B형 간염 바이러스 X 단백질에 의한 베타 및 감마 herpesvirus의 발암유전자 전사조절에 관한 연구 : Studies on the transcriptional regulation of promoters of beta-gammaherpesviral oncogenes by the hepatitis B viral X protein

아써바 서울대학교 대학원 2003 국내박사

개나리에서 분리한 오이 모자이크 바이러스의 동정

박선정 강원대학교 1999 국내석사

Development of bioinformatics methods for infectious diseases

배세은 서울대학교 대학원 2011 국내박사

한국에 발병하는 보리호위축바이러스(BaYMV)의 전체 염기배열 분석

최민경 全北大學校 大學院 2004 국내석사

이 연구는 우리나라 해남에서 발생한 보리호위축바이러스에 대한 기초 연구로서 바이러스를 순수분리하고 분자생물학적 방법으로 유전자구조 등을 분석, 비교한 결과 아래와 같다. 순화한 BaYMV-HN으로부터 RNA를 추출하여 전기영동 하여본 결과 RNA 1과 RNA 2로 분리되었으며 분자량은 각각 7.6 Kb 및 3.5 Kb였고, 외피단백질을 전기영동하여 본 결과 1개의 주 band와 몇 개의 minor band가 확인되었고, 분자량은 33 KDa이었다. 추출한 RNA를 주형으로 oligo-dT primer를 이용하여 cDNA를 합성 2 Kb 이상의 clone을 10개 얻었다. 이중 가장 큰 clone인 pByHN40 (3.8 Kb) 및 pByHN8 (3.2 Kb) 을 선별하여 subclone을 만들고 sequencing하였다. 선별된 clone으로 northern-hybridization을 시켜 보았더니 clone pBy40은 RNA 1과 pByHN8은 RNA 2와 반응하였다. pByHN40은 3'말단 poly (A) 를 제외한 3.800 bp, pByHN8은 3,200 bp의 염기 배열을 결정하였다. RNA1의 5'말단 쪽으로 나머지 3,400 bp부위의 염기배열 결정은 특이하게 제작된 ByHN-FR, ByHN-FF primer 및 expand long template PCR kit를 이용하여 PCR증폭 및 clone하였다. 그 결과 약 3.400 bp의 clone을 얻었으며 가장 큰 clone인 pByHNR17을 sequencing하여 3,400 bp의 염기서열을 결정하였다. RNA 1과 RNA 2의 5'말단 부위의 염기배열 결정은 RNA 1에 특이하게 제작된 ByHNR1-S1과 ByHNR1-A1 primer와 RNA 2에 특이하게 제작된 ByHNR2-S1과 ByHNR2-A1 primer 및 5'-full RACE core set를 이용해 PCR증폭하고 PCR산물을 정제한 후 direct로 sequencing하여 RNA 1의 5'말단 부위의 540 bp와 RNA 2의 5'말단 부위 320 bp의 염기배열을 결정하였다. RNA 1의 전체 염기배열을 결정한 다음 DNASIS 프로그램을 이용하여 컴퓨터 분석을 한 결과 1개의 ORF을 보여주었다. 5'말단 비번역 영역은 모두 171개의 염기였고, 5'말단의 AUG start codon 은 172 bp부위에 존재하였다. ORF 부분 polypeptide는 2411개 아미노산으로 이루어져 있었다. ORF안에는 모두 7개의 cleavage site를 갖는 6개의 protein으로 구성되어 있었다. 5'쪽에 있는 P3 protein은 328아미노산으로 이루어져있고, CI protein은 659아미노산으로 이루어져 있었으며, cleavage site인 Q/S가 Q/A로 대치되어 존재하였다. VPg protein은 187아미노산으로 이루어져 있었다. 또한 두개의 nuclear inclusion protein인 NIa 와 NIb는 합해서 752아미노산으로 이루어져 있었고 NIa-Pro의 cleavage site인 E/G가 E/A로 대치되어 존재하였다. 3'말단쪽에 존재하는 외피단백질의 아미노산 구성은 297아미노산으로 이루어져 있었고 cleavage site인 Q/S가 Q/A로 대치되어 존재하였다. CI 단백질의 659개 아미노산 중 phosphate-binding하는 것으로 생각되는 두개의 hydrophobic stretches인 GXXGXGKS 와 D (E/D) 가 487-494 및 583-584 아미노산 부위에 존재하였다. 또한 NIb 단백질의 528개 아미노산 중 바이러스 genome RNA의 RNA-dependent RNA polymerase부분으로 생각되는 SGXXXTXXXNT 및 GDD가 1923-1933 및 1966-1968 아미노산 부위에 존재하였다. 또한 bymovirus 및 사상형 바이러스의 외피 단백질에서 볼 수 있는 2개의 conserved block인 NGTS 및 AFDF가 BaYMV-HN 외피단백질인 2275-2278 위치와 2351-2354 위치에 존재하였다. BaYMV-HN RNA 1의 3'말단 비번역 영역은 모두 235개의 염기였으며, putative polyadenylation signal인 UAUGU가 7465-7469에 존재하였다. BaYMV-HN의 RNA 2는 3'말단 poly (A) 를 제외하고 3,582 염기로 구성되었다. 3'말단 방향으로 2,670개의 염기를 갖는 긴 ORF 구조를 보여주었다. Start codon인 AUG 코돈은 155-157 위치에 존재하였으며, UAG의 stop condon은 2,825-2,827 염기 사이에 있었다. ORF의 크기는 2,670염기였으며 890 putative polyprotein으로 구성되었고 분자량은 98458 dalton이었다. 3'말단 비번역 영역은 poly (A) 를 제외하고 758개의 염기였으며, putative polyadenylation signal인 UAUGU가 3471-3475에 존재하였다. 5'말단 비번역영역은 154개의 염기로 구성되었다. 아미노산 motif domain GYCY는 141-143 위치에 있었으며, putative cleavage G/S는 232-233위치에 존재하였다. BaYMV-HN의 RNA 2 polyprotein은 N말단 28 KDa 단백질과 C말단 70 KDa 단백질로 구성되어 있었다. 전체 3582 bp중에 A염기는 923개, C염기는 929개, G염기는 777, U염기는 953개였다. 그리고 RNA 1과 RNA 2의 염기 상동성은 45.7%였다. BaYMV-HN RNA 1과 RNA 2의 전체 염기서열과 아미노산을 BaMMV-J, BaMMV-G계통과 비교한 결과 BaYMV-HN RNA 1은 염기서열 수준에서 -J와 99.6%, -G와 93.6%의 유사성을, 아미노산 수준에서 -J와 99.4%, -G와 92.6%의 유사성을 보였다. 또한 RNA 2는 염기서열 수준에서 -J와 99.4%, -G와 90.4%의 유사성을, 아미노산 수준에서 -J와 97.1%, -G와 90.9%의 유사성을 보였다. RNA 1의 외피단백질 영역은 4개 계통 모두 891개의 염기서열과 297개의 아미노산으로 이루어졌는데, BaYMV-C, BaYMV-G, BaYMV-J, BaYMV-UK계통간의 유사성을 비교한 결과 아미노산 수준에서 BaYMV-HN은 -C와 98.9%, -J와 100%, -G와 96.9%, -UK와 97.2%의 유사성을 보였다. RNA 2의 P2 단백질에서는 염기서열 수준에서 BaYMV-HN이 -C와 95.6%, -G와 89.8%, -J와는 99.6%의 유사성을 보였다. 아미노산 수준에서 BaYMV-HN이 -C와 96.6%, -G와 95.2%, -J와는 99.5%의 유사성을 보였다. 병원성의 변이와 관계가 있을 것으로 생각되는 RNA 1의 외피단백질과 RNA 2의 P2단백질 부분을 기 보고된 계통과 유연관계를 비교 분석하였다. Genetyx UPGMA cluster 분석 프로그램으로 분석해본 결과 외피단백질 유연관계 분석에서는 -HN과 -J의 유사도가 가장 높은 것으로 나타났으며, -G와 -UK분리주가 같은 group으로 나타나 -C분리주를 포함하여 모두 3개의 group로 분류할 수 있었다. P2단백질의 유연관계 분석에서는 -HN과 -C의 유사도가 가장 높은 것으로 나타났으며, -J와 -G가 같은 group로 나타나 외피단백질 분석과는 다른 결과를 보여주었다. 또한 외피단백질 cluster 분석 결과, 유럽분리주와 아시아분리주가 서로 다른 group을 형성하는 것으로 나타났다. The complete sequence of RNA of an isolate of barley yellow mosaic virus (BaYMV-HN) from Haenam Province, Korea, was determined. BaYMV-HN was identified and its biological and serological properties, purification, and sequence analysis of RNAs were performed in this study. In agarose gel electrophoresis, RNA from the purified particles BaYMV-HN were separated into two bands of 7.6 Kb (RNA 1) and 3.5 Kb (RNA 2). In SDS-PAGE, the CP from the BaYMV-HN particles gave a major band of 33 KDa. Viral RNA was isolated and oligo (dT)-primed cDNA was synthesized. The cDNA was cloned into pBluescript Ⅱ (Stratagene), and large clones selected. The two selected cDNA clones pByHN40 (3.8 Kb) and pByHN8 (3.2 Kb) were selected for sequence analysis. Northern hybridization showed that a pByHN39 and pByHN40 reacted to RNA 1 and pByHN8 and pByHN52 to RNA 2. Subclones were made from them and sequenced. Clone pByHN40 gave the sequence of 3.800 nucleotides excluding the 3'-terminal poly (A) of RNA 1. Expand long template PCR was performed to produce 3,400 nucleotide of the 5'-terminal regions of RNA 1. The 5'-terminal region of RNA 1 was analysed by the RACE method and sequenced. Clone pByHN8 gave the sequence of 3,200 nucleotides excluding the 3'-terminal poly (A). The 5'-terminal portion of RNA 2 was cloned by the RACE method and sequenced. BaYMV RNA 1 consists of 7639 nucleotides excluding the 3' poly (A) tail. Computer analysis revealed a single long open reading frame (ORF) of 7233 nucleotides in one of the reading frames of the positive strand (virion polarity). The first AUG codon at nucleotide 172 in this frame appears to be the initiator for the long ORF. The predicted translation product of this ORF contains 2411 amino acids with a calculated 270 K protein. The 270 K protein encoded by RNA 1 is thought to be a polyprotein which contains the 38 K protein, the cytoplasmic inclusion protein (CI), the genome-linked protein (VPg), the two nuclear inclusion proteins (NIa and NIb) and the capsid protein. The two hydrophobic stretches GXXGXGKS and D(E/D) have been found in the CI proteins of BaYMV. The BaYMV 270 K protein contains triad of H, D/V and C/G residues at positions 1404, 1440 and 1507 in the region which is aligned with the BaYMV NIa proteinases. A possible cleavage site (Q/A) between the capsid and NIb protein was found at amino acid position 2114. The two characteristic stretches (N/S)GXXXTXXXN(T/L) and GDD are thought to form the core of RNA-dependent RNA polymerases, at positions 1923-1933 and 1966-1968. The capsid protein was comprised of 297 amino acids. The two conserved blocks NGTS and AFDF, which had been found in the capsid proteins of bymoviruses and other rod-shaped viruses, were also found in the capsid protein of BaYMV-HN at positions 2275-2278 and 2351-2354. The long ORF found in BaYMV RNA 1 is preceded by a 5' non-coding region (NCR) of 171 nucleotides and is followed by a 3' NCR of 235 nucleotides. As for several other plant viruses, the 5' leader sequence of BaYMV RNA 1 contains relatively few G residues. The RNA 2 of BaYMV-HN consisted of 3582 nucleotides excluding the 3'-terminal poly (A) and contained a large ORF starting with triplicated AUG codons at positions 155-157 and a UAG stop codon at position 2,825-2,827. This ORF encodes a putative polyprotein of 890 amino acids (98 KDa). The amino acid motif domain GYCY was located at 141 to 144 and a putative cleavage G/S site located 232-233. The polyprotein of BaYMV-HN RNA 2 was thought to consist of a N-terminal protein (P1 : 28 KDa) and a C-terminal protein (P2 : 73 KDa). The 3' NCR of BaYMV RNA 2 is 758 nucleotides long upstream of the poly(A) tail and is much longer than that of RNA 1 (235 nucleotides). It contained a putative polyadenylation signal UAUGU at position 3,471-3,475. The 5' NCR consisted of 154 nucleotides and is similar in size to that of RNA 1 (171 nucleotides). The whole 7,639 nucleotides of BaYMV-HN RNA 1 had 99.6% homology to BaYMV-J and 93.6% to BaYMV-G at the nucleotides level. The capsid protein of BaYMV-HN had 98.4 % homology to BaYMV-C, 100% to BaYMV-J, 96.5% to BaYMV-G and 95.8 % to BaYMV-UK at the nucleotides level. The NIb protein of BaYMV-HN had 98.2% homology to BaYMV-C, 98.6% to BaYMV-J, 98.6% to BaYMV-G at the amino acid level. The CI protein of BaYMV-HN had 97.1% homology to BaYMV-C, 100% to BaYMV-J, 94.5% to BaYMV-G at the nucleotides level. The whole 3,582 nucleotides of BaYMV-HN RNA 2 had 99.4% homology to BaYMV-J and 90.4% to BaYMV-G at the nucleotides level. The P1 protein of BaYMV-HN had 95.5% homology to BaYMV-C, 99.2% to BaYMV-J, 89.9% to BaYMV-G at the nucleotides level. The P2 protein of BaYMV-HN had 95.6% homology to BaYMV-C, 99.6% to BaYMV-J, 89.8% to BaYMV-G at the nucleotides level. The sequences resembled those of an isolate from Japan (99.6% identical nucleotides for RNA1: 99.4% for RNA2) more closely than one from Germany (93.6 and 90.4%, respectively). Molecular differences among strains were compared with sequence RNA regions coding for the CP (RNA1) and the N-terminus of the P2 protein (RNA2), as the BaYMV-HN is closely related to Japan isolates. The P2 fragment was more variable than the CP, and phylogenetic analysis of both regions showed that Asian and European isolates formed distinct clusters in CP gene analysis.

치쿤구냐 진단을 위한 신속 면역크로마토그라피법 개발 : Development of Rapid Lateral-flow Immunochromatographic Test for the Diagnosis of Chikungunya Virus Infection

조병기 아주대학교 대학원 2008 국내박사

연구배경 및 목적: 치쿤구냐 바이러스는 모기에 의해 전파되는 알파바이러스 로서 주로 아프리카, 인도, 동남아시아 및 유럽 남부 등에 분포한다. 치쿤구냐는 고 열, 극심한 관절통, 발진, 근육통, 두통, 구토 등의 임상적 증상을 보이는데 이는 뎅 기 바이러스 감염시의 임상증상과 유사하다. 치쿤구냐 바이러스 및 뎅기 바이러스 는 동일한 모기에 의해 사람에서 사람으로 전파되고 발병지역도 동일하여 감별진단 이 중요시되고 있다. 현재까지 치쿤구냐 바이러스 진단은 혈구응집억제반응, IgM 항체 검출을 위한 효소면역측정법, 분자진단학적인 방법, 바이러스 분리 등과 같은 실험실적인 진단방법에 의존하고 있다. 이들 검사 방법은 진단 정확성에도 불구하고 검사 시간이 길고, 비용이 많이 들며 숙련된 검사자와 검사 장비 등을 필요로 한다. 본 연구의 목적은 치쿤구냐 진단을 위해 현장검사용으로 유용한 신속 면역크로마토 그라피법을 확립하는 것이었다. 연구 방법: 세 종류의 주요 치쿤구냐 바이러스 구조적 단백질인 capsid, E1 및 E2 단백질을 배큘로바이러스 발현 시스템에서 발현하였다. 이 단백질들을 이용하여 치쿤구냐 바이러스에 대한 IgM 항체를 검출하는 신속 면역크로마토그라피법 및 간 접효소면역측정법을 확립하였다. 치쿤구냐 바이러스 IgM 항체에 대한 양성 및 음성 혈청, 뎅기바이러스 IgM 항체에 대한 양성 혈청 판넬을 이용하여 신속 면역크로마 토그라피법 및 간접효소면역측정법의 효능을 비교하였다. 연구 결과: E2 단백질을 이용한 간접효소면역측정법은 90.0%의 민감도, 100% 특이도, 100% 양성예측율 및 93.8%의 음성예측율을 나타내었다. E1 단백 질을 이용한 간접효소면역측정법은 77.5%의 민감도, 100% 특이도, 100% 양성예 측율 및 87.0%의 음성예측율을 나타내었고 capsid를 이용한 간접효소면역측율은 87.5%의 민감도, 100% 특이도, 100% 양성예측율 및 92.3%의 음성예측율을 나타 내었다. E2 단백질을 이용한 신속 면역크로마토그라피법은 92.5%의 민감도, 100% 특이도, 100% 양성예측율 및 95.2%의 음성예측율을 나타내었다. E1 단백질을 이 용한 신속 면역크로마토그라피법은 82.5%의 민감도, 100% 특이도, 100% 양성예 측율 및 89.6%의 음성예측율을 나타내었고 capsid를 이용한 신속 면역크로마토그 라피법은 87.5%의 민감도, 100% 특이도, 100% 양성예측율 및 92.3%의 음성예측 율을 나타내었다. 신속 면역크로마토그라피법 및 간접 효소면역측정법 모두 뎅기바이러스 IgM 양성 혈청 판넬과는 교차반응을 나타내지 않았다. 연구 결론: 신속 면역크로마토그라피법 및 간접 효소면역측정법은 사용된 항 원 종류에 관계없이 모두 100%의 특이도 및 양성예측율을 나타내었다. 캡시드 단 백질을 이용한 신속 면역크로마토그라피법 및 간접효소면역측정법은 동일한 진단 효능을 나타냈지만, E1 및 E2 단백질을 이용한 신속 면역크로마토그라피법은 E1 및 E2 단백질을 이용한 간접효소면역측정법보다 우수한 민감도 및 음성예측율은 나 타내었다. 세가지 종류의 단백질중 E2 당단백질이 E1 당단백질 및 캡시드 단백질보 다 우수한 면역 반응성을 보여주었다. 따라서, E2 단백질을 이용한 신속 면역크로마토그라피법은 치쿤구냐의 조기 진단 및 임상적으로 유사한 뎅기 바이러스 감염과의 감별 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것이다. Background/Aims: Chikungunya (CHIK) virus is a mosquito-transmitted Alphavirus belonging to family Togaviridae that causes a number of outbreaks in Africa, India, and Southeast Asia with high morbidity. The major clinical symptoms resulting from CHIK virus infection are high fever, arthralgia, myalgia, headache and rash, which are similarly manifested in dengue virus infection. Both CHIK virus and dengue virus are transmitted from human to human mainly by Aedes aegypti. Hence, the differentiation of CHIK virus infection from dengue virus infection is required. Presently, the diagnosis of CHIK virus infection is based on laboratory methods such as hemagglutination inhibition (HI) test, IgM capture ELISA, RT-PCR, and on rare occasions on virus isolation. These tests are all time-consuming, labor intensive, and costly, and require trained staffs and equipments regardless of their accuracy. The purpose of this study was to establish a lateral-flow immunochromatographic test (LF-ICT) ideal for applications as rapid point-of-care test for the diagnosis of acute CHIK virus infection. Methods: Three CHIK virus structural recombinant proteins, capsid protein and, E1 and E2 envelope glycoproteins, were produced in the baculovirus expression system. Using these recombinant proteins, indirect ELISA and LF-ICT were established for detection of IgM against CHIK virus capsid protein, E1 and E2, respectively. The performance of LF-ICT was then compared with that of indirect ELISA using CHIK virus IgM positive and negative serum samples as well as using dengue virus IgM positive serum samples. Results: The E2 ELISA showed 90.0% sensitivity, 100% specificity, 100% PPV (positive predictive value) and 93.8% NPV (negative predictive value). The E1 ELISA showed 77.5% sensitivity, 100% specificity, 100% PPV and 87.0% NPV and the capsid ELISA showed 87.5% sensitivity, 100% specificity, 100% PPV and 92.3% NPV. The E2 LF-ICT showed 92.5% sensitivity, 100% specificity, 100% PPV and 95.2% NPV. The E1 LF-ICT showed 82.5% sensitivity, 100% specificity, 100% PPV and 89.6% NPV, and the capsid LF-ICT showed 87.5% sensitivity, 100% specificity, 100% PPV and 92.3% NPV. Both LF-ICT and indirect ELISA showed no cross-reactivity with DENV IgM positive sera samples. Conclusions: Both LF-ICT and indirect ELISA showed 100% specificities and 100% PPV regardless of the applied antigens. Although the performance of capsid LF-ICT was same to that of capsid ELISA, the sensitivity as well as NPV of LF-ICT for detection of IgM against CHIK virus E1 or E2 was superior to that of indirect ELISA. Among the three proteins, E2 showed better performance of immuno-reactivity than E1 or capsid. Thus, the LF-ICT using E2 could be a useful tool for rapid, and differential diagnosis of acute CHIK virus infection from a clinically similar disease like dengue virus.

Nuclear Transport of Hepatitis B Virus Core Protein in Mediated by Importin a7

이지은 연세대학교 대학원 2007 국내석사

Hepatitis B virus (HBV) is a main cause of liver disease including liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Among Hepatitis B viral proteins, core protein, 21 kDa, is a major capsid protein. This protein has been found both in the nuclei and the cytoplasm of infected hepatocytes. Although a nuclear localization signal (NLS) has previously been identified in the core protein sequence, details of the mechanism by which it enters the nucleus remain to be clarified. A variety of viral proteins which are translocated into the nucleus have been identified and their import was facilitated by the interaction with importin α/β, nuclear transport receptor, via their NLS.Here, we investigated the nuclear localization of HBV core protein (HBc) by investigation of interaction between HBV core particles and various types of importin α family and importin β. We expressed 7 types of N-terminus flag-tagged importin, importin α1, importin α3, importin α4, importin α5, importin α6, importin α7, and importin β1 in Huh-7 hepatoma cell line. We show that HBV core protein mainly interacts with importin α7 using co-immnuprecipitation assay. This study suggests that the nuclear import of HBV core protein is mainly mediated by the importin α7 and importin α7 function as a mediator for the nuclear entry of HBV capsids.The specific interactions between core particles and importins are under investigation using various types of carboxy terminus deletion mutants of core protein. And also the functional study is under investigation using knock-down analysis usign siRNA for importin α7. B형 간염 바이러스는 3.2kb의 DNA 바이러스로써 간경화와 간암을 비롯한 사람의 간질환과 밀접한 관련을 가지는 바이러스로 알려져 있다. 이 바이러스의 단백질 중 특히 21 kDa의 Core 단백질은 바이러스의 Capsid를 구성하고 있는 주요한 단백질로써 감염된 숙주 세포 안에서 핵 내부와 세포질에 모두 존재하는 것으로 알려져 있다. Core 단백질의 DNA 서열 안에 두 개의 Nuclear localization signal (NLS) 을 가지고 있는 것이 앞선 연구에서 밝혀져 있음에도 불구하고 아직까지 이 단백질이 핵 안으로 들어가는 정확한 기작은 밝혀지지 않고 있다.핵 안으로 들어가는 단백질을 가지는 많은 다른 종류의 바이러스의 경우, 바이러스의 단백질의 핵산 서열 중에 Nuclear localization signal을 가지는 경우가 많으며 이러한 단백질들은 importin 이라고 알려져 있는 핵 내로의 단백질의 이동을 촉진시켜 주는 역할을 하는단백질에 의해서 핵 안으로 들어가는 것으로 알려져 있다.이러한 핵 내로의 이동은 Importin α와 importin β 이라는 단백질에 의해 촉진되게 된다. 일반적인 경우 importin α 가 단백질에 직접 결합하고 이 두 단백질의 결합을 importin β 가 인식하여 세 개의 단백질이 복합체를 이뤄 Nuclear pore complex (NPC)를 통과하여 핵 안으로 이,동 원하는 단백질을 핵 안으로 이동시킨 후 다시 세포질로 나가는 기작을 반복하는 것으로 알려져 있다.본 연구에서는 B형 간염 바이러스 Core 단백질의 핵 안으로의 이동에 있어서 이러한 importin과의 어떠한 상호 작용이 존재하는지의 여부를 다양한 종류의 importin α와 importin β 을 간암 세포주의 하나인 Hun-7 세포주에서 발현시켜 관찰하였다.Flag-tag을 단 7가지 종류의 importin 단백질 (importin α1, importin α3,importin α4, improtin α5, importin α6, importin α7, importin β1) 을 간암세포의 일종인 Huh-7 세포주에 발현시켜서 co-immunoprecipitation assay를 통해서 importin 과 core 단백질 사이의 결합을 알아보았으며 그 결과 core 단백질은 importin α7 과 결합을 하는 것으로 나타났다. 이러한 결합은 바이러스의 전체 DNA를 trnasfection 시킨 실험을 통해서도 동일한 결과가 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해 B형 간염 바이러스의 core 단백질의 핵 안으로의 이동은 importin에 의해서 촉진되며 특히 그 중에서도 importin 7에 의해 강하게 촉진되는 것으로 보여진다.단백질 사이의 특이적인 결합은 core deletion mutant를 이용한 co-immunoprecipitation을 통해서 연구 중에 있으며 SiRNA를 이용한 importin α7의 knock down assay를 통해서 importin 이 줄어드는 경우 바이러스 core 단백질의 핵 내로의 이동에 변화가 생기는지를 연구 중에 있다.

Coxsackievirus B3의 심장 병원성 결정인자와 장바이러스 단백질 분해효소의 특성 분석

정윤석 中央大學校 2002 국내박사

Coxsackievirus B3 (CVB3) infections can cause myocarditis in humans and are implicated in the pathogenesis of dilated cardiomyopathy. Little is known about the molecular characteris-tics of CVB3 that activate the cellular immunity responsible for cardiac inflammation. The 5`-nontranslated region (NTR) of enteroviruses contains an internal ribosome entry site (IRES) which facilitates translation initiation of the viral open reading frame in a 5`(m7GpppN) cap-independent manner, and provides cis-acting signals for positive-strand RNA replication. For several enteroviruses including CVB3, the 5`-NTR has been shown to determine the virulence of phenotypes. Particularly, the cardiovirulence of CVB3 has been known to be greatly influenced by the secondary structure of the 5`-NTR. The nucleotide sequences and secondary structures of 5`NTR of 14 isolates from aseptic meningitis patients with no evidence of cardiac involve- ment have been compared to one isolate from patient with symptoms of cardiac involvement and the reference Nancy strain (ATCC-VR 30). The nucleotide sequence homologies of 5`-NTR of intra-isolates (14 Korean isolates) were 97.7-99.7% regardless of the years of isolation. On the other hand, homologies between 14 isolates and the Nancy strain were 84.0-84.7%. In addition, the nucleotide sequence of 5`-NTR of one isolate from the patient with acute myocarditis showed a high degree of homology(96.7%) with the reference Nancy strain with cardiovirulence. The 5`-NTR of all isolates and the reference Nancy strain has retained similar primary clover-leaf (CL) structures. Taken together, these results indicate that the secondary structure of 5`-NTR of CVB3 is closely related to cardiovirulence in a murine model for acute myocarditis. Genetic determinants of cardiovirulence for CVB3 have not been identified, although cardiovirulence determinants have been identified in the 5` nontranslated region (5`NTR) and capsid using CVB3 strains engineered in the laboratory. The 5`NTRs of the non-cardiovirulent CVB3 Korean isolates and the cardiovirulent Nancy strain were examined to determine their influence on the cardiovirulence phenotype. In order to identify cardiovirulence determinants of CVB3, infectious cDNA clones of CVB3K and Nancy strain were constructed using a mammalian expression vector pcDNA 3.1 (-). The recombinant constructs consisted of cDNA stably inserted into the pcDNA3.1 (-) vector under the control of cytomegalovirus (CMV) immediate early transcriptional element. Intratypic chimeric virus was constructed in which 5`NTR sequences of the infectious cDNA copy of the cardiovirulent Nancy strain were replaced by homologous sequences of the CVB3 Korean isolate with no evidence of cardiac involvement. This chimeric virus (Chi-CVB3) was trans-fected into Cos7 and hCAR (Human coxsackievirus and adeno-virus receptor expressing cell) by the lipofectamine reagent and the infectious progeny virus was harvested. The potential of chimeric virus to cause myocarditis was determined using an established murine model of inflammatory heart disease. Cardio-virulence of chimeric virus was tested by inoculating into the peritoneal cavity of Balb/c mice. Heart tissues obtained at 7 days postinoculation were examined for evidence of myocarditis by light microscopy and enterovirus-specific PCR assayed for the presence of virus. These results indicate that the 5`NTR plays an important role in determining cardiovirulence of CVB3. Enteroviral proteases, 2Apro and 3Cpro cleave host cellular proteins that require cap-dependent translation. This process is accompanied by the cleavage of the translation initiation factor eIF4G, a component of the cap-binding complex eIF4. This cleavage is mediated by the viral proteases, 2Apro and 3Cpro. In this experiment, enteroviral proteases 2Apro and 3Cpro were cloned and expressed by using E. coli expression system. The viral cDNA fragment containing the protease-coding region was cloned into the pET29 (a) vector and expressed in the E. coli strain, BL21 (DE3). The viral proteases expressed in this study will be useful for the development of in vitro protease inhibitor assay system. Coxsackievirus B3(CVB3)는 심근염 및 확장형 심근증을 유발하는 주요 병원체로 알려져 있으나 그 발병기작 및 심장 병원성의 차이를 나타내는 이유에 대해서는 정확하게 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 국내에서 분리된 CVB3의 심장 병원성을 확인하고 CVB3의 심장 병원성 결정인자에 대한 정확한 분석을 하고자 하였으며, 장바이러스의 중요한 기능성 단백질인 단백질 분해효소의 특성을 확인하여 단백질 분해효소의 억제제 탐색을 위한 체계 확립을 위한 기초자료를 제공하고자 하였다. 본 연구에서는 심근염으로 의심되는 환자로부터 CVB3를 분리하였으며, 심장 병원성을 가지고 있는 CVB3 Nancy 주와 96.7%의 상동성을 나타내었고 다른 연구자들에 의해서 보고된 임상 분리주와는 93%에서 97%의 염기서열 상동성을 확인하였다. 최근까지 국내에서 분리된 CVB3는 생쥐에서 심장 병원성을 유발하지 않는 것으로 확인되었다. 또한 국내 분리 CVB3와 원형주인 Nancy 주간의 전체 염기서열을 확인한 결과 전체 게놈간에는 약 81%정도의 상동성을 확인하였으며, 전체 게놈의 영역별로는 P1영역은 84.7%, 비구조단백질을 구성하는 P2 영역은 80.3%, P3영역은 96.6%의 상동성을 확인하였다. 또한 CVB3의 심장 병원성에서 매우 중요한 부분으로 보고되고 있는 5`NTR의 국내 분리주와 Nancy주간의 염기서열을 확인하기 위해서 전체 5`NTR을 sequencing한 결과 무균성 수막염 환자로부터 분리된 바이러스들 사이에서는 98~99%의 상동성을 관찰하였으나 Nancy 주와는 약 85%의 상동성을 나타내었다. 또한 각 염기서열분석결과를 바탕으로 phylogenetic tree를 제작한 결과 심장 병원성을 확인한 CVB3 Nancy주와 국내 분리 CVB3들은 매우 차이가 있음을 확인하였다. 이러한 차이를 구조적으로 확인하기 위해서 Mfold 프로그램을 이용하여 RNA 2차원적 구조를 확인한 결과 5`말단에 존재하고 있는 clover-leaf(CL) 구조와 IRES에 포함되어 있는 450번부터 650번까지의 구조는 국내 분리 CVB3(99392)와 Nancy주에서 모두 동일한 구조를 나타내었다. 상대적으로 CL 구조와 SLIV, SL V 보다 SL II와 SL III의 염기서열에서 두 바이러스간 차이를 확인할 수 있었고 특히 SL II에서 가장 많은 차이를 보였다. gene quest 프로그램을 이용하여 두 구조의 차이를 조사한 결과 SLII 부분은 염기서열에서와 같이 서로 상이한 구조를 가지며 SL III의 경우는 SL II 보다는 적은 염기서열의 차이를 나타낸 만큼 그 구조가 서로 비슷한 것을 확인할 수 있었다. 심장 병원성 결정인자의 정확한 분석을 위해서 본 연구에서는 4가지의 감염성 cDNA를 제조하였다. 각각을 감수성 있는 세포에 transfection하여 감염성을 확인하였다. 병원성 결정인자 분석을 위해서 국내 분리 CVB3의 5`NTR을 심장 병원성을 나타내는 Nancy주의 전체 게놈을 포함하는 감염성 cDNA와 치환하여 chimeric 바이러스를 제조하였다. 본 chimeric 바이러스는 생쥐 내에서 심장 병원성을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 그러므로 본 연구에서 주목하여 분석한 5`NTR은 심장 병원성을 결정하는 가장 중요한 부분임을 확인하였다. 장바이러스의 단백질 분해효소를 클로닝하여 염기서열을 분석하였으며 원핵세포 발현체계를 이용하여 발현시켰다. 2Apro 와 3Cpro 단백질 분해효소는 다른 장바이러스 2Apro, 3Cpro의 염기서열 상으로 82%와 85%의 상동성을 나타내었으며, 염기서열로서 유추된 아미노산 서열에서는 94%, 98%의 상동성을 확인하였다. 단백질 분해효소의 활성부위로 알려진 2Apro의 106 번째 Cys과 18 번째 His, 35 번째 Asp는 아무런 변이 없이 존재함을 알 수 있었다. 또한 3Cpro 역시 효소활성 부위로 알려진 147 번째 Cys와 효소활성에 중요한 것 으로 알려진 40 번째 His과 71번째의 Glu 모두가 아무런 변이가 없는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 얻어진 단백질 분해효소는 장바이러스의 복제 및 증식을 억제하는 물질을 검색하는 검색 체계를 확립하는데 있어서 매우 중요한 기초자료로써 이용될 수 있을 것이다.

Association of Hepatitis B Virus Polymerase with Promyelocytic Leukemia Nuclear Bodies Mediated by the S100 Family Protein p11 : S100A10 단백질에 의한 B형간염바이러스 중합효소의 전골수성백혈병핵체 결합에 관한 연구

최주현 高麗大學校 大學院 2002 국내박사

간염 B 바이러스의 polymerase (HBV pol)는 이 바이러스의 초기 생명 순환 단계에 매우 중요한 역할을 한다. 인간(HBV pol)과 오리(DHBV pol)의 polymerase를 단백질 효모 발현 방법을 통하여 발현 하였다. 발현된 DHBV pol은 DNA 의존 DNA 합성, RNA 의존 DNA 합성, 그리고 RNassH 활성을 보였고, 발현된 HBV pol은 DNA 의존 DNA 합성 활성만을 보였다. 이 바이러스 polymerase 활성 측정 방법은 최초로 효모를 이용한 단백질 발현 방법을 이용 하였으며 손쉽고 정확하게 각 바이러스 단백질의 여러 가지 활성을 측정 가능 하게 하였다. HBV pol은 간연 B 바이러스가 감염된 세포의 여러 단백질과 결합하여 여러 가지 기능을 수행함이 보고 되고 있다. 본 연구는 이런 사실을 확인 하고 새로운 단백질 발굴을 위하여 효모 2 하이브리드 방법을 이용하여 HBV pol과 결합할 수 있는 인간 뇌 발현 단백질 라이브러리를 검색하였으며 인간 세포네에서 amnexinⅡ 단백질과 결합하는 11의 kDa의 칼슘결합 단백질인 S100A10(p11)을 검색하여 냈다. 또한 이 p11은 HBV pol의 DNA 의존 DNA 합성 활성을 in vitro와 인간 세포주인 293T 세포에서 60%이상 감소시킴을 확인하였다. 인간 간암 세포주인 HepG2세포에 HBV pol과 p11을 동시에 트렌스펙션 후 공초점형광현미경을 이용한 형광면역분석을 수행하여본 결과 대부분의 두 단백질은 세포질에 머무르는 것으로 확인되었고 소량의 두 단백질이 세포핵에 작은 반점을 이루는 것을 관찰하였다. 이 작은 반점은 전골수성백핼병핵체 (PML NBs)임을 전골수성백혈병단백질 단일항체로 세포네 핵에 존재함을 확인 하였다. p11은 세포네 칼슘의 농도에 따라 HBV pol을 세포핵의 PML NBs로 이동시킴을 확인하였다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 p11은 HBV pol을 통한 바이러스 생명 순환에 능동적 역할을 수행하며, 세포네 칼슘의 농도가 이런 p11의 기능을 조절하는 것으로 사료 된다. The human and duck Hepatitis B Virus polymerase (HBV Pol and DHBV Pol) were expressed using a yeast system, Pichia methanolica. HBV (1∼680 ammo acids) and DHBV (DHBV,1∼780 ammo acids) Pol were expressed and showed DNA dependent DNA polymerase (DDDP). The DHBV Pol had RNA dependent DNA polymerase (RDDP) and RNase H activities. We present a new simplified way of obtaining active viral Pol using the yeast expression system. The viral Pols proved to be stable and were not aggregated in the yeast system. HBV Pol interacts with cellular chaperone proteins and thereby performs multiple functions necessary for viral replication. Yeast two-hybrid analysis was applied to identify additional cellular factor required for Pol function. HBV Pol interacted with S100A10 (P11), a Ca^(2+) -modulated protein previously described to bind to annexin II. The interaction between Pol and p11 was confirmed by co-immunoprecipitation of the two proteins synthesized either in vitro or in transfected cells and by inhibition of the DNA polymerase activity of Pol by p11. Immunofluorescence analysis of transfected human cell lines revealed that, although most Pol and p11 was restricted to the cytoplasm, a small proportion of each protein colocalized as nuclear speckles; Pol was not detected in the nucleus in the absence of p11. The Pol-p11 nuclear speckles coincided with nuclear bodies containing the promyelocytic leukemia protein PML. Furthermore, the association of Pol-p11 with PML was increased by exposure of cells to EGTA and inhibited by valinomycin. These results suggest a role for p11 in modulation of HBV Pol function and implicate PML nuclear bodies and intracellular Ca^(2+) in viral replication. Our present data therefore suggest that p11 may function to transport HBV Pol to PML NBs and thereby to inhibit viral replication. An apparently contradictory role for PML NBs is to serve as nuclear sites for the transcription and replication of the genome of certain DNA vauses. According to this hypothesis, association of HBV Pol and p11 with PML NBs may help the viral genome transport to the nucleus for initiation of transcription.

Regulation of miR-122 Stability by Hepatitis C Virus Core Protein : C형간염바이러스 코아단백질에 의한 miR-122 안정성 조절

Kim, Geon-Woo 연세대학교 생명시스템대학원 2016 국내박사

간 특이적으로 발현되는 miR-122는 간 발달 및 대사에 중요한 역할을 하며, C형간염바이러스 RNA 5′-UTR 부분에 결합해서 바이러스 게놈 레벨을 증가시키는 효과를 보인다고 밝혀져 있다. C형간염바이러스 감염 시 miR-122의 발현 정도가 감소하는 결과가 보고 되었지만, 발현 레벨 감소 원리는 규명되지 않았다. 본 연구는 C형간염바이러스 코아단백질이 GLD-2 단백질의 기능 억제를 통해 miR-122 안정성을 저해 함으로서, miR-122의 발현 정도를 감소 시키는 결과를 보여준다. 코아단백질 발현시miR-122 발현 레벨 감소를 통해 miR-122의 내생적 기능 및 C형간염바이러스의 프로바이러스 활성이 억제되는 것을 다양한 실험방법을 통해서 확인하였다. 코아단백질의 miR-122 발현조절 원리를 규명하기 위해 C형간염바이러스 감염환자의 간 조직 및 코아단백질 발현세포주의 miRNA 프로파일을 deep sequencing 방법을 통해 분석하였다. 그 결과, miR-122는 21-nt, 22-nt 및 23-nt 형태가 큰 비율로 존재하며, 그 중miR-122 23-nt형태의 비율이 C형간염바이러스 감염환자와 코아단백질 발현 세포주에서 감소하였음을 확인하였다. miR-122 21-nt는 22-nt의 3′ 말단의 염기서열 하나가 분해된 형태이고, 23-nt는 22-nt 길이로 프로세싱이 일어난 후 3′ 말단에 한 개 염기서열이 추가된 형태임을 분석하였다. GLD-2 단백질의 말단 염기 전달 활성을 통해 miR-122 22-nt로부터 23-nt 형태가 만들어지며, 이렇게 하나의 염기서열이 추가된 형태는 활성과 안정성이 더 높아지는 결과를 보였다. 코아단백질의 GLD-2 기능 조절 원리는 상호결합을 통해서 GLD-2의 기능을 조절 하며, 발현 레벨에는 영향을 주지 않는 결과를 확인하였다. 종합적으로 본 연구의 결과는 코아단백질이 miR-122의 안정성 조절을 통해C형간염바이러스의 게놈 레벨과 miR-122의 기능을 조절할 수 있다는 새로운 기능을 제시하고 있다. The liver-specific microRNA miR-122, which has essential roles in liver development and metabolism, is a key proviral factor for HCV. Despite its crucial role in the liver and HCV life cycle, little is known about the molecular mechanism of miR-122 expression regulation by HCV infection. Here, we show that the HCV core protein downregulates the abundance of miR-122 by promoting its destabilization via the inhibition of GLD-2, a non-canonical cytoplasmic poly(A) polymerase. The decrease in miR-122 expression resulted in the dysregulation of the known functions of miR-122, including its proviral activity for HCV. By high-throughput sequencing of small RNAs from human liver biopsies, we found that the 22-nucleotide (nt) prototype miR-122 is modified at its 3′ end by 3′-terminal non-templated and templated nucleotide additions. Remarkably, the proportion of miR-122 isomers bearing a single nucleotide tail of any ribonucleotide decreased in liver specimens from patients with HCV. We found that these single-nucleotide-tailed miR-122 isomers display increased miRNA activity and stability over the 22-nt prototype miR-122 and that the 3′-terminal extension is catalyzed by the unique terminal nucleotidyl transferase activity of GLD-2, which is capable of adding any single ribonucleotide without preference of adenylate to the miR-122 3′ end. The HCV core protein specifically inhibited GLD-2, and its interaction with GLD-2 in the cytoplasm was found to be responsible for miR-122 downregulation. Collectively, our results provide new insights into the regulatory role of the HCV core protein in controlling viral RNA abundance and miR-122 functions through miR-122 stability modulation.

Hepatitis B virus X protein stimulates viral replication by inhibiting NREBP binding on the core promoter via DNA methylation

이혜현 부산대학교 대학원 2014 국내석사

간염, 간경변, 간암을 유발하는 B형 간염바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 유전자 조절 및 복제 기전에 대한 연구는 임상적으로 중요한 매우 중요한 연구 분야이다. 본 연구에서는 HBV의 X 단백질이 DNA의 메틸화를 유도하여 바이러스의 유전자발현을 조절하고, 나아가 바이러스 복제를 촉진할 것이라고 가정하고 실험을 진행하였다. 우선, HBV의 X 단백질이 HBV의 전사를 활성화하는지 알아보기 위해 Luciferase assay를 수행하였으며 그 결과, X 단백질의 농도가 높아질수록 코어 프로모터의 활성이 증가하는 것을 밝혀내었다. 또한 이러한 활성의 증가는 DNA메틸전이효소 저해제인 5-Aza-2’d에 의해 사라지므로 X 단백질의 바이러스 복제 촉진기전을 연구함에 있어 DNA 메틸화가 관여한다는 것을 알 수 있었다. HBV X 단백질의 전사 및 복제활성조절을 regulatory elements의 deletion을 통해 분석한 결과negative regulatory element(NRE)영역의 DNA 메틸화에 크게 의존하고 있음을 알 수 있었다. 특히 NRE 영역의 DNA서열 중 강하게 메틸화되는 nt1619 의 사이토신(cytosine, C)은 HBV의 전사 및 복제를 억제하는 것으로 알려진NREBP(Negative Regulatory Element Binding Protein)라는 repressor가 결합하는 영역인 nt1611-1619영역에 포함되어 있음을 밝혀 내었다 (Sun, C.T et al.,2002). HBx에 의한 DNA메틸레이션이 NREBP의 코어프로모터 결합에 영향을 주는지 알아보기 위하여 실험을 진행하였을 때, 강하게 메틸레이션 된 코어프로모터에는 NREBP의 결합도가 현저히 떨어지는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 5-Aza-2’dC를 처리하여 DNA메틸레이션을 저해하였을 때, NREBP의 결합이 회복되어 바이러스의 레플리케이션이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다. 즉, HBV의 X 단백질에 의한 nt1619 C의 메틸화는HBV의 전사 및 복제를 억제하는 repressor인 NREBP의 결합을 저해함으로써, HBV의 전사 및 복제를 활성화 시키는 것으로 생각된다.