 뿐만 아니라 alternative pathway 양 경로를 경유함을 알 수 있었다. Several lactic acid bacteria isolated from kimchi and fermented dairy products were examined for their ability to activate the complement system by hemolytic complement assay(TCH_(50)). Among 12 kinds of the cytosol fractions from lactic acid bacteria, 5 kinds such as L. plantarum, L. delbrueckii KCTC 1047, L. plantarum KFRI 464, L. casei KCTC 3109 and L. acidophillus IFO 3025 showed relatively potent anti-complementary activity which decreased TCH_(50) more than 70% in comparison with control. Especially, the cytosol fractions from L. delbrueckii KCTC 1047 and L. plantarum showed higher activity than those of other bacterial strains. The anti-complementary activity of the cell wall fractions prepared from these species was more potent than that of the cytosol fractions and a dose dependant effect was gained, when the cell wall fractions were tested for the activity in various concentrations. From the results of activity comparison between low and high molecular weight (M.W.) substances, high M.W. substances in cytosol fractions were turned out to possess the activity. The activities by the cytosol and the cell wall fraction from L. plantarum were relatively resistant to digestion with pronase but sharply decreased by treatment of NaIO_4. These results may indicate that the complement activation by L. plantarum is due to polysaccharide moiety, not to protein moiety. When the immunoelectrophoresis using anti-human C3 serum was carried out after incubation of the normal human serum with the cytosol and the cell wall fraction of L. plantarum in Ca^(++) free condition, a cleavage of C3 precipitation line was observed. Also, the activity of the cell wall fraction was retained in the absence of the Ca^(++) ion, whereas that of the cytosol fraction was reduced considerably in the same condition. From these results, it is inferred that the mode of complement activation by the cell wall fraction from L. plantarum is mainly via the alternative pathway and that of the cytosol fraction is via the alternative pathyway as well as the classical pathway.

한국 야생 말굽버섯 자실체로부터 항보체 활성 다당체의 분리 및 화학적 특성

박정근 성균관대학교 일반대학원 2012 국내석사

최근 식품 및 약용으로 사용되는 버섯의 건강향진 효능에 관하여 일반인들의 관심이 높아지고 있으며, 이러한 흐름에 따라 건강식품으로 특히 천연물 소재를 이용한 식품에 많은 관심을 가지고 있다. 그 중, 과거 에너지원으로써의 기능만 부각되어 온 탄수화물, 그 중에서도 천연물 유래의 다당류에는 매우 우수한 면역 자극 활성이 있는 것으로 보고되고 있다. 6종의 식용 및 약용버섯 중에서 항보체 활성이 가장 우수한 말굽버섯을 선발하였으며, 말굽버섯에 존재하는 수용성 다당체의 새로운 이용방안을 모색하기 위해 말굽버섯으로부터 다당체를 분리하여 항보체 활성 및 cytokine 활성을 평가하고 화학적 분석을 수행하였다. 말굽버섯의 열수추출물에서 얻은 조다당 MFKF는 DEAE-Sepharose FF 및 Concanavalin A-Sepharose 4B를 이용한 두차례의 연속적인 chromatography를 수행하였다. DEAE-Sepharose FF에서는 3종류의 다당체(MFKF-NP, MFKF-AP1, MFKF-AP2)를 분리하였는데, 그중에서 MFKF-AP1이 50μg/mL농도에서 70%이상의 높은 항보체 활성을 보였다. 또한 Concanavalin A-Sepharose 4B에선 MFKF-AP1과 MFKF-AP2 다당체로부터 각각 MFKF-AP1-α,β와 MFKF-AP2-α,β 다당으로 분리하였는데, 그 중에서 MFKF-AP1-α와 MFKF-AP1-β가 각각 50μg/mL농도에서 70%이상의 항보체 활성을 타나내었다. 또한, MFKF-AP1-α와 MFKF-AP1-β는 macrophage를 자극하여 IL-6 및 IL-12의 생산을 유도하였으며, 항보체 활성은 MFKF-AP1-β가 MFKF-AP1-α보다 활성이 우수하였다. 한편, 항보체 활성이 우수한 MFKF-AP1-β를 anti-human C3를 이용한 면역 전기영동 실험과 Ca++이온이 제거된 상태에서의 항보체 활성 실험을 통해 MFKF-AP1-β는 고전경로(classical pathway)와 부경로(alternative pathway) 모두를 경유하여 활성을 나타내고 있음을 확인하였다. 또한, 항보체 활성이 가장 우수한 MFKF-AP1-β의 구성당 분석 및 분자량 측정한 결과 분자량이 약 10,000 이상의 다당체로 확인되었으며, 구성당 조성 결과는 xylose함유량이 99.07%로써 높은 비율로 함유하고 있으며 glucose (0.24%) 및 Arabinose (0.66%)를 미량 함유하고 있었다. 이상의 결과로부터 말굽버섯은 기존에 알려진 건강에 유익한 성분 이외에도 xylan 형태의 다당을 함유하고 있으며, 이 다당에 의해 인체 건강에 유익한 항보체 활성 및 면역증강 활성을 기대할 수 있음을 확인할 수 있었다. 최근 식품 및 약용으로 사용되는 버섯의 건강향진 효능에 관하여 일반인들의 관심이 높아지고 있으며, 이러한 흐름에 따라 건강식품으로 특히 천연물 소재를 이용한 식품에 많은 관심을 가지고 있다. 그 중, 과거 에너지원으로써의 기능만 부각되어 온 탄수화물, 그 중에서도 천연물 유래의 다당류에는 매우 우수한 면역 자극 활성이 있는 것으로 보고되고 있다. Recently, the concern of the people is enhanced about the health improvement effect of the mushroom used as the food and medicinal use. And it has the concern which is abundant in the food using particularly, the natural material according to this flow as the health food. In this middle, carbohydrate has the function of energy source and it has been stand out in the past only. And polysaccharides of the natural product derived from, it is reported that there is very excellent immuno-stimulatory activity. The Fomes fomentarius in which the anti-complementary activity is the most excellent was selected among the edibility of 6 kinds and medicinal mushroom. To examine the new utilization of Fomes fomentarius, the polysaccharides were isolated from Fomes fomentarius and their anti-complementary activities and chemical analysis were carried out. The hot-water extracted crude polysaccharide (MFKF) were purified by two subsequent column chromatographies using DEAE-Sepharose FF and Concanavalin A-Sepharose 4B. Crude polysaccharides (MFKF) were isolated into 1 neutral polysaccharide (MFKF-NP) and 2 acidic polysaccharides (MFKF-AP1, MFKF-AP2) by DEAE-Sepharose FF. MFKF-AP1 among them showed the excellent anti-complementary activity of ITCH50 % (inhibition of total complement hemolysis) value 70% at 50 μg/mL concentrations. MFKF-AP1, MFKF-AP2 polysaccharides were finally isolated into 4 acidic polysaccharides (MFKF-AP1-α,β and MFKF-AP2-α,β) by Concanavalin A-Sepharose 4B column chromatography for the further purification. MFKF-AP1-α and MFKF-AP1-β showed the excellent anti-complementary activity ITCH50 % value 70% at 50 μg/mL concentrations. Also, Peritoneal macrophages stimulated with MFKF-AP1-α and MFKF-AP1-β produced cytokines such as IL-6 and IL-12. Anti-complementary activity of MFKF-AP1-β was higher than that of MFKF-AP1-α. Results obtained by crossed immnoelectrophoresis using anti-human C3 and anti-complemetary activity in the absence of Ca++ ion suggested complement activation by MFKF-AP1-β from Fomes fomentarius occur via both alternative and classical pathways. Also, the result molecular wight measured the derived carbohydrate analysis of MKFK-AP1-β in which the anti-complementary activity is the most excellent and molecular weight as confirmed as the polysaccharide more than about 10,000. and xylose content contained with 99.07% with the high ratio and the trace amount the derived carbohydrate composition result contained the glucose (0.24%) and arabinose (0.66%). A contained the polysaccharides of the form of xylan form the result described in the above beside the ingredient which beneficial to the health known the exiting. And it could confirm to could expect the anti-complementary activity and immuno-stimulating activity which is beneficial to the health of body by this polysaccharides.

사람 보체 C5 의 MG4 도메인에 특이적인 항체에 의한 보체 C5 cleavage 및 활성화 억제

김효리 서울대학교 대학원 2013 국내박사

서론 보체계는 선천성 면역에서 중요한 역할을 하고 있다. 보체는 염증반응 매개물질을 활성화시키고, 아나필라톡신, 세포용해 물질, 항 미생물 물질을 생성한다. 그리고 이펙터세포를 모집해 반응을 유도한다. 보체계는 고전경로, 대체경로, 렉틴경로에 의하여 활성화되며, 다양한 종류의 조절단백질과 억제단백질에 의하여 엄격하게 조절되고 있다. 보체계 활성이 병의 발생과 연관되어있는 것으로 보고되고 있으며, 관련된 질환은 자가면역질환, 암, 신경퇴행성질환 등이 있다. 세 가지 보체 활성경로에 의하여 활성화되면 C5에서 경로가 수렴하게 되기 때문에, C5는 보체 활성을 억제하기 위한 좋은 타겟 이다. C5는 C5 전환효소에 의하여 C5a와 C5b 로 절단된다. 이 중 C5a는 강력한 화학주성인자로서 단핵구와 호중구를 모집해 염증반응을 유발한다. 그리고 C5b는 다른 보체단백질과 함께 막공격체를 형성하여 타겟세포를 용해한다. 현재까지 보체 활성을 억제하는 치료제는 에쿨리주맙이 유일하다. 에쿨리주맙은 단클론 인간화 항체로서 C5의 알파체인에 결합하여 C5의 절단을 억제한다. 에쿨리주맙에 의하여 C5 활성이 억제되어 발작성야간혈색소뇨증과 비전형적용혈성요독증후군 환자에서 치료효과가 입증되어있다. 방법 C5를 면역하여 항체라이브러리를 제작하였다. C5에 결합력을 가지는 항체클론을 선별하기 위하여 scFv 라이브러리는 파지에 디스플레이하고, 바이오패닝을 수행하였다. 선별된 scFv 클론의 6개 CDR을 사람 면역글로불린의 8개 FR 사이에 삽입하여 인간화과정을 수행하였다. 인간화 항체의 결합력을 향상시키기 위하여 CDR을 랜더마이즈한 라이브러리를 제작하여 바이오패닝을 재수행 하였다. 항 C5 항체의 항원결정부위를 규명하기 위하여 베타체인과 MG4 도메인의 재조합단백질을 발현, 정제하여 면역 블로팅을 수행하였다. 보체매개세포독성 시험과 C5a 효소면역측정법으로 항 C5 항체의 보체 활성 억제능을 확인하였다. 사이즈 배제 크로마토그래피를 수행하여 항체의 특성을 분석하고, 동물 종으로부터 획득한 혈청을 면역 블로팅하여 항체의 반응성을 확인하였다. 결과 항 C5 항체를 면역라이브러리로부터 선별하여, 성공적으로 인간화 하였다. 본 항체는 사람 C5뿐만 아니라, 원숭이, 랫드, 토끼의 C5에도 결합력을 보였고, C5 의 베타체인에 존재하는 MG4 도메인에 항원결정부위가 위치하였다. 이것은 사람 C5에만 결합하고, 항원결정부위가 알파체인에 존재하는 것으로 알려진 에쿨리주맙과 구별되는 중요한 차이점이다. 항 C5 항체는 C5가 C5a와 C5b 로 절단되는 것을 억제함으로써 보체매개세포독성과 C5a 형성을 억제하였다. 또한, 응집물이 거의 생성되지 않는 것으로 확인되었다. 결론 C5의 베타체인에 위치한 MG4 도메인에 결합하여 C5의 활성화를 억제하는 인간화 단클론 항체를 최초로 개발하였다. 본 항체는 항원결정부위와 다양한 동물종에 대한 반응성 측면에서 대조항체인 에쿨리주맙과 차별되는 특성을 보유하고 있다. 따라서 다양한 동물모델에서 본 항체의 효능평가가 가능할 것으로 예상된다. 보체 활성화에 의하여 발병하는 다양한 질환을 대상으로 하여 새로운 치료용 항체로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.

보체프로그램이 발달장애학생의 주의집중력에 미치는 영향

윤효준 한국체육대학교 2019 국내석사

이 연구는 보체프로그램이 발달장애학생의 주의집중력에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시하였다. 연구에 따른 구체적인 가설은 다음과 같다. 첫째, 12주간의 보체프로그램 참여가 발달장애 학생의 선택적 주의력에 영향을 미칠 것이다. 둘째, 12주간의 보체프로그램 참여가 발달장애 학생의 자기 통제력에 영향을 미칠 것이다. 셋째, 12주간의 보체프로그램 참여가 발달장애 학생의 지속적 주의력에 영향을 미칠 것이다. 연구의 가설을 입증하기 위하여 서울시 노원구에 위치한 A특수학교에 재학 중인 고등과정 발달장애학생 16명을 연구 참여자로 선정하고 실험집단 8명과 통제집단 8명으로 구성하였다. 연구기간은 2018년 8월 27일부터 2018년 11월 16일까지 12주 동안 주 2회, 40분씩 보체프로그램을 운영하였다. 보체프로그램은 전국 장애학생 체육대회의 보체 선수 지도 경험이 있으며, 현재 보체를 지도하는 특수체육 전공 교사의 감수를 받았다. FAIR 주의력 검사도구를 이용하여 선택적 주의력, 자기 통제력, 지속적 주의력을 측정하여 사전검사와 사후검사를 비교하였다. 측정된 자료의 유의성을 검증하기 위해 SPSS 23.0 Version 통계 프로그램을 사용하여 독립 t-test와 대응 t-test로 자료를 분석하였으며, 유의수준은 α=0.5로 설정하였다. 이 연구를 통해 얻은 결론은 다음과 같다. 첫째, 보체프로그램은 발달장애 학생의 선택적 주의력을 향상시켰으며, 통계적으로 유의미한 차이가 나타났다. 둘쩨, 보체프로그램은 발달장애 학생의 자기 통제력을 향상시켰으나, 통계적으로 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 셋째, 보체프로그램은 발달장애 학생의 지속적 주의력을 향상시켰으며, 통계적으로 유의미한 차이가 나타났다. 위와 같이 발달장애 학생에게 보체프로그램을 적용하였을 때 선택적 주의력과 지속적 주의력은 통계적으로 유의미한 차이가 나타났으나, 자기 통제력에서는 유의미한 차이가 나타나지 않았다. The purpose of this study was to investigate the effects of bocce program on the attention for students with developmental disabilities. For this purpose, the study set the following specific hypotheses: First, participation in a 12-week bocce program will have effects on the selective attention of students with developmental disabilities. Second, participation in a 12-week bocce program will have effects on the self-control of students with developmental disabilities. Third, participation in a 12-week bocce program will have effects on the sustained attention of students with developmental disabilities. In an effort to test these hypotheses, the investigator selected 16 participants among students with developmental disabilities that were taking a high school course at A Special School in Nowon-gu, Seoul and divided them into the experiment group of eight and control group of eight. A bocce program was carried out with a 40-minute session twice per week for 12 weeks on August 27~November 16, 2018. The bocce program was supervised by a teacher that specialized in special education, had an experience with instructing bocce players at a national athletics competition for students with disabilities, and was currently teaching bocce. Selective attention, self-control, and sustained attention was measured with the FAIR attention scale and compared between the pre- and post-test. Data was analyzed in an independent t-test and paired-sample t-test with the SPSS 23.0 statistical program to test the significance of measurement data with the significance level set at α=0.5. The findings led to the following conclusions: First, the bocce program improved the selective attention of students with developmental disabilities with statistically significant differences. Secondly, the bocce program improved the self-control of students with developmental disabilities with no statistically significant differences. Finally, the bocce program enhanced the sustained attention of students with developmental disabilities with statistically significant differences. These findings show that the application of a bocce program to students with developmental disabilities resulted in statistically significant differences in their selective and sustained attention and no such differences in their self-control.

인삼잎 유래의 보체계 활성화 다당의 정제 및 제반 특성

김선화 京畿大學校 大學院 2002 국내석사

인삼 재배농가에서 특별한 이용 방안의 모색 없이 대부분 폐기되고 있는 인삼잎은 대상으로 인체의 생체방어 기증 중 체액성 면역계에서 중요한 기능을 담당하고 있는 보체계(complement system)의 활성화능을 검토하였다. 인삼잎의 열수 추출물로부터 조제한 수용성 조다당 획분인 GS-1의 경우 1000㎍/㎖의 농도에서 80% 이상의 높은 보체계의 활성화능을 보였으며 활성은 GS-1의 농도에 의존적인 경향을 나타났다. 이 후 GS-1의 획분은 Cetavlon 처리에 의해 전기적 성질이 상이한 3개의 획분, GS-2, GS-3 및 GS-4로 분획 하였으며 이들 분획중 GS-4가 가장 높은 항보체 활성과 수율을 나타냈다. 한편 GS-4가 가지는 항보체 활성의 활성 본체를 규명하기 위해 protease 가수분해, periodate 산화, chlorite 및 polymyxin B 처리를 행하여 활성을 비교한 결과 GS-4의 항보체 활성은 protease, chlorite 및 polymyxin B 처리에 의해 큰 영향을 받지 않은 반면 periodate 산화에 의해서는 급격한 활성의 저하가 관찰되어 GS-4중 주로 다당 부위가 활성에 관여함을 알 수 있었다. GS-4는 DEAE-Sepharose FF(Cl^(-) form) 과 Biogel P-30, p-100으로 연속적인 정제를 실시한 결과 활성과 수율이 우수한 GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia 및 GS-4c-IIb의 정제다당을 얻을 수 있었다. 이들은 HPLC상에서 좌우대칭의 단일 peak 경향을 보였으며 분자량은 각각 14,400, 31,000, 71,000 및 81,000 Da 임을 확인할 수 있었다. 이들 고활성 획분(GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia 및 GS-4c-IIb)의 화학조성을 분석한 결과 중성당이 약 60%, 산성당 함량이 35%이고, protein을 검출되지 않았으며, 약간의 KDO (2.5∼5.4%)가 검출되었다. 구성당 분석의 결과 4개의 다당 모두 arabinose (13.6∼22.5)와 galactose(15.3∼34.8)가 높은 비율로 존재하였으며 소량의 rhamnose, fucose, xylose, mannose 및 glucose가 검출되었다. 이들의 보체계 활성화 양식의 경우 anti-human C_(3)를 이용한 2차적 전기영동 및 Ca^(++) 또는 Mg^(++)이온 존재하에서 ITCH_(50) 값을 비교한 결과 4개 정제다당들은 모두 classical pathway와 alternative pathway 두경로를 모두 활성화시킴을 알 수 있었다. The roots of Panax ginseng C.A. Meyer are a well known Chinese drug widely used clinically in oriental countries. The roots of P. ginseng are valuable because it takes 4∼6 years for their harvest, whereas the leaves can be harvested every year. If any materials from the leaves have a similar or new pharmacological activity as those from the roots, they will be available as well as the roots and their utility values as neutraceuticals will be enhanced. Therefore, in this study, the leaves of P. ginseng were examined for their abilities to activate the complement system which plays important roles in host defense system. A water soluble crude of polysaccharide fraction (GS-1) with anti-complementary activity has been isolated from the hot water extract of the leaves of P. ginseng C.A. Meyer. GS-1 showed relatively potent anti-complementary activity (ITCH_(50), more than 80% at 1000 ㎕/㎖) in a dose-dependent fashion. And then, GS-1 was fractionated by Cetavlon treatment to give the three fractions such as GS-2, GS-3 and GS-4. Of these fractions, GS-4 showed the highest anti-complementary activity and yield. In order to elucidate the real active moiety in GS-4, GS-4 was digested with protease and treated with periodate, chlorite and polymyxin B. The anti-complementary activity of GS-4 was not affected by protease, chlorite and polymyxin B treatment, however, markedly decreased by periodate oxidation. These results suggest that the complement activation by GS-4 is mainly due to polysaccharide moiety. The active fraction GS-4 was successively purified by open column chromatographies on DEAE-Sepharose FF (Cl^(-) form), Biogel P-30 and Biogel P-100 to give the four purified polysaccharides, GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4c-Ia and GS-4c-IIb which showed higher activities and yields. GS-4a-I, GS-4b-I, GS-4a-Ia and GS-4c-IIb were eluted as almost single HPLC peaks, and their molecular weights were estimated to be 14,400, 31,000, 71,000 and 81,000 Da, respectively. These active polysaccharides showed similar monosaccharide compositions, which contained significant portion of arabinose (13.6∼22.5%), galactose (15.3∼34.8%) and uronic acid (30.4∼39.2%) in addition to the small portion of rhamnose, fucose, xylose, mannose and glucose. Particularly the molar ratios of galactose and arabinose in the active polysaccharides were almost same (1.1∼1.8). When the cross-immunoelectrophoresis with anti-human C3 serum was carried out after incubation of normal human serum with the active polysaccharides in Ca^(++)-free condition, cleavages of C3 precipitation lines were observed. Also the anti-complementary activities of the active polysaccharides were considerably retained in the absence of Ca^(++)ion. These results suggest that the mode of complement activation by the four active polysaccharides from P. ginseng C.A. Meyer can be via the alternative pathway as well as the classical pathway.

미숙과실의 보체계 활성화능 검토 및 화학적 특성

姜庚? 경기대학교 1999 국내석사

사람 허피스 바이러스 8 감염세포에서 보체계의 상호작용에 관한 연구

전형택 을지대학교 대학원 2021 국내박사

카포시 육종 관련 허피스 바이러스(KSHV)는 면역 반응을 조절하여 바이러스가 숙주에서 지속적으로 감염되도록 하고 KSHV 관련 암의 발병을 촉진한다. 보체계는 병원균에 대한 방어에 중요한 역할을 한다. 따라서 KSHV는 KSHV 오픈 리딩 프레임 4에 의해 암호화 된 바이러스 단백질을 사용하여 보체 공격에 대한 회피 전략을 채택하였다. 그러나 이러한 방어 기전에도 불구하고 보체계는 KSHV에 감염된 세포와 카포시 육종 관련 종양 주변 지역에서 활성화되는 것으로 보인다. 보체계가 염증성 미세 환경뿐만 아니라 세포의 운명에 영향을 미칠 수 있다는 점을 감안할 때 보체 활성화는 KSHV 병인과 관련이 있을 가능성이 높다. 따라서 KSHV와 KSHV 감염된 혈관 내피 세포에서 추출한 세포 외 소포체(EVs)와 보체계 간의 상호 작용에 대한 더 나은 이해는 KSHV와 관련한 발병기전에 대한 새로운 연구방향 제시에 큰 도움이 될 것이라고 생각될 것이다. 이 연구 분야는 아직 예비 단계이며 진핵 세포에서 보체계 활성화를 측정하는 표준 방법은 아직까지 밝혀지지 않았다. 이 논문에서는 세포 표면에서 막 공격 복합체 인 C5b-9(Membrane attack complex. MAC)를 통하여 진핵 세포에서 보체계 활성화를 측정하는 정량적인 in vitro 방법을 제시한다. 그리고 사람 혈청을 활용한 보체 활성 시스템을 활용하여 PEL 세포주, KSHV 감염 혈관 내피 세포주 및 KSHV 감염된 혈관 내피 세포주에서 추출한 EVs를 처리한 혈관 내피 세포주에서의 보체 활성화와 그 기전을 조사하였다. 세포에 의해 방출되는 EVs는 세포 간 통신과 관련하여 다양한 과정을 조절한다. EVs는 그 구조와 기능을 볼 때 바이러스와 유사하다. 최근 연구에서 바이러스에 감염된 세포가 다양한 EVs를 방출한다는 여러 연구 결과가 나타나고 있다. 바이러스 감염 중에 방출되는 EVs의 기능과 기전을 설명하는 것은 바이러스 분야에서 분자생물학적 기초와 관련 병인을 이해하는 데 필수적일 것이다. 본 연구는 보체계와 KSHV 감염 세포 사이의 새로운 역할과 EVs에 의한 보체 활성화의 기본 기전을 확인하는데 중요한 기초가 될 것이라고 생각한다. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) modulates the immune response to allow the virus to establish persistent infection in the host and facilitate the development of KSHV-associated cancer. The complement system has a vital role in the defense against pathogens. Hence, KSHV has adopted an evasion strategy for complement attack using the viral protein encoded by KSHV open reading frame 4. However, despite this defense mechanism, the complement system appears to become activated in KSHV-infected cells as well as in the region surrounding Kaposi’s sarcoma tumors. Given that the complement system can affect cell fate as well as the inflammatory microenvironment, complement activation is likely associated with KSHV pathogenesis. A better understanding of the interplay between KSHV, KSHV infected cell derived extracellular vesicles(EVs) and the complement system may, therefore, translate into the development of novel interventions for KSHV-associated pathogenesis. This area of research is still preliminary and a standard method to measure complement system activation in eukaryotic cells has yet to be identified. In this thesis, I present a quantitative in vitro method to measure complement system activation in eukaryotic cells by detecting C5b-9, the membrane attack complex, on cell surfaces. And I investigated the activation of the complement system and those mechanisms of PEL cells, KSHV infected endothelial cells and EVs from KSHV infected endothelial cell treated endothelial cells using human serum complements system. Extracellular vesicles (EVs), released by cells, are associated with cell-to-cell communication and regulate various cellular processes. EVs draw parallels with viruses for their similar structures and functions. Increasing evidences from recent studies indicate that cells infected with viruses release a variety of EVs. Delineating the functions and mechanisms of EVs released during virus infection is essential for understanding the molecular basis of viral infection and replication as well as associated pathogenesis. My work identifies the novel roles between complement system and KSHV infected cells and the underlying mechanism of complement activation by EVs.

HMGB1이 보체의 고전 경로 활성화에 미치는 영향

이상은 연세대학교 대학원 2009 국내석사

Serum complement proteins play an important role in resistance to infection. Complement is strongly activated in sepsis, and the complement-activated products of anaphylatoxins have biological activities leading to inflammation and chemotaxis. High mobility group box 1 protein (HMGB1) is released and plays roles as a pro-inflammatory cytokine-like molecule in sepsis even though HMGB1 is a poor inducer of TNF-α production in vitro treatment. To investigate whether HMGB1 can induce complement activation, we have been investigated the relationship between HMGB1 and complement system in this study. First, we studied the involvement of HMGB1 in binding to C1q, an initiator of classical pathway of complement activation, using ELISA. The immobilized C1q bound to HMGB1 in a dose-dependent manner, and the reciprocal experiment of C1q binding to the immobilized HMGB1 showed the similar result. Surface plasmon resonance (SPR) assay showed the real time binding of HMGB1 to C1q and reciprocal binding. In addition, affinity purification using human sera also proved that HMGB1 binds to C1q. Next C4b and the membrane attack complex (MAC) deposition could be observed after the interaction of HMGB1 with C1q. The study for classical pathway of complement activation via interactions of HMGB1 and C1q will show the novel role of HMGB1 in the pathogenesis of sepsis. 보체의 작용은 미생물 감염에 대한 숙주의 저항성을 제공하는 중요한 선천성 면역 기전 중의 하나이다. 패혈증에서 보체는 과도하게 활성화된 형태로 나타난다. 이러한 보체의 활성에 의해 생산되는 C5a와 같은 anaphylatoxin는 강한 주화성을 나타내는 보체 단백질로서 면역 세포를 모집하고 자극하여 감염 부위의 염증 반응을 증가시키는 역할을 한다.High mobility group box 1 (HMGB1)은 미생물 감염에 의해 lipopolysaccharide (LPS)와 같은 자극이 왔을 때, 면역 세포가 능동적으로 분비하거나 세포 괴사가 일어나는 세포에 의해 수동적으로 분비되는 핵 단백질이다. 이는 세포 밖에서 사이토카인 (cytokine)과 같은 역할을 함으로써 질병에서 염증 반응을 증가시키는 매개체 역할을 한다. 이러한 HMGB1은 패혈증뿐 아니라 다양한 질병에서 혈청 내 높은 농도로 관찰된다.미생물 감염에 의한 질병에서 비정상적으로 활성화된 보체 단백질의 역할과 HMGB1의 작용은 각기 그 중요성과 이들을 통한 질병 치료를 위한 연구 들이 진행되었으나, 이들 둘 간의 상관 관계와 작용은 아직 연구된 바가 없다. 따라서 여기서 보체 단백질 C1q와 HMGB1의 결합 여부와 보체 활성화 실험을 통하여 그 여부를 알아보고자 하였다. 보체의 고전적 경로 (classical complement pathway)의 활성화를 이끄는 첫 분자인 C1q와 HMGB1과의 결합 여부는 효소면역항체법 (ELISA), 표면 플라즈몬 공명법 (BIACORE) 그리고 두 단백질 간의 affinity 결합을 통하여 확인하였다. C1q 또는 HMGB1을 부착한 후 각 상대되는 단백질을 농도 별로 반응시켰을 때, 이들 간의 결합이 농도 의존적으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한, 이들 간의 결합이 실질적으로 보체의 고전적 경로를 활성화시키고 있음을 보체 활성화 실험을 통해 표면에 보체의 C4b와 막공격복합체 (membrane attack complex, MAC)가 혈청 농도 별 반응에 따라 축적되는 양상을 통하여 알 수 있었다. 이로써 본 연구는 혈청 내 증가된 HMGB1이 C1q와의 결합이 보체의 고전적 경로의 활성화를 통해 질병에서 염증 반응을 증가시키는 매개 물질로서 작용할 수 있다는 가능성을 새롭게 제시하였다.

미세먼지 처리한 비강상피세포와 사람혈관내피세포에서 보체활성화의 효과

최명수 을지대학교 대학원 2022 국내박사

미세먼지가 인체에 노출되면 면역을 담당하는 세포가 이를 제거하여 인체를 방어하는 작용을 하는데, 이 과정에서 다양한 염증반응이 나타나 다양한 호흡기계, 심혈관계 질환 등이 유발 될 수 있다. 그러나 미세먼지가 다양한 조직에서 어떠한 기전을 통해 염증반응을 일으키는지에 대한 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 혈관내피세포는 혈액으로, 호흡기상피세포는 간질액에 둘러싸여 있어 혈청내 보체계와 상호작용을 할 수 있다. 보체계는 여러 오염물질이나 침입자에 반응하여 보체계를 활성화시켜 인체를 방어하는데, 저자가 알기에는 미세먼지에 노출되었을 때, 보체의 활성화에 관한 연구는 거의 전무한 실정이다. 미세먼지가 인간 호흡기상피세포나 인간 혈관내피세포에 노출되었을 때, 보체가 미세먼지에 의해 활성화된다면 숙주 세포에 손상을 가져다 줄 수도 있으며 다양한 염증반응을 일으킬 것으로 추정할 수 있다. 인간 호흡기상피세포와 혈관내피세포에 미세먼지에 어떠한 반응을 일으키는지 알아보고자 이 연구를 계획하였다. 미세먼지를 호흡기상피세포와 혈관내피세포에 처리하였을 때, 모두 alternative 경로를 통해 보체가 활성화 되었으며, 활성화 기전에는 활성산소발생이 주요하게 관여하는 것으로 나타났다. 특히, 혈관내피세포에서는 보체활성화 이후, 세포사멸은 관찰되지 않고, 오히려 혈관내피세포의 유의한 증식이 관찰되었으며, 보체 성분중 C3a가 유의하게 증가하여 세포내 STAT3 신호전달체계를 활성화시켜 혈관 염증관련 물질인 CRP와 RBP4를 생산을 유도하였다. 호흡기상피세포에서는 혈관내피세포와는 다르게 보체활성화 이후, 유의한 세포증식은 관찰되지 않았으며 호중구를 유인하는 C-X-C motif chemokine ligand 1 (CXCL1)분비가 감소하고 수지상세포와 T-림프구를 유인하는 CCL20 분비를 증가하였다.