Production of monoclonal antibodies specific for RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus : C형 간염바이러스의 RNA-dependent RNA polymerase에 특이적인 단일클론항체 제조에 관한 연구

박정민 The Graduate School of Hallym University 2002 국내박사

C 형 간염 바이러스는 만성 간염 및 간암을 유발하는 주된 병원체로서 Flaviviridae family 에 속하며 외피단백질 (envelope proteins)을 가지고 있다. 1989 년에 C 형 간염 바이러스의 genome 이 처음 cloning 되었으나 현재까지 C 형간염 바이러스에 대한 in vitro 세포배양 기술의 결여로 바이러스에 대한 병원성 및 복제 기전에 대한 연구가 지연되고 있다. C 형 간염 바이러스는 않은 genotype 으로 나뉘어지며, genome 의 염기서열이 다양하고 바이러스 외피단백질의 지속적인돌연변이로 인하여 바이러스를 중화시킬 수 있는 백신개발에 어려움이 있다. 바이러스 입장에서는 중화항체를 회피할 수 있는 cytotoxic T lymphocytes (CTL)에 의해 사멸되지 않음으로서 가장 진화된 생존전략이라 볼 수 있다. 이미 HIV에서 효소억제제 개발로 효과를 나타낸 경험이 있기 때문에 C 형 간염 바이러스의 치료제로도 효소가 가장 유력시 된다. C 형 간염 바이러스의 NS5B 단백질은 RNA genome을 복제하는 RNA-dependent RNA polymerase 활성을 가지며 genome 의carboxy-terminal의 제일 끝에 위치하는 NS5B 단백질에 의해 발현된다. 본연구에서는 NS5B 단백질에 특이적으로 작용하는 다양한 단일클론항체를 제조한 후 이를 정제하였으며 나아가서는 이런 단일클론항체들이 NS5B 단백질의 polymerase 활성에 어떠한 영향을 주는지 알아보고자 하였다. 우선 NS5B 단백질을 baculovirus expression system을 이용하여 발현시킨 후 Ni-NTA agarose column 을 이용하여 정제하였다. 8주된 BAL/c mice 에 정제한 NS5B 단백질을 Complete Freund's adjuvant와 혼합하여 주사한 후, 3-4주 간격으로 incomplete Freund's adjuvant를 사용하여 NS5B 단백질을 3-4 차례 더 boosting 하였다 이렇게 얻은 Immunized mice 로부터 spleen cell 을 분리하여 myeloma cell 과 결합시켜 hybridomas를 선별하여 세포배양후, 그 media 를 모아 sepharose-A column 을 통해 단일클론항체를 정제하였다. 이렇게 제조한 여러가지 단일클론항체가 정제한 NS5B 단백질과 서로 특이적으로 작용하는지 알아보기 위해 면역반응을 수행한 결과 단일클론항체 7S3, 5B4, 그리고 3H5 가 NS5B 단백질을 특이적으로 인지하는 것을 알 수 있었다. 따라서 이러한 단일클론항체와 작용하는 NS5B 단백질의 epitope부위를 세부적으로 연구하기 위해 NS5B단백질을 크게 세 부분 (-N, -M, 그리고 -C) 으로 나누어 각각 GST (Glutathione-5-Transferase) 와 tagging 시켜 E. coli.에서 발현시켜 정제하였다. immunoblot assay 결과 제조된 단일클론항체들이 각각 NS5B 단백질의 -N, -M 부분을 특이적으로 인지하는 것을 관찰할 수 있었다. 흥미롭게도 그 중에서 5B4 단일클론항체는 NIH 1b NS5B 단백질은 인지하지만 Korean 1b NS5B 단백질은 인지하지 않았다. 이것은 5B4 단일클론항체가 NIH1b genotype 에 특이적인 항원인지 부위를 가지는 걸 의미한다. 위와 같은 연구결과 제조한 단일클론항체가 C 형 간염바이러스의 복제기전에 중요한 기능을 하는 NS5B단백질과 특이적으로 작용하는 것을 알 수 있었다. 따라서 이런 특징을 갖는 단일클론항체를 이용하여 NS5B 단백질의 RNA-dependent RNA polymerase 기능에 어떤 영향을 주는지 알아보기 위해 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)assay 를 수행하였다. 그 결과 단일클론항체 7S3 와 3H5 가 NS5B 단백질의 RdRp activity 를 억제함을 관찰할 수 있었다. 그 중에서 7S3 단일클론항체가 3H5 단일클론항체보다 더 효율적으로 RdRp activity 를 감소시켰다. 따라서 이런 단일클론항체들을 이용하여 C 형 간염 바이러스의 복제메카니즘을 규명하고 이를 기반으로 항바이러스제를 개발하는데 좋은 기초 연구 자료로 사용될 수 있으리라 사료된다.

삼일열 말라리아의 특이적인 진단을 위한 나노비드 기반의 비색 대비 면역분석법

김연준 청주대학교 대학원 2024 국내석사

Milk progesterone의 定量手段으로서 單一클론抗體를 利用한 Microplate-EIA의 測定法 開發에 관한 硏究

홍승욱 檀國大學校 大學院 1991 국내석사

本 硏究는 progesterone 單一클론抗體와 非發癌性 物質인 TMB를 利用하여, 小規模實驗室 에서 簡便하게 活用할 수 있는 progesterone 定量을 위한 免疫分析法(microplate-EIA)을 確立하고, 이를 利用하여 牛乳中 progesterone의 濃度를 測定하여 젖소의 姙娠早期診斷法으로서의 可能性 및 診斷의 正確度를 調査할 目的으로 實施하였다. 1. Progesterone 單一클론抗體 및 HRP-P와 TMB를 利用하여, 確立된 microplate-EIA 法으로 progesterone의 濃度를 測定한 結果 測定의 敏感度가 매우 良好하여 5pg/well 水準까지 測定이 可能하였다. 2. 0.1ng/ml 로부터 3.2ng/ml까지의 progesterone 濃度를 利用하여 標準曲線(standard curve)을 作成한 結果 回歸曲線 方程式의 決定係數(R^(2))는 0.993으로 매우 높았으며, 反復測定시 intra-assay 및 inter-assay에 대한 變異係數(C.V. %)는 각각 4.4%-10.6% 와 5.6%-12.6% 로서 測定의 精密度가 良好한 水準으로 나타났다. 3. Microplate-EIA法은 測定의 敏感度와 精密度가 높고 安定되어 姙娠早期診斷 및 각종 卵巢機能의 異狀有無 測定에 簡便하고 低廉하게 利用할 수 있는 것으로 判定되었다. A simple and sensitive microplate enzyme immunoassay (Microplate-EIA) was developed for progesterone, based on monoclonal antibody against progesterone as anti-progesterone, horseradish peroxidase (HRP ) as enzyme-label and tetramethylbenzidine (TMB) as non-carcinogenic substrate. 1. The assay has a sensitivity of 5pg-1280pg / well and intra- and inter assay coefficients of variation for progesterone standard curve (0.lng- 3.2ng / ml) were ranged 4.4% - 10.6% and 5.6% - 12.6%, respectively. 2. The assay is performed in less than three hours and provide reliable values to differentiate among milk samples from day 0 (A.I.) to day 21 in cows. 3. These results indicate that the Microplate-EIA method may be suitable for pregnancy diagnosis and other fertility controls in cows especially in a small scale laboratory. Furthermore it will be suggested that this method can be practically used as a rapid detection of estrus.

Human Lactoferrin의 단일클론항체를 이용한 Time-resolved Fluoroimmunoassay개발에 관한 연구

김도희 建國大學校 大學院 1994 국내석사

이 연구는 human Lactoferrin의 정량을 위한 time-resolve fluoroimmunoassay(TR-FIA)를 개발하고 이를 ELISA와 비교하여 그 이용가능성을 조사하기 의해 실시되었다. 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Human Lactoferrin으로 감작시킨 생쥐의 비장세포와 골수종세포 (Sp2/0-Agl4)를 융합하여 11.9%의 융합효율을 나타내었다(42 / 360). 강한 양성반응을 보인 5D64E6 clone을 취하여 실험에 사용하였다. 2. HRP-Rabbit Anti-Mouse IgM, IgG+A+M, IgG_(1), IgG_(2a), IgG_(2b), IgG_(3)을 사용하여 결정한 5D64E6단일클론항체의 isotype은 IgG_(2b)였다. 3. 5D64E6 hybridoma세포를 Balb/c의 복강에 접종하여 얻은 복수의 역가 (titre)는 indirect ELISA로 측정한 결과 1 : 50,000이였으며, 토끼항혈청의 역가는 1 : 400,000이였다. 4. HRP 및 Europium chelate를 항원인 human Lactoferrin과 표지하였다. Eu-hLF conjugation의 yield는 1.36으로, hLF 한 분자당 약 1.36개의 Eu이 결합했음을 알 수 있었다. 5. 토끼복합항체와 단일클론항체를 이용한 TR-FIA및 ELISA로서 표준곡선 (standard curve)을 작성하였다. 단일클론항제를 이용한 TR-FIA의 경우 측정범위 (detection range)가 5 μg - 9.8ng/ml이였으며, 감도는 9.8 ng/ml였다. 6. 5D64E6 단일클론항체를 이용한 TR-FIA의 반복성정도를 평가하기 위한 Intra-Inter assay 변이상수 (C.V.)는 각각 1.2 - 12.7%, 0.95 - 12.87% 였다. This study was carried out to develope time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA) to human lactoferrin(hLF) with polyclonal antibody and Monoclonal antibody(McAb) and the newly developed method was compared with Enzyme-linked Immunosorvent assay(ELISA). The results obtained are as follows; 1. Spleen cells from Balb/C immunized with hLF were fused with myeloma cell, Sp2/0-Agl4 and resulted in 11.9% of fusion efficiency (42/360). The 5D64E6 clone haying the strongest positive response was chosen as a candidate for the assay. 2. The isotype of the produced McAb, SD64E6 was determined by using HRP-Rabbit Anti-Mouse IgM,IgG+A+M, IgG_(1), IgG_(2a), IgG_(2b), IgG_(3) and turned out to be IgG_(2b). 3. The titre value of ascitic fluid of mice Inoculated with 5D64E6 clone hybridoma determined by indirect ELISA was 1 : 50,000. That of Rabbit anti-serum was 1 : 400,000. 4. Horse-radish Peroxidase(HRP) and Europium(Eu) chelate was conjugated with Ag, hLF. The yield of the Eu-hLF conjugation (Eu μmol / protein μmol) was 1.36. 5. Standard curve of hLF were constructed in competitive TR-FIA and ELISA using Rabbit polyclonal antibody and 5D64E6 McAb. The detection range was 5 μg - 9.8 ng/ml and sencitivity was 9.8 ng/ml in TR-FIA using McAb. 6. Reproducibility (C.V.) of the TR-FIA using 5D64E6 McAb was 0.95 - 12.87% In inter-assay, 1.2 - 12.7% in intra-assay

B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 항체 발현 및 생산과 그 항체를 이용한 Time-Resolved Fluoroimmunoassay법의 개발

김윤규 建國大學校 大學院 1997 국내박사

B형 간염바이러스(HBV)에 특이성을 갖는 항체들이 세포융합과 항체 engineering기법에 의해 생산되었으며, 이들을 이용하여 HBs항원과 anti-HBs 항체 측정을 위한 time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA)법이 개발되었다. 1. HBV prS1 항원에 대한 단일클론항체를 생산하기위해 maltose-binding protein (MBP)-preS1(56)과 glutathione S-transferase(GST)-preS가 E. coli에서 수용성 형태로 발현되어 세포 lysate로 부터 정제되었다. 2. 각 융합단백질은 Balb/C 생쥐에 면역화 되었고, 그 결과 6개의 단일 크론 항체가 얻어졌으며, 이들 중 1B3와 7H8의 항원 epitope을 조사한 결과, 각각 preSl의 N-말단 1-2Oaa와 42-49aa를 인식하는 것으로 나타났다. 3. Single-chain immunoglobulin(ScIg)를 생산하기 위해 단일클론항체의 heavy chain variable영역은 linker에 의해 light chain variable 영역의 아미노말단과 공유결합에 의해 연결되었으며, C-말단을 γ1 constant의 hinge 영역에 융합시켰다. 4. 이것은 Chinese hamster ovary세포에서 dihydrofolate reductase 증폭과정에 의해 발현되었다. 항체를 안정적으로 발현하는 2E11 세포주가 선별되어 Protein G-sepharose에 의한 친화성 크로마토그래피로 세포 상층액으로 부터 정제되었다. 5. 2E11 항체의 항원결합 친화력은 ScIg의 모 항체인 chimeric 항체 CS131A 의 1/2 정도였다. 2E11과 CS131A의 PBS와 인간혈청에서의 열안 정성조사에서 2E11의 안정성과 활성이 PBS에서 보다 혈청에서 더 우수 한 것으로 나타났으며, 생리학적 온도에서는 CS131A와 거의 대등한 안정성을 나타냈다. 6. TR-FIA 개발을 위해 1B3와 ScIg을 europium chelate로 표지시켜 labelling yield를 조사한 결과, HBs 항원, lB3항체, 그리고 ScIg의 yield가 각각 0.98, 5.55, 3.36으로 나타났다. TR-FIA에 의한 HBs항원과 anti-HBs 항체 측정 감도는 2ng/well이었으며,. ELISA와의 상관관계는 각각 y=-76864.7+67553.9x(r=0.92)와 =-15.1+38.9x(r=0.94)로 나타났다. 7. ScIg와 IB3의 two-site sandwich법에 의한 TR-FIA에 의해 HBs 항원이 양성인 환자의 혈청에서 감염성 particle을 조사하였다. 그 결과 감염성 particle과 HBs항원 농도간에 서로 상관관계를 갖는 것으로 나타났다. 이들 결과는 ScIg와 anti-preSl 단일클론항체가 성공적으로 발현, 생산되었으며, 이들 항체를 이용한 HBs 항원과 anti-HBs 항체측정을 위한 TR-FIA는 RIA를 대치할 수 있는 안정된 높은 감도의 assay법인 것을 지적한다. We attempted to generate single-chain antibodies(Sclg) against the hepatitis B virus surface antigen(HBsAg) and to apply the antibodies for developing a time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA) system. 1. Hepatitis B virus(HBV) preSl proteins fused with the maltose binding protein (MBP)-preSl(56) or the glutathione S-transferase (GST)-preS were expressed in E. coli and purified from the cell lysate. Each fusion proteins were immunized into Balb/C mice. 2. Six clones secreting a good amount of the mAb were isolated and characterized. Among them, the 1B3 and the 7H8 antibody recognized N-terminal 1-20aa and 42-49aa of the preS1 sequence, respectively. 3. We tried to create a ScIg maintaining the same specificity with the conventional mAb against the HBsAg. The heavy chain variable domains of the antibody was covalently joined to N-terminus of the light chain variable domain via synthetic linker The C-terminus of the light chain was then connected to the γ1 constant region by the hinge region. 4. The construct was then recombined with the expression vector pSGIG-S and expressed in Chinese hamster ovary cells using a procedure for dihydrofolate reductase amplification. 5. A clone (2E11) was selected and produced antibodies were purified from the culture supernatant by a Protein G affinity column. Antigen-binding affinity of the 2E11 was half of the parental chimeric antibody CS131A. 6. To develop a TR-FIA system, HBsAgs or ScIgs were conjugated with the europium chelate. This assay system was able to detect the HBsAg or the anti-HBs Ab at the level of 2ng/well, and showed a linear regression equation of y=-76864.7+67553.9x(r=0.92) or y=-15.1+38.9x(r=0.94) when compared with the measurements of 22 samples performed by a conventional ELISA method. 7. To further confirm practicality of the system, the patient sera were analyzed by TR-FIA based on two-site sandwich method of ScIg and anti-preS1 mAb (1B3). The concentration of infectious particle and HBsAg were shown to be well correlated with each other. These results indicated that the ScIg and the anti-preSl mAb were sucessfully generated, and the TR-FIA made of these antibodies was able to measure HBsAg or anti-HBsAb in a stable and sensitive manner.

리스테리아 특이 iap 유전자(p60)의 대장균에서의 발현과 발현된 p60 단백질에 대한 단일클론항체의 생산

이칠우 경기대학교 대학원 2000 국내석사

Listeria monocytogenes의 iap (invasion-associated protein) 유전자는 Listeria spp.의 주요 세포외 단백질인 p60을 암호화하고 있다. pMAL-c2 vector는 E. coli에서 L. monocytogenes의 p60 단백질을 발현시키고 정제하는데 용이하여 사용하였다. 이 vector에 존재하는 maltose binding protein (MBP) 융합단백질 발현계는 E. coli에서 재조합 단백질을 추출하고 얻기에 효과적인 도구이다. 본 연구에서 iap gene은 polymerase chaine reaction (PCR)에 의하여 L. monocytogenes의 게놈 DNA로부터 증폭하였으며, pMAL-c2 vector에 의하여 cloning되어 E. coli에서 발현되었다. 재조합 된 p60 단백질의 과발현은 0.3mM의 IPTG에 의하여 유도되었다. 발현양은 유도시간에 의하여 증가하였는데 정제를 위해 6시간이 최적의 유도 시간이었다. 이 재조합 단백질(MBP-p60/mono)은 amyloseresin column을 이용하여 정제되었다. BALB/c mouse는 L. monocytogenes의 p60에 대한 단일클론항체를 얻기 위해 정제된 MBP-p60/mono 단백질을 이용하여 면역시켰다. 그 결과 다른 미생물에는 반응하지 않지만 Listeria spp. 배양 상등액의 p60에 대하여 cross-reaction되는 여러 단일클론항체을 얻었다. 이들 단일클론항체 중에서 ID12 hybridoma는 L. monocytogenes에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 생산하였다. The iap(invasion-associated protein) gene of L. monocytogenes is encoding p60 that is major extracellular protein of Listeria spp.. pMAL-c2 vector was used cloning because it is easy to express p60 of L. monocytogenes in E. coli and isolate its protein. The maltose binding protein (MBP) fusion protein expression system existing in this vector is a powerful tool to produce and isolate recombinant proteins in E. coli. In this study, iap gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from genomic DNA of L. monocytogenes, it has been cloning by pMAL-c2 vector and expression in E. coli. The overexpression of recombinanted p60 was induced by 0.3mM IPTG. It was shown that the amount of expression was increased with inducing time and that 6 hours was optimal inducing time for the purification. The recombinant protein (MBP-p60/mono) had been pruified to use amylose resin column. BALB/c mouse were immunized with this protein to produce monoclonal antibody for p60 of L. monocytogenes. The result was that these monoclonal antibodies cross-reacted of p60 in supernatants of Listeria spp. cultured but didn't react to other microbe. 1D12 hybridoma producted monoclonal antibody that was specific reaction of L. monocytogenes among these monoconal antibodies.

큰다리먼지진드기의 주요 알레르겐인 Der f 1에 대한 특이적인 단일클론항체 개발 및 이를 이용한 ELISA 키트 개발

김지태 강원대학교 대학원 2021 국내박사

집먼지진드기는 알레르기성 비염, 천식 및 아토피 피부염 등의 알레르기 질환을 유발하는 대표적인 원인으로 알려져 있다. 현재까지 집먼지진드기 유래 알레르겐은 50가지 이상이 알려져 있으나 이중 큰다리먼지진드기의 Der f 1, Der f 2와 세로무늬먼지진드기의 Der p 1, Der p 2가 대표적인 중요한 알레르겐으로 알려져 있다. 집먼지진드기에 의해 유발된 알레르기질환 환자 중 80∼95%는 이 4가지 알레르겐에 의해 IgE가 과발현 되어 면역 반응을 통해 면역질환을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 이중 Der f 1은 우리나라에서 우점종을 차지하고 있는 큰다리먼지진드기의 주요 알레르겐으로 Group 1 알레르겐인 cysteine protease 계열이다. 특히 Der f 1은 Der f 2에 비해 유전자서열의 다형성(polymorphism)이 적어 큰다리먼지진드기 유래 알레르겐을 파악하는 지표물질로 용이하다고 알려져 있다. 본 연구에서는 Der f 1에 대해 특이적인 단일클론항체를 개발하고 이 항체를 이용한 Der f 1 ELISA 키트를 개발 및 검증하고자 하였다. 먼저 큰다리먼지진드기의 사육 및 추출 과정을 통해 native Der f 1 (nDer f 1)을 확보하였다. 또한 Der f 1 유전자가 삽입되어 있는 벡터가 형질전환 되어 있는 Pichia 균주를 배양 정제하여 재조합 Der f 1 (rDer f 1)을 확보하였다. 확보한 rDer f 1을 항원으로 하여 하이브리도마를 제작하였으며 이후 rDer f 1 및 nDer f 1에 대해 모두 반응하는 단일클론항체를 선별하였고 이를 biotinylation 및 combination 시험을 통해 최종적으로 1차 항체 3D7과 2차 항체 13F7를 선별하였다. 두 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 한국세포주연구재단에 기탁번호 KCLRF-BP- 00486 및 KCLRF-BP-00487로 기탁하였다. 본 연구를 통해 개발된 항원과 항체를 이용한 Der f 1 ELISA 키트의 검출한계는 nDer f 1은 50 ng/ml 이었으며 rDer f 1은 2 pg/ml 이었다. 또한 현재 면역치료 및 알레르기 진단에 사용되는 4종류의 기허가 된 큰다리먼지진드기 알레르겐 정제 추출물을 대상으로 기존에 사용되고 있는 A사의 Der f 1 ELISA 키트와 비교한 결과, A사 키트의 Der f 1 값은 3.62∼20.59 ㎍/ml 이었고 본 연구에서 개발한 키트의 Der f 1 값은 3.72∼16.83 ㎍/ml 이었다. 두 분석 사이의 피어슨 상관 계수(Pearson Correlation Coefficient)는 0.1∼0.7로 두 키트간의 차이는 크게 없음을 확인하였다. 마지막으로 20개의 집먼지 샘플을 대상으로 측정한 Der f 1 농도는 A사 키트는 16.9∼429.0 ng/g먼지 였고 본 연구에서 개발한 키트는 14.6∼362.9 ng/g먼지 였다. 두 분석 사이의 피어슨 상관 계수는 0.9로 사용한 두 키트간의 차이는 없음을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구에서는 Der f 1에 대해 정성 및 정량방식의 면역분석에 유용한 새로운 단일클론항체를 개발하였으며 이를 이용한 ELISA 키트는 Der f 1을 함유하고 있는 다양한 종류의 항원에 대해 기존 제품과 크게 차이가 없어 이를 대체하여 사용이 가능함을 확인 하였다. 그러므로 본 연구를 통해 얻어진 결과물들이 향후 국내 알레르기질환에 대한 새로운 진단기법 개발 및 면역치료제 개발에 있어 도움이 될 것이다. House dust mites are known to be a representative cause of allergic diseases such as allergic rhinitis, asthma and atopic dermatitis. Up to now, more than 50 kinds of allergens derived from house dust mites are known, but among them, Der f 1 and Der f 2 of Dermatophagoides farinae and Der p 1 and Der p 2 of Dermatophagoides pteonyssinus are known as the representative important allergens. It is reported that 80-95% of patients with allergic diseases caused by house dust mites have over expressed IgE by these four allergens, thereby indicating an immune disease through an immune response. Der f 1 is a major allergen of D. farinae that dominate in Korea, and is a group 1 allergen, cysteine ​​protease. In particular, Der f 1 has less polymorphism in the gene sequence than Der f 2, so it is known that it is easy to identify allergens derived from house dust mites. In this study, a specific monoclonal antibody for Der f 1 was developed, and then the ELISA kit was developed using this antibody. First, two antigens were obtained. One is native Der f 1 extracted from D. farinae and the other is recombinant Der f 1 purified from a Pichia strain transformed with a recombinant vector(Derf1-pPIC9). For Der f 1 specific mAbs, Hybridomas obtained after immunization with rDer f 1 as antigen and it were screened using ELISA and western blotting analysis. As a result, four monoclonal antibodies (1G8, 3D7, 13C5, and 13F7) were selected, and biotinylation and combination assays were confirmed. Finally, primary mAb 3D7 and secondary mAb 13F7 were selected. The detection limit of ELISA kit using mAb 3D7 and 13F7 were as low as 50 ng/mL on native Der f 1 and 2 pg/mL on rDer f 1. The developed ELISA kit was compared and tested with A company's Der f 1 ELISA kit on 4 commercialized D. farinae allergen extracts and 20 house dust samples. As a result, there was no significant difference in the Pearson correlation coefficient of the results obtained from the two kits. In conclusion, in this study, developed an ELISA kit and a novel mAb useful for the qualitative and quantitative immunoassay of Der f 1. Therefore, the results obtained through this study will be helpful in the development of new diagnosis and immunotherapy for allergic diseases in Korea in the future.

금입자면역크로마토그래피법의 개발과 그 응용

김창규 建國大學校 大學院 1999 국내박사

단일클론 항체를 사용하여 간편하고 신속하게 물질을 측정할 수 있는 금입자 면역크로마토그래피 법을 개발하고 이 방법을 hCG와 HBsAg을 검출하는데 응용하였다. 또한 결과를 정량화 하기 위한 시도로서 컴퓨터 상 분석을 실시하였으며 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 항 hCG항체를 분비하는 5개의 융합세포주를 확립하였으며 이중 2개는 β-hCG와 결합하는 항체를 분비하였으며 나머지 3개는 α-hCG와 결합하는 항체를 분비하였다. 2. 1% HAuCl_(4) 용액에 1% 구염산 나트륨을 7 ml, 3 ml, 1 ml, 0.5 ml을 각각 첨가 했을 때 20 nm, 40 nm, 80nm 및 150nm 크기의 금입자가 생성되었다. 3. 금입자 항체 복합체 제조시에 최적조건은 CKD-35 항체의 경우 pH 8, 항체농도 4㎍/ml 이였고 KS-CKD1 항체의 경우는 pH 6, 항체농도 4 ㎍/ml 이였다. (금입자 크기는 40 nm) 4. 면역크로마토그래피 스트립의 안정성을 시험 했을 때 상온, 50℃와 60℃에서는 2달, 그리고 상대습도 75%로 조절된 40℃ 에서는 1주일간 안정하였다. 5. hCG측정을 위한 면역크로마토그래피법의 검출한계는 12.5 mIU/ml이였고 구조가 유사한 hTSH, hLH, hFSH와 교채반응을 나타내지 않았다. 6. HBsAg 측정에 응용한 면역크로마토그래피법의 검출한계는 4ng/ml 이였고 임상실험결과 민감도는 97%, 특이도는 100%이였다. 7. 결과를 정량화 하기위한 컴퓨터 상 분석에서 검출가능범위는 10 mIU/ml에서 1000 mIU/ml 이였고 편차는 2.5%이였다. 또한 intra-assay와 inter-assay의 변이상수는 25 mIU/ml에서 2.03%, 2.84% 이였고, 100 mIU/ml에서 3.14%, 4.77%이며, 높은 농도인 350 mIU/ml에서 3.55%, 6.28% 이였다. 이상의 결과는 금입자와 단일글론항체를 이용하여 개발한 면역크로마토그래픽법이 임상적으로 사용될 수 있음을 나타내었다. 본 방법의 가장 큰 장점은 상온에서 보관이 가능하며 5분 이내에 신속하게 단 한번의 조작으로 고가의 장비없이 검사할수 있어 여러 분야에 응용할 수 있을 것으로 기대된다. A simple and rapid Immunochromatographic Assay(ICA) system was developed using monoclonal antibodies and gold particle as a label this system was applied for the detections of hCG(human Chorionic Gonadotropin) and HBsAg(hepatitis B suface antigen). In addition, it computer image-and data-processing procedure has been developed for the quantification of the results appeared in a ICA strip. The results obtained were summarized as follow; 1. It was established 5 hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies to hCG. 2 clones of them were specific to β-hCG subuints, while remaining other 3 clones were specific to α-hCG subuints. 2. When 7 ml, 3 ml, and 0.5 ml of 1% sodium citrate solution were added to 200 ml of 1% HAuC1_(4) solution, the size of gold particles, which was produced, was 20 nm, 40 nm, and 80 nm, 150 nm, respectively. 3. The optimal pH and concentration of antibody for the production of CKD-35 antibody-gold conjugate were pH 8 and 4 ㎍/ml when gold particle with a size of 40 nm was used. 4. Immunochromatographic assay strip was stable for 2 months at room temperature, 50℃ and 60℃. while it was stable for 1 week at 40℃ with 75%(relative humidity) 5. The detection limit of ICA for the measurement of hCG was 12.5 mIU/ml and it did not show cros-reactivities with hLH, hFSH, and hTSH. 6. ICA for the assay of HBs Ag in whole blood was evaluated in terms of detection limit, comparison studies with other known method and time required for the assay. 29 of clinicl positive samples (97%) were correlated each other between ICA and compared conventional HA and ELISA while 45 samples with negative results assayed by HA and ELISA showed also negative ones(100%). ICA procedure could be completed within 5 minutes wheras HA and ELISA requried more than one hour. The detection limits of ICA, HA and ELISA were found to be 4, 2 and 0.25 ng/ml, respectively 7. An image-and data processing procedure for the quantification of the strip assay was developed. The integrated optical density(IOD) of a gold line was measured after completion of the assay. The IOD was increased linearly with increasing concentration of hCG to be measured and the standard curve could be constructed from 10 mIU/ml to 1000 mIU/ml. The intra-assay and inter-assay precision was calculated from repeated analyses of the same sample on a number of different occasions. This study it was demonstrated that the colloidal gold label and specific monoclonal antibodies has been used successfuly for the assays of hCG and HBsAg. The great advantages of this metod are that the time required for the assay is very short ; nitrocellulose absorbed antibodies and gold particles is very stable even at room temperature and it does not require very expensive equipments. The principle presented in this study could be applied on the other systems such as HIV, HCV etc.

단일클론항체 의약품의 허가 외 사용 안전성에 관한 연구 : Bevacizumab, Rituximab, Infliximab, Adalimumab 중심으로

이지은 연세대학교 대학원 2022 국내석사

Background: ‘Off-Label Use’ is defined as the medicinal product that is intentionally used for a medical purpose not in accordance with the terms of the marketing authorization and has not been demonstrated its safety and effectiveness data for that use. While some regulation authorities are implementing regulations in order to mediate preventable Adverse Events (AEs) in off-label use, there are lacks a guidance in Korea to mediate the preventable AEs in off-label use. As off-label use of Monoclonal Antibody (mAb) has been continuously increasing and fatal/life-threatening Serious Adverse Events (SAEs) have been frequently reported, a close investigation for the safety of off-label use in Korea is required in order to use mAb safely and effectively. Objectives: The aim of this study was to provide basic information of AEs in accordance with off-label use of mAb (Bevacizumab, Rituximab, Infliximab, Adalimumab), analyze risk factors that affects the rate of Serious Adverse Drug Reactions (SADRs), and provide clues to minimize the occurrence of AEs in off-label use by using Korea Adverse Event Reporting System (KAERS) database. Methods: Adverse events reported to KAERS database between 01 Jan 2015 and 01 Dec 2019 were collected and analyzed by using SAS version 9.4. All AEs were classified as ‘On-Label Use’ used in approved indications in Korea and ‘Off-Label Use’ used in other indications by using the 7th Korean Standard Classification of Diseases. Results: From 26,269 AEs in 14,671 patients in the period of analysis, the proportion of AEs was 21,605 (88.2%) and 2,903 (11.8%) for ‘On-Label Use’ and ‘Off-Label Use’, respectively, and only 144 (0.61%) was reported as the event term of ‘Off-Label Use’. The proportion of ADRs (Adverse Drug Reactions) and SADRs were higher in ‘Off-Label Use’ than in ‘On-Label Use [2,340 (80.6%) vs 10,693 (49.5%); 293 (10.1%) vs 1,239 (5.7%)]. There was statistically significant relevance between ‘Off-Label Use’ and the occurrence of SADRs in Infliximab [Odds Ratio (OR): 5. 2.347, 95% Confidence interval (CI): 1.244, 4.427; p = 0.0084] and Rituximab (OR: 1.998; 95% CI: 1.702, 2.345; p < 0.0001) and a risk was increased in case of SADRs including death and life-threatening [Infliximab (OR: 5.469, 95% CI: 1.616, 18.513; p = 0.0063); Rituximab (OR: 3.068; 95% CI: 3.158, 4.362; p < 0.0001)]. Conclusion: As irreversible damage and mortality may increase from ‘Off-Label Use’ of monoclonal antibody, a close monitoring and evaluation of the safety of off-label use of mAbs are needed. The results of this study are expected to provide the useful safety information of ‘Off-Label use’ of monoclonal antibody and contribute to the guidance to mediate the preventable AEs. 안전성과 유효성이 입증된 승인된 적응증 외에 의약품을 사용하는 경우를 ‘허가 외 사용’이라고 정의하여, 국외에서는 예방 가능한 이상사례를 효과적으로 중재하기 위하여 규정에 따라 안전성 관리를 시행하고 있다. 반면, 한국에서는 관련 절차가 부재하다. 한편, 단일클론항체 의약품은 국내외 허가 외 사용 례와 중대한 이상사례 건이 꾸준히 보고되고 있어 국내에서도 허가 외 사용에 따른 안전성을 면밀히 조사할 필요성이 대두되었다. 본 연구는 2015년 1월 1일부터 2019년 12월 31일까지 한국의약품안전관리원의 의약품부작용보고시스템 (KAERS) 내 Bevacizumab, Rituximab, Infliximab, Adalimumab의 이상사례를 통해 허가 외 사용 여부에 따른 이상사례를 분석하였다. 허가 외 사용 여부가 중대한 약물이상반응에 미치는 영향을 분석하여 단일클론항체의 허가 외 사용 시 두드러지는 이상사례와 이에 영향을 주는 요인을 분석하여 이상사례를 최소화할 수 있는 예측인자를 제공하고자 하였다. 본 연구에서는 각 의약품의 한국 식품의약품안전처 허가사항을 7차 한국표준질병사인분류코드로 변환하여 적응증에 사용된 ‘허가 내 사용’사례와 이 외 적응증에 사용된 ‘허가 외 사용’ 사례를 비교하여 연구대상자의 일반적 특성과 이상사례 세부정보의 차이를 분석하였다. 허가 외 사용 여부가 중대한 약물이상반응과 사망, 생명의 위협을 포함한 중대한 약물이상반응 발생에 미치는 영향을 조사하였고, 추가로 허가 외 사용 이외에도 중대한 이상사례와 약물이상반응에 영향을 미치는 위험인자를 예측하기 위하여 로지스틱 회귀분석을 시행하여 오즈비(Odds ratio, OR)를 확인하였고, 모든 분석은 SAS version 9.4를 이용하였다. 연구대상자의 기초 특성에서 의심약물군별로 성별, 연령, 의심약물에 투여기간, 연령군, 병력 유무, 보고유형 원보고자 정보, 보고자 정보 모두에서 유의한 차이가 관찰되었다. 단일클론항체 사용 후 14,671명의 환자에서 보고된 26,269건의 이상사례를 분석하였다. 허가 외 사용 여부를 확인할 수 있는 이상사례는 허가 외 사용 시 2,903건(11.8%), 허가 내 사용 시 21,605건(88.2%)이었으나, 이상사례 명이 ‘적응증이외사용’으로 보고된 경우는 149건(0.61%)에 그쳐 실제 허가 외 사용이 이상사례로 보고되는 빈도 수에 차이가 있었다. SOC (System Organ Class)/PT (Preferred term) 분류에 따른 상위 10개의 이상사례 및 중대한 이상사례 분포는 대부분 각 허가사항에 반영되어 있었으나, 예상치 못한 중대한 이상사례와 중대한 약물이상반응이 다수 보고되었다. 허가 외 사용 여부에 따른 중대한 이상사례는 허가 외 사용에서 18.0%(523/2,903건), 허가 내 사용에서 17.6%(3,809/21,605건)으로 유사하였으나, 약물이상반응은 허가 외 사용에서 2,340/2,903건(80.6%), 허가 내 사용에서 49.5%(10,693/21,605건)이었고, 중대한 약물이상반응은 허가 외 사용 시 10.1% (293/2,903건)으로 허가 내 사용 시 5.7%(1,239/21,605건)보다 2배 가량 높았다. ‘중대한 약물이상반응(사망, 생명의 위협)’ 발생에 통계적으로 유의하게 연관이 있는 의약품은 Infliximab [OR: 5.469, 95% Confidence Interval(CI): 1.616, 18.513; p = 0.0063]과 Rituximab(OR: 3.068; 95% CI: 3.158, 4.362; p < 0.0001)로 나타났다. 조사기간 동안 수집된 단일클론항체의 이상사례를 종합적으로 볼 때, 허가 외 사용으로 인한 비가역적인 손상 및 사망 비율이 증가할 수 있음에 주의가 필요하다. 또한 이상사례 보고 시 허가 외 사용 여부를 필수적으로 보고하는 등 허가 외 사용의 안전성 정보를 보다 효과적으로 관리하기 위한 장치 마련이 우선되어야 하며, 보고된 이상사례 명 이외에도 실제 허가 외 적응증에서의 사용 여부에 따른 이상사례를 정기적이고 적절한 분석을 통해 허가 외 사용으로 인한 위해성으로부터 환자들의 안전을 보장할 수 있을 것으로 사료된다. 본 연구의 제한점에도 불구하고 단일클론항체의 허가 외 사용으로 인한 안전성 정보와 영향을 미치는 요인의 실마리를 확인함으로써 궁극적으로 허가 외 사용 안전성 관리 방향에 대해 참고자료로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

식중독균 Listeria monocytogenes에 대한 단일항체를 이용한 전기화학적 검출시스템 개발

김성중 차의과학대학교 대학원 2015 국내석사

현재 유통 중인 즉석식품 중 냉장에서도 증식이 진행되는 주요 식중독균인 Listeria monocytogenes를 현장에서 신속 정확하게 검출하기 위하여 새로운 단일항체를 제조하고 이미 설계된 lab-on-a chip에 탑재한 후 전기화학적 검출을 위해 새로운 검출시스템을 개발하고자 하였다. 이를 위해 Listeria monocytogenes균을 배양하여 수득한 뒤 파쇄하여 마우스에 면역접종 한 다음 B 림파구를 분리하였고, 이어서 myeloma세포와 융합하여 약 1,500개의 하이브리도마 클론을 제조한 뒤 4번의 스크리닝 단계를 거쳐 최종 3개의 클론을 확보하였다. 확보한 3가지 클론에 대한 특이성을 SPR검사를 통해 최종 10E7 클론을 식중독균 검출 항체로 최종 선별하였다. 현장에서 Listeria monocytogenes균을 신속 정확하게 검출하기 위해 전기 화학적검출시스템을 설계하고 최종 검출기 시제품을 제조하였고, 이미 설계된 lab-on-a-chip에 탑재하여 검출성능을 조사하였다. 이와 같이 제조한 바이오센서와 검출기를 이용하여 냉장 식품 중 식중독균 Listeria monocytogenes를 신속하고 정확하게 검출함으로써 국민보건 향상에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대되며, 더 나아가 다른 질환의 검출에도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. Listeria monocytogenes, a foodborne pathogen, is one of major species of the genus Listeria, which causes serious illness by contaminated foods. There are well established traditional methods, but these take long time to several days to get a result. To develop a rapid and sensitive detection system for L.monocytogenes, we tried to make new monoclonal antibodies against the bacterial cells, mount it on a newly designed lab-on-a-chip, and manufacture a electrochemical detector in this study. We immunized a sonicated L.monocytogenes to mice and produced about 1,500 hybridoma clones. Among them, one clone(10E7) was finally selected and adapted to detection system though the specificity and selectivity tests. In addition, we designed a electrochemical detection system for the detect of L.monocytogenes rapidly and accurately. These results suggest that our system including a new monoclonal antibody (10E7), a novel biosensor and electrochemical detector may be useful to detect foodborne pathogen, L.monocytogenes in foods in the future.