A Study on the Multisulfur Complexes As the Functional Electronic Materials : 기능성 전자재료로서의 다황 화합물에 관한 연구

이하진 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

황을 포함하는 π-전자 주게 화합물로서 페로세닐, 페닐 그리고 티오펜을 포함하는 tetrathiafulvalene (TTF), bis(ethylenedithio)tetrathiafulvalene (ET) 그리고 bis(vinylenedithio)tetrathiafulvalene (VT) 유도체들을 알킬포스파이트를 용매로 사용하는 자체 또는 교차 짝지음 반응에 의해 합성하였으며, 그들의 전하-전달 염에 대한 전기적 특성을 관찰하였다. 이 화합물들의 라디칼 양이온과 전하-전달 염을 합성하였고 온도에 따른 산화형태와 전도도 경향을 살펴보았다. 또한 ET와 VT의 닮음궤도함수 (isolobal) 유사체인 니켈 디티올렌 착화합물, [NiL₂]^n- (L = 리간드 n = 0 또는 1)을 합성하여 X-선 결정구조를 분석하고 전기화학적 특성을 관찰하였다. 이 화합물들의 전구 물질들을 합성하기 위하여 소중합 형태의 디엔체인 1,3-dithiole-2,4,5-trithione, [C₃S_5]_n과 페로세닐, 페닐기를 포함하는 친디엔체를 사용한Diels-Alder 형태의 [2+4] 고리화 첨가반응 및 1,8-diketone의 Lawesson반응을 사용하였다. 1,1'-Diferrocenyl-VT (BFcVT)와 tetraferrocenyl-VT (TFcVT)의 순환 전압-전류 (CV) 측정 시 모두 하나의 가역 곡선을 관찰할 수 있었다. BFcVT의 라디칼 양이온 염 (BFcVT)·(I₃)의 전자상자성 공명분광법과 뫼스바우어 분석결과를 살펴보면 모든 온도 영역에서 VT 부분은 산화되어 라디칼 형태로 존재하지만, 두 개의 페로세닐기는 산화되어 있지 않다. 반면, (BFcVT)H·(BF₄)₄은 모든 온도영역에서 저스핀 철(II), 고스핀 철(II) 그리고 고스핀 철(III)을 포함하는 페로센/페로세늄 혼성계를 이루는 것으로 관찰되었고 온도가 상승함에 따라 고스핀 철(III)의 함량이 증가하였다. (BFcVT)·(I₃)와 (BFcVT)H·(BF₄)의 가압 형태의 전기전도도는 7×10^-3 Ω^-1 ㎝^-1로 관찰되었다. 티오펜을 포함하는 TTF 유도체들의 경우, TTF와 마찬가지로 두 개의 가역적인 산화 전위를 갖는다. 이들 중 하나의 화합물은 π-전자 받게 화합물인 F₄-TCNQ와 1 : 1 전하-전달 염을 이루어 실온에서 0.21 ~ 5.54 Ω^-1 ㎝^-1의 전도도를 보인다. 페로센을 포함하는 니켈-디티올렌 착화합물 [Ni(fcvdt)₂]^1-는 두 개의 페로센이 각각 위, 아래로 향하는 의자형을 이루고 있는 반면, [Ni(dfcvdt)₂]^1-는 네 개의 페로센이 모두 위를 향하고 있는 보트형을 이루고 있다. 페닐기를 포함하는 니켈화합물 (Ph₄P)[Ni(dphdt)₂]에서 Ni(S₂C₂S₂)₂ 부분은 평면 구조를 이루면서 c-축을 따라 쌓여있다. 니켈 착화합물들의 순환 전압-전류 측정에서는 니켈(II) 디티올렌 부분에서의 [NiL₂]^(2-/1-)과 [NiL₂]^(1-/0)의 산화과정에 해당되는 두 개의 가역적인 순환 과정을 관찰 할 수 있었다. 합성된 니켈 화합물들은 1012 nm ~ 1342 nm 영역에서 강한 근적외선의 흡수가 일어났다. 이 결과는 더 낮은 에너지에서 에너지를 흡수하는 infrared dye로서의 가능성을 보여준다. 페로센을 포함하는 2차 비선형 광학 발색단을 갖는 니켈-디티올렌 착화합물 (FcCH=CHPyMe)[NiL₂] (L = dmit, dddt, debt, tmtbt)을 (n-Bu₄N)[NiL₂] 과 FcCH=CHPyMe·I의 양이온 치환반응에 의하여 합성하였다. (FcCH=CHPyMe)[Ni(dmit)₂]의 결정구조에서 [Ni(dmit)₂] 부분과 양이온의 메틸피리디늄 부분이 피리디늄 고리의 중심 바로 위에 니켈 이온과 순차적으로 쌓여있다. 이 화합물은 실온에서 절연체이지만 H-형태의 전기화학 셀에서 합성된 부분 산화물인 (FcCH=CHPyMe)_x[Ni(dmit)₂] (0 < x < 1)은 30 K ~ 300 K의 온도 영역에서 반도체의 (Ea = 106 meV) 거동을 보인다. Sulfur-based π-electron donors such as tetrathiafulvalene (TTF), bis(ethylenedithio)tetrathiafulvalene (ET) and bis(vinylenedithio)tetrathiafulvalene (VT) derivatives containing ferrocenyl, phenyl and thiophene moieties have been successfully prepared by phosphite-based coupling reaction and investigated on the electrical properties of their charge-transfer salts. Nickel dithiolene complexes [NiL₂]^n- (L = ligands, n = 1 or 0) which are isolobal analogues to ET and VT have been synthesized and examined by X-ray crystallography and electrochemical properties. The facile syntheses of precursors of TTF derivatives and ligands were carried out via a Diels-Alder type [4+2] cycloaddition reaction of oligomeric diene (oligo(1,3-dithiole-2,4,5-trithione): [C₃S_5]_n) with the ferrocenyl- or phenyl-substituted dienophiles, and via Lawesson's reaction of 1,8-diketones. Cyclic voltammograms (CV) of 1,1'-diferrocenyl-VT (BFcVT) and tetraferrocenyl-VT (TFcVT) showed one reversible redox peak. According to the temperature-controlled EPR and Mossbauer measurements of (BFcVT)×(I₃), the VT moiety was revealed to be oxidized to a radical while the two ferrocenyl groups were not. On the other hand, a mixed ferrocene/ferrocenium system consisting of low-spin Fe(II), high-spin Fe(II) and high-spin Fe(III) was detected in compound (BFcVT)H×(BF₄)₄ by Mossbauer spectroscopy, in which the content of high-spin Fe(III) increased as temperature was increased. The electrical conductivities of the radical cationic salts ((BFcVT)H×(BF₄)₄ and (BFcVT)×(I₃)) were 7 × 10^-³ Ω^-¹㎝^-¹ in a pressed pellets. CVs of TTF derivatives fused with thiophene moiety showed two-reversible redox peaks similar to TTF. One of them formed an 1 : 1 charge-transfer salt with F₄-TCNQ which exhibited a four-probe electrical conductivity of 0.21 ~ 5.54 Ω^-¹㎝^-¹ at room temperature. In the ferrocenyl-substituted nickel complexes, [Ni(fcvdt)₂]¹- anion has a chair-like conformation with the two ferrocenyl groups folding up and down while the tetraferrocenyl-substituted [Ni(dfcvdt)₂]¹- anion has a boat-like conformation with four ferrocenyl groups folding up. In the molecular structure of tetraphenyl-substituted nickel complex, (Ph₄P)[Ni(dphdt)₂], Ni(S₂C₂S₂)₂ core is planar and stacking along the c-axis. The CVs of nickel bisdithiolene complexes showed two reversible redox peaks associated with the [NiL₂]^(2-/1-) and [NiL₂]^(1-/0). The complexes exhibited a strong near-IR absorption at low-energy region (1012 nm ~ 1342 nm). Nickel bisdithiolene complexes with a ferrocene-containing second order nonlinear optical chromophore as a cation, (FcCH=CHPyMe)[NiL₂] (L = dmit, dddt, debt and tmtbt) have been synthesized by the cation exchange reaction of (n-Bu₄N)[NiL₂] and FcCH=CHPyMe×I. In the crystal structure of (FcCH=CHPyMe)[Ni(dmit)₂], Ni(dmit)₂ unit and the methylpyridinium moiety of the cation are stacking alternatively with nickel ion being just above the center of pyridinium ring. This complex was revealed to be an insulator at room temperature, but (FcCH=CHPyMe)_x[Ni(dmit)₂] (0 < x < 1) grown in an H-type electrochemical cell showed a semiconductor behavior (Ea = 106 meV) over the temperature range measured (30 K ~ 300 K).

Protection of Helicobacter heilmannii Infection by Recombinant Helicobacter pylori Urease : 요소 분해 효소 (Rrecombinant Helicobacter pylori urease)를 백신으로 이용한 돼지 위장병균 (Helicobacter heilmannii) 감염방지 실험

조현주 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

돼지 위장병균인 Helicobacter heilmannii 는 배지 상의 배양이 이루어지지 않음으로 동물에서 동물로 감염시켜 배양되어 왔다. 본 실험에서 돼지 위장병균을 배양하기 위하여 돼지 위 점막과 유사한 상태를 만들고자, 고체 배지 위에 감염 조직을 접종한 후 반 고체배지를 덮는 샌드위치 방법을 고안하였다. 감염 조직을 접종한 샌드위치 배지를 10% 이산화탄소가 충진된 37℃ 배양기에서 7일간 배양한 후, Gram 염색을 하여 광학현미경하에서 돼지 위장병균(H. heilmannii)을 관찰하였다. Koch의 가설에 기초하여, 분리 배양된 돼지 위장병균이 재감염되어 병을 야기하는지 확인하기위해 실험용 쥐에 분리 배양된 돼지 위장병균을 재감염시켰을 때, 감염 일 주일후 위 조직으루부터 돼지 위장병균을 확인하였다. 돼지 위장병균이 감염된 조직으로부터 얻은 bacterial DNA와Heicobacter pylori의 urease A gene을 증폭하는 primer를 사용하여 PCR을 수행했을 때, 411 bp의 전형적인 DNA bend를 얻었다. 또한, urease PCR 산물의 염기서열을 H. pylori의 urease A와 비교했을 때, 돼지 위장 병균이 H. pylori 와 97.98%가 동일한 요소 분해 효소(urease)를 생산하는 것을 알게되었다. 따라서 H. pylori 의 요소 분해 효소를 돼지 위장병균의 백신으로 사용하기 위해 H. pylori 의 요소 분해 효소가 복제된 E. coli BL21/pHU1013으로부터 요소 분해 효소를 순수 분리하였다. 순수 분리를 위해 사용한 column으로는 DEAE 음 이온 분리 크로마토그래피 및 Sephacryl S-200과 Mono-Q이다. 분리된 요소 분해 효소는 176.3 배의 순수 분리도와 18.82%의 수득률을 지니며, 단백질 전기영동을통해 요소 분해 효소의 분자량은 약 97.5 kDa 임을 확인하였다. 분리된 요소 분해 효소는 돼지 위장병균의 감염을 억제하는 백신으로 사용될 때, 점막의 면역반응을 촉진하는 콜레라 독과 함께 실험용 쥐의 입안에 흘려줌으로 면역을 증진 시켰다. 면역 증진은 일 주일 간격으로 5회 실시하였고, 마지막 백신을 투여한 5일 후, 혈장과 변, 침에서 요소 분해 효소에 대한 특정한 면역체계가 잡혔는지 확인하였다. 면역 측정법에 의해 요소 분해 효소에 대한 혈장 안의 IgG와 혈장, 변, 침 각각의 IgA가 증가한 것을 확인한 후, 돼지 위장병균이 감염된 실험용 쥐의 위조직을 갈아 경구 투여함으로 감염시켰다. 감염 1주일 후, 실험용 쥐의 위조직에 돼지 위장병균 감염율을 요소 액체 배지(urea broth)을 이용하여 측정하였을때, H. pylori 의 요소 분해 효소로 면역을 증강 시킨 실험용 쥐의 위 조직을 넣어 반응한 요소 액체 배지(urea broth)에서 발색이 거의 없었다. 이는 H. pylori 의 요소 분해 효소가 돼지 위장병균의 감염율에 영향을 미침을 시사하고 있다. IIn this study, Helicobactger heilmannii was successfuly cultured using a sandwitch method, inoculating between media. Also, when the mice was challenged with cultured H. heilmannii, H. heilmannii infection of murine stomach was observed 1 week after challenge under a light microscope after Gram staining. When a PCR specific to urease A in Helicobacter pylori was performed using DNA isolated from H. heilmannii infected tissue, a 411 base pair fragment was amplified. DNA sequence of this PCR product coincided with the urease A of H. pylori. This result shows that H. heilmannii produces the same urease of H. pylori. Based on this, urease of H. pylori was purified from urease cloned E. coli BL21/pHU1013. Bacterial cells were grown in LB with ampicillin and NiCl2 and collected with centrifugation. Cells were broken in a French pressurized cell. The recombinant urease were purified with DEAE anion exchange column chromatography, Sephacryl S-200, and Mono-Q column chromatography. The recombinant urease was purified 176.3 fold with an yield of 18.82%, and the specific activity was 165.75 μmol/μg. To examine the immune response and the protective efficacy of immunization with recombinant H. pylori urease, CD-1(ICR) mice were orally immunized five times with 50 μg of the purified urease and cholera toxin (10 μg) at weekly intervals. After the final immunization, level of specific IgG in serum and IgA in serum, saliva, and feces were increased. When challenged with homogenate of H. heilmannii infected gstric tissue, mice immunized with urease in the presence of cholera toxin were protected against gastric infection.

Purification and Characterization of the Bi-functional Metalloprotease from Bacillus sp. JH108 : Bacillus sp. JH108이 생산하는 bi-functional metalloprotease의 정제 및 특성 분석

정현주 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

저온 미생물인 Bacillus sp. JH 108이 생산하는 extracellular protease 중 가장 분자량이 작은 metalloprotease를 ammonium sulfate fractionation, anion exchange chromatography, gel filtration chromatography, cation exchange chromatography의 과정을 통해 정제하고 그 특성을 밝혔다. 효소의 분자량은 약 36,000 Da이고, optimum pH와 온도는 각각 pH 8-9와 60℃ 였다. 합성 기질을 이용해 (aminoacyl p-nitroanilide) enzyme이 말단의 leucine을 가수분해하는 leucine aminopetidase와 polypeptides 중간 위치의 leucine을 가수분해하는 endopeptidase의 기능을 같이 가지고 있음을 알아내었다. Leucine aminopeptidase로서의 활성은 metal chelating 시약인 EDTA, 1,10-phenanthroline에 의해서 완전히 저해되었다. EDTA에 의해 활성을 잃은 효소는 Co++ 혹은 Zn++를 첨가해 줌으로써 다시 재활성화 되었다. 따라서 Leucine aminopeptidase로서의 이 효소는 Co++에 의해서 활성화되는 metalloprotease임을 알 수 있다. Leucine endopeptidase로서의 활성은 metal chelating 시약인 EDTA, 1,10-phenanthroline, EGTA에 의해 강하게 저해되었고, serine 잔기에 작용하는 저해제인 PMSF에 의해서는 완전히 저해되었다. EDTA에 의해서 저해된 효소는 Ca++, Co++, Mn++에 의해 재활성화 되었다. 따라서 endopeptidase로서 이 효소는 catalytic 활성에 serine 잔기가 중요한 역할을 하는 Ca++-activating metalloprotease일 것으로 생각되었다. 위의 두 가지 특성으로 보아, 분리된 enzyme은 leucine aminopeptidase와 leucine endopeptidase의 역할을 하는 bi-functional metalloprotease일 것이라고 결론지을 수 있다. An extracellular protease was purified from a psychrotrophic bacteria Bacillus sp. JH108 by ammonium sulfate fractionation of culture medium, DEAE Sephadex A-50 chromatography, Sephacryl S-100 chromatography and CM Sepharose CL-6B chromatography. The enzyme had a molecular weight of 36,000±500 as estimated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and gel filtration chromatography. The optimal pH ranged from 8 to 9 and optimal temperature was 60 degrees C. The enzyme exhibited a specificity for peptide bonds with leucine. This 36,000 Da metalloprotease exhibited both leucine aminopeptidase and endopeptidase activities. Endopeptidase activity was more reactive than aminopeptidase activity, but aminopeptidase activity was distinctly expressed. A Lineweaver -Burk plot of the data indicated that K_m value of aminopeptidase is 0.46 mM and V_max is 0.125 μmol of pNA released/min, and the Km value of endopeptidase is 0.315 mM and V_max is 0.222 μmol of pNA released/min. The aminopeptidase activity was fully inactivated by EDTA and 1,10-phenanthroline. The aminopeptidase activity was stimulated by Co^++. EDTA-inactivating enzyme could be reactivated by 1 mM Co++ and Zn^++. The enzyme contained Zn^++ (1.2 ±0.2 atoms per molecule of enzyme). Therefore, this aminopeptidase seems to be a metallo -protease dependent on Co^++ or Zn^++. The endopeptidase activity was inhibited by metal chelating agents such as EDTA, 1,10-phenanthroline and EGTA and general serine protease inhibitor, PMSF. The endopeptidase activity was stimulated Ca^++, Co^++, Mn^++, Mg^++ and Ni^++. Inhibition by EDTA was reversed by 1 mM Ca^++, thus indicating that the enzyme was calcium dependent metallo-endopeptidase which serine residue involved catalytic activity. Addition of Ca^++ increased the pH and heat stability of endopeptidase activity. These showed that endopeptidase required calcium ions for activity or stability or both. Bestatin showed a competitive inhibitor to both aminopeptidase activity and endopeptidase activity. The Ki value of aminopeptidase is 5.8 μM and endopeptidase is 6.7 μM. This suggests that this metalloprotease have a dual-function, both Co^++-activating aminopeptidase and Ca^++-activating endopeptidase.

Taxonomic Review of the Caenidae, Siphlonuridae, Ameletidae, and Isonychiidae (Insecta: Ephemeroptera) in Korea : 한국산 등딱지하루살이과, 옛하루살이과, 피라미하루살이과, 빗자루하루살이과 (곤충강: 하루살이목)의 분류학적 재검토

황정미 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

하루살이목 중 등딱지하루살이과, 옛하루살이과, 피라미하루살이과, 그리고 빗자루하루살이과는 담수 생태계에 있어서 주요한 수서곤충 분류군에 속하지만, 한국에서는 아직 많은 연구가 되어 있지 않다. 지금까지 상기 분류군중에서는 한국에서 Ameletus costalis (Matsumura), A. montanus Imanishi, Siphlonurus chankae Tshernova, Isonychia japonica (Ulmer) and I. ussurica Bajkova의 3속 5종만이 기록되어 있다. 본 연구에서는 1980년 이후 채집된 유충 및 성충 표본과 실험실 및 야외에서 얻은 표본을 이용하여 분류하였으며, 비교 표본으로는 극동러시아, 중국, 그리고 일본 표본을 이용하였다. 그 결과 신종 3종[Caenis moe n. sp., Caenis tuba n. sp., and Isonychia sp. A], 한국 미기록종 4종[Caenis nishinoae Malzacher, Brachycercus tubulatus Tshernova, Siphlronurus immanis Kluge, and S. palaearcticus Tshernova]을 포함한 5속 12종을 검토하였다. 각 종에 대하여 특징을 기재하였고, 유충의 전체 형태는 half-tone drawings, 유충과 성충의 검색형질은 line-drawings로 묘사하였고, 주사전자현미경(SEM)으로 검색형질을 촬영하였으며, 검색표를 작성하였다. The mayfly families Caenidae, Ameletidae, Siphlonuridae, and Isonychiidae (Insecta: Ephemeroptera) are important aquatic insect groups in freshwater ecosystems, but have not been well studied in Korea. Only five species and three genera in the families were recorded from Korea: Ameletus costalis (Matsumura), A. montanus Imanishi, Siphlonurus chankae Tshernova, Isonychia japonica (Ulmer) and I. ussurica Bajkova. In this thesis, I reviewed the families based on larval and adult materials (part of them reared) collected throughout Korea since 1980s. Reference materials from Russian Far East, China, and Japan were also examined. As result, 12 species and five genera in the families were recognized including three new species, Caenis moe n. sp., Caenis tuba n. sp., and Isonychia sp. A, and four new Korean records, Caenis nishinoae Malzacher, Brachycercus tubulatus Tshernova, Siphlronurus immanis Kluge, and S. palaearcticus Tshernova. For each species, full descriptions for known stages were provided with larval habitus by half-tone drawings, line-drawings of key characters, and SEM photographs.

Phylogenetic Analysis of Oriental Cymbidium : 동양란 심비디움의 유전 계통 분석

최선희 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

심비디움은 생육습성에 따라, 온대성 난과 아열대성 난으로 분류가 가능하다. 한국, 중국, 대만과 일본 등지에서 자생하는 동양란 심비디움 분류의 기초자료로 활용되는 계통분석에 목적을 두고 분자유전학적 실험을 수행하였다. 18개의 동양란 심비디움을 유전적으로 분석하고, 종간, 종내 수준에서 동정 가능성을 알아보기 위해 Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) 방법과 nuclear ribosomal DNA (rDNA) 염기서열 비교방법을 이용하였다. 동양란 심비디움의 rDNA가, 다른 모든 식물이 포함하고 있는 18S 와 ITS (ITS1, ITS2, 5.8S)부분의 염기서열을 결정하여, 이들의 유전적 유연관계 분석을 시도하였다. 22개의 primer를 이용한 RAPD 분석은 유전자 증폭된 DNA 다형화 밴드의 상이성으로 각 식물에 따른 특이한 결과가 관측되었다. RAPD를 이용한 동양란 심비디움의 유전적 계통분석에서, 열대성 심비디움인 Cymbidium aloifolium, Cymbidium insigne, Cymbidium lowianum은 다른 동양란들과 유연 관계가 멀었을 뿐만 아니라, 같은 그룹을 형성하지도 않았다. 잎의 형태가 타원의 피침형인 죽백란 계통도 다른 동양란들과는 집단화 되지 않았다. 또한, 일경일화성인 동양란과 일경다화성인 동양란은 집단으로 분류가 가능하였다. UPGMA분석을 통한 유사도는 0.701에서 0.847로 나타났으며, RAPD를 이용한 동양란 분류는 형태에 기초한 전통적인 계통도와 대체로 일치하였다. 동양란의 RAPD 결과는 다른 식물종이나, 종간의 유연 관계 분석 시 유용하게 적용되리라 사료된다. 핵내 리보솜을 생성하는 유전자인 rDNA의 염기서열은 유전적으로 잘 보존된 부분인 18S와 변이가 많은 ITS의 염기 서열 결정을 통해, 유연 관계를 추정하는 목적에 이용된다. 18S와 ITS rDNA 염기서열을 통한 동양란 심비디움의 유연 관계를 RAPD와 기존 분류방법으로 비교하였다. 21개 심비디움의 18S 와 ITS rDNA 부분은 PCR 방법을 이용 하여 증폭하고, 대장균 내로 형질 전환시켜 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열들은 다중 정렬방식에 의한 염기 서열들 간 비교를 하였고, 18S 부분의 유사도 백분율은 99.2%에서 100%로 종이 다른 심비디움들 간에도 유전적으로 변이가 거의 없음을 확인하였다. ITS 부분의 유사도 백분율은 Cymbidium alofolium과 용암소심 사이의 70.1%에서부터, Cymbidium insigne와 Cymbidium lowianum간의 99.9%에 이르기까지 염기서열의 변이가 RAPD나 18S rDNA 염기서열 분석에 비해 매우 가변성이 큰 수치를 나타냈다. ITS 부분의 염기의 길이도 다양한 양상이었는데, 이는 변이가 심한 ITS 염기의 삭제 및 삽입 기작에 의한 것이라 추정된다. ITS rDNA 의 염기서열을 이용한 심비디움의 유연 관계 분석은 RAPD나 기존의 분류기준의 관점으로 보면, 일치하지 않는 부분들이 존재하나, 이는 진화적으로 매우 고속으로 진행되는 ITS 부분의 염기서열 분석을 통해, 식물의 유전자 이동에 관한 정보를 획득할 수 있으리라 사료된다. Classification of Oriental cymbidiums native to Korea, China, Taiwan, and Japan was reexamined by molecular analyses. Totally twenty one cymbidiums including eighteen Oriental cymbidiums were analyzed to identify in the interspecific and intraspecific levels by using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and nuclear ribosomal DNA (rDNA). Nucleotide sequences of the orchids rDNA including 18S and internal transcribed region (ITS1, ITS2, and 5.8S) were determined and analyzed in order to address their genetic relationship. Cymbidium can be divided into two sections based upon growth form. One is temperate type spread in Asian temperate zone, and the other is subtropical type. In RAPD analysis twenty two primers distinguished all species and cultivars by comparing differences in DNA banding patterns. The unweighted pair group method with arithmetic average (UPGMA) analysis method was used to construct a similarity matrix, and the value ranged from 0.701 to 0.847. Phylogenetic tree analysis of twenty one cymbidiums using RAPD technique identified specific groupings. Group comprised of subtropical cymbidiums (C. aloifoilum, C. insigne and C. lowianum) was distinct from other clusters. C. lancifolium and C. aspidistrifolium having peculiar phenotype clustered separately from plain Oriental cymbidiums. Morphological characters were fully congruent with the well-supported groups identified in the RAPD analysis, and the phylogenetic tree arose from RAPD resulted in similar taxonomy compared to that of traditional classification. RAPD markers, because of their greater variability, seems to provide a useful alternative to isozyme marker for assessing diversity in rare species and for determining relationships among the species. Phylogenetic tree analysis using nuclear rDNA nucleotide sequence data of twenty one cymbidiums were investigated to obtain genetic information, and compare genetic relationship to those of RAPD and traditional classification. Nuclear rDNA came from 18S and ITS region of twenty one species and cultivars of genus Cymbidium were amplified by the polymerase chain reaction and their nucleotide sequences were determined. Determined nucleotide sequences were compared to analyze their relationship by pair-wise multiple alignment. Percent similarity of 18S rDNA of twenty one cymbidiums ranged from 99.2 between C. ensifolium and C. aloifolium to 100 among C. gyokuchin `Cholgolsosim', C. gyokuchin `Kwanumsosim', C. kanran (native to China), and C. kanran (native to Taiwan). The percent of divergence ranged from zero among C. gyokuchin `Cholgolsosim', C. gyokuchin `Kwanumsosim', C. kanran (native to China), C. kanran (native to Taiwan), and C. goeringii (native to Ulung Island) to 0.9 between C. aloifolium and C. ensifolium. Four restriction endonucleases were used in cut of the amplified conserved sequence of 18S rDNA in twenty one cymbidiums. Because the RFLP analysis in 18S rDNA detected high conservation, phylogenetically informative character was not remarkable. In ITS region analysis, the length of the ITS1, ITS2 and 5.8S regions varied from 189 bp to 236 bp and from 224 bp to 260bp, and from 144 bp to 166 bp, respectively. Sequence similarity at these sites ranged from 70.1% between C. lowianum and C. gyokuchin `Yongamsosim' to 99.9% between C. insigne and C. lowianum. In conclusion, ITS rDNA was very heterogenous region among all cymbidiums, but 18S was conserved. In other words, it was informative to detect genetic background. The data acquired from the results of RAPD and rDNA analyses can be applied for rapid, accurate and inexpensive identification and patent protection for other orchids genus as well as cymbidiums.

Systematics and Ecology of the genus Hydropsyche (Insecta: Trichoptera: Hydropsychidae) in Korea : 한국산 줄날도래속 (곤충강: 날도래목: 줄날도래과)의 분류 및 생태

허준미 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

거름섭식작용을 하는 수서곤충인 줄날도래속은 우리나라의 하천에 풍부하게 서식하는 수서곤충으로서 그들은 우리나라 하천에 널리 분포하고 있으나 주로 오염된 도시 근교하천에서 볼 수 있다. 줄날도래류는 생태학적으로나 환경학적으로 매우 중요하지만, 그들의 유충과 성충 관계 그리고 생태에 관한 연구는 아직 미비한 실정이다. 본 논문에서는 우리나라에 대표적인 3종의 줄날도래류인 동양줄날도래(Hydropsyche KUe: H. orientalis), 줄날도래(Hydropsyche KUa: H. kozhantschikovi), 흰점줄날도래(Hydropsyche KUc: H. valvata)의 유충과 성충 관계를 사육실험과 종합적인 표본관찰에 의해 밝혔다. 각 종의 미성숙 단계와 성충 단계를 기재하였고, 검색형질은 line-drawing과 주사전자현미경으로 촬영하였다. 동양줄날도래와 줄날도래의 개체군에 대하여 온도에 관련된 생활사, 즉 개체군 변동, 유충 성장 및 우화양상을 경기도 가평천과 왕숙천에서 1998년 3월부터 1999년 6월까지 조사하였다. The net-spinning caddisfly genus Hydropsyche is one of the most abundant aquatic insect groups in streams in Korea. They inhibit in a wide range of stream habitats but most abundant in moderately polluted rural streams. Despite of their ecological and environmental importances, their larval-adult relationships and ecology have not been well studied. In this thesis, larval-adult relationships of three common hydropsychid caddisflies, H. orientalis (= Hydropsyche KUe), H. kozhantschikovi (= Hydropsyche KUa), and H. valvata (= Hydropsyche KUc) were clarified by rearing experiments as well as by comprehensive materials examinations. Their immature and adult stages were described, illustrated, and photographed with SEM. For the populations of H. orientalis and H. kozhantschikovi, temperature- related life histories, including population dynamics, larval development, and emergence pattern, were investigated from the Kapyong creek and the Wangsuk creek, respectively, in Kyonggi-do from March 1998 to June 1999.

Characterization of Norfloxacin Resistance in The Clinical Isolates of Escherichia coli : Escherichia coli 임상균주의 Norfloxacin 내성기전

오유정 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

Norfloxacin 내성정도가 다양한 28개 Escherichia coli 임상균주에 대하여 이들의 norfloxacin 내성기전을 연구하고 또한 이들의 상호 연관 관계를 연구하였다. MIC값이 2 ㎍/㎖보다 적은 12개 균주는 gyrA와 parC의 퀴놀론 내성 결정부위 (QRDR)에 돌연변이가 없는 것으로 나타났다. MIC값이 4 ㎍/㎖인 균주는 gyrA에 Ser83Leu의 돌연변이 한 개를 가지고 있었으며, parC는 변화하지 않았다. MIC값이 8 ㎍/㎖인 균주는 gyrA에 Ser83Leu와 Asp87Asn 두개의 변이와 parC에서 Glu84Lys 돌연변이를 가지고 있는 것이 발견되었다. MIC값이 16 ㎍/㎖ 이상인 균주는 대부분 gyrA에서 Ser83Leu와 Asp87Asn 두개의 돌연변이와 parC에서 Ser80Ile 한 개의 변이부위를 가지고 있으나 5개 균주의 경우 gyrA에서 Asp87Gly 혹은 Asp87Tyr의 돌연변이를 가지고 있었고 또 11번 균주는 gyrA에 Ser83Leu와 Asp87Asn에 변이부위와 parC의 Ser80Ile 돌연변이는 물론 Ala108Thr 돌연변이를 가지고 있었다. MIC값이 32 ㎍/㎖ 이상인 내성균주는 감수성 균주보다 높은 efflux 활성을 보였다. 본 연구에 사용한 임상균주들은 RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA)를 통하여 감수성 균주(MICs < 0.25 ㎍/㎖)와 내성 균주(MICs > 32 ㎍/㎖)가 각기 다른 두가지 그룹으로 분류되었다. 반면 중간내성 균주(0.25 ㎍/㎖ < MICs < 32 ㎍/㎖)의 경우는 어느 그룹으로도 명확히 분류되지 않은 것으로 보아 그 기원이 감수성 혹은 내성 균주와는 다를 것으로 생각된다. Characterization of norfloxacin resistant mechanism of twenty eight clinical isolates of Escherichia coli was studied. Twelve isolates with MICs less than 2 ㎍/㎖ did not show any mutation in either gyrA or parC. Isolates with MIC of 4 ㎍/㎖ had one mutation at Ser83Leu in gyrA but not in parC. Isolates with MICs higher than 8 ㎍/㎖ had mutations in both genes. Isolates with MICs higher than 16 ㎍/㎖ had the same three mutations, two mutations at Ser83Leu and Asp87Asn (or Gly or Tyr) in gyrA and one mutation at Ser80Ile in parC. Resistant isolates with MICs higher than 32㎍/㎖ showed higher efflux activity than the susceptible strains. Isolates could be grouped using Random Amplification of Polymorphic DNA(RAPD) and the resistant and susceptible isolates showed a close relation to each other within each group while the intermediately resistant strains could not be clearly grouped together.

Expression and characterization of recombinant human ATⅢ in chinese hamster ovary cell using novel vector system : CHO cell에서 새로운 벡터 시스템을 이용한 재조합 ATⅢ의 발현과 특성

오선모 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

Antithrombin Ⅲ (ATⅢ)는 간에서 생성되는 단백질로 thrombin을 비롯한 혈액응고에 관련된 보조인자들을 억제하는 기능을 가지고 있다. 이들은 432개의 아미노산으로 구성되어 있으며 이 중 4개의 asparagine에는 N-glycosylation이 형성되어 ATⅢ 단백질이 활성화된 형태를 갖는데 중요한 역할을 한다. 활성화된 형태의 ATⅢ 단백질을 얻기 위해 인간의 혈장에 존재하는 ATⅢ와 유사한 glycosylation을 형성하는 Chinese hamster ovary 세포주에서dehydrofolatereductase (DHFR)-methotraxate(MTX) 를 이용한 유전자증폭 시스템을 사용하여 재조합 ATⅢ 단백질을 생산하였다. 더 나아가 재조합 단백질 생산의 효율을 더욱 높이기 위하여 matrix attatchment region element를 삽입한 새로운 pMSG 벡터를 이용하여 유전자를 도입하였다. 처음 으로 선발된 pMSG-ATⅢ 클론들의 생산량은 대조군인 pSV-ATⅢ의 클론들의 생산량보다 10배 높았다. 여러 클론 중 가장 높은 발현량을 보이는 클론을 선발하기 위해 MTX의 농도를 점진적으로 높여주면서 각각의 클론의 ATⅢ 단백질량을 측정한 결과 18번 클론이 선택되었다. 유전자 증폭의 최종 단계에서 18번 클론의 발현량은 10 μg/ml/106 이었고 이 때 유전자의 copy 수는 100 copy 였다. 여기에 sodium butyrate를 배지에 첨가한 결과 생산량은 더욱 증가하였다. 이온교환수지, 헤파린친화성수지를 이용한 세 단계의 정제 과정을 통해 18번 클론의 배양상층액으로부터 재조합 ATⅢ 단백질을 정제하였으며 정제된 ATⅢ 단백질은 95% 이상의 동질성을 보였다. 최종적으로 N-terminal sequencing과 glycosidase 효소 분해의 결과를 통해 본 시스템에서 생산된 ATⅢ 단백질이 인간의 혈장에 존재하는 ATⅢ 단백질과 유사한, 활성화된 형태의 단백질임을 확인하였다. Antithrombin Ⅲ (ATⅢ) is single-chain plasma glycoprotein synthesized in the liver which inhibits thrombin and other serine proteases including factor IXa, Xa, XIa, and XIIa involved in blood coagulation. This reaction is accelerated up to several thousand fold by heparin. The ATⅢ is protein of 432 residues and four N-linked carbohydrate moieties comprising 9% of the molecule by weight. The N-glycosylation of ATⅢ plays important role to make active form. Chinese hamster ovary (CHO) cells has been used commonly to produce therapeutically useful recombinant proteins including ATⅢ by gene amplification system using dehydrofolate reductase (DHFR) and methotraxate (MTX). The expression of recombinant human ATⅢ (rh-ATⅢ) is investigated in this report to archive active proteins in high level by using recently developed pMSG vector system. The yield of pMSG-ATⅢ clones was tenfold higher than that of pSV-ATⅢ clones in initial screening. Individual clones were selected for amplification by increasing concentration of MTX. The pMSG-ATⅢ-18 clone was picked up by having the highest expression level and by maintaining the proper growth properties. The production rate of rh-ATⅢ from this clone was 10 μg/ml/106 cells and the copy number of the introduced ATⅢ was about 100 copies per cell. Furthermore, in order to increase yield of rh-ATⅢ from pMSG-ATⅢ-18 clone, sodium butyrate was treated in culture medium and the final yield was increased significantly. From culture supernatant of pMSG-ATⅢ-18 clone, rh-ATⅢ proteins were purified through three round of purification steps using ion exchange and heparin-affinity chromatography. The rh-ATⅢ was purified highly into over 95% homogeneity and that contained full biological function. The purified rh-ATⅢ was also verified by N-terminal sequencing and various glycosidase digestions and compared to human plasma derived ATⅢ.

Regulation of cytokine gene expression and signaling pathway by gamma irradiation : The effect of Ginsan on the polarized Th2 immune response by gamma irradiation방사선에 의한 = 면역세포의 싸이토카인 유전자 발현 조절과 신호 전달에 관한 연구 : 진산의 면역조절

한선규 Graduate school, Seoul Women's University 2000 국내박사

T helper (Th) cells can be divided into two types, depending on the secretion pattern of cytokines. Th1 cells secrete IL-2 and IFN-γ, whereas Th2 cells secrete IL-4, IL-5, IL-6 and IL-10. Th1 (type 1) response promotes cell-mediated immunity that relieves infection and promotes tumoricidal activity. In contrast, Th2 (type 2) response is characterized by a progressive infection and promotion of humoral immunity. Gamma radiation triggers a variety of physiologic responses in mammalian cells, including immunosuppressive potential and inflammation. But immunosuppressive potential of gamma radiation is not yet well understood. To clarify the effect of gamma radiation on immune function of murine splenocytes, the mRNA expression of cytokines was examined using semi-quantitative RT-PCR method. The mRNA levels of IFN-γ and IL-12 were reduced at 3 hours and 30 min after gamma irradiation, respectively. IL-2 synthesis in naive splenocytes was not significantly changed within 24 hours after irradiation. Th1 type cyto, IFN-γ and IL-2, mRNA expressions of Con A activated-splenocytes (2.5 ㎍ per 1×10^5cells) were significantly reduced by gamma irradiation as compared to non-irradiated splenocytes. However, the synthesis of Th2 type cytokines such as IL-4, IL-5 and IL-10, was rapidly induced both in naive and activated splenocytes. We also observed up-regulation of GM-CSF, TNF-α, and IL-1β, but no difference of TGF-β mRNA level by gamma irradiation. Therefore, it was suggested that gamma irradiation differentially regulated the Th1 and Th2 type cytokine gene expression, and affected the balance of Th1/Th2 immune response. The mRNA levels of c-Maf and GATA-3 that was regulated IL-4 and IL-5 transcription were rapidly induced, while that of interferon regulatory factor (IRF)-1 involved in Th1 response was reduced 6 hours after irradiation. These results were correlated well with IL-5 and IFN-γ cytokine gene expression based on the time kinetics, respectively. The phosphorylation of Stat-1 related to IFN-γ signaling was significantly reduced by gamma irradiation, and Stat-4 activation by IL-12 stimulation was also reduced. However, the phosphorylation of Stat-6 related to IL-4 signaling was not altered by gamma irradiation. Therefore, gamma irradiation did not directly interfere with IL-4 receptor function on the cell membrane, but influenced the level of transcription factors, GATA-3 and c-Maf, by a cytokine receptor independent mechanism. In accordance with the reduction of Th1 type cytokines involving IFN-γ and IL-2, and related transcription factor such as IRF-1, the inhibition of Th1 immune response was observed in the allogenic MLR data. Therefore, it was evident that the immunosuppressive potential of gamma irradiation was due to the differential regulation of Th1 and Th2 cytokine gene expression. To improve the immunosuppressive effects of gamma irradiation, we used Ginsan extracted from Panax ginseng. Ginsan induced Th1, Th2 and proinflammatory cytokine expressions in vitro, and improved the reduction of Th1 type cytokine expression by gamma irradiation in vivo. The reduction of Th1 immune response by gamma irradiation was also recovered up to 2-fold in the allogenic MLR data. The immune stimulating effect of Ginsan was not observed in the control group, so we suggested Ginsan as a good candidate of immune modulator for the improvement of immunosuppressive effects of gamma irradiation.

Epidemiology of shrimp viral disease in Panaeus japonicus : 바이러스에 의한 새우 질병의 역학적 연구

신은주 Graduate school, Seoul Women's University 1999 국내박사

1993년부터 한국의 남, 서해에 위치한 새우 양식장으로부터 양식 새우의 대량 폐사가 보고되고 있다. 이는 1992년의 대만의 새우 양식 피해, 1993년 일본에서 발생한 보리새우(Paeneus japonicus)의 대량 폐사로 미루어 볼 때 이곳에서의 발병원인인 대만바이러스 (WSBV)나 일본 바이러스 (RV-PJ)와 밀접한 연관이 있으리라 짐작된다. 이들 바이러스 질환과 우리 나라에서 발병하여 대량 폐사로 이어지는 새우질병은 특히 우리 나라 새우 양식에 필요한 대부분의 알과 치하를 일본에서 수입하므로 수입유충, 양식중인 새우 그리고 모하 모두에서 바이러스 오염의 빠른 진단이 요구되고 있다. 1998년부터 1999년 사이에 여러 양식장으로부터 의뢰된 새우를 증세의 유무에 따라 구별하여 전자현미경에 의한 핵내 봉입체 관찰, PCR을 이용한 바이러스의 DNA 증폭, PCR에서 얻은 DNA를 이용하여 만든 probe를 이용한 방울점 교잡법(dot blot hybridization)등으로 감염여부를 확인하였다. 신속한 진단을 위하여 시험에 사용한 DNA는 소량의 새우 시료를 mini bead beater로 파쇄하여 얻은 crude homogenate를 사용하였다. PCR과 방울점 교잡법을 위해서 사용한 DNA농도는 항상 판별가능 농도보다 높게 사용하여 시험하였다. 이들의 민감도와 특이성을 비교하였을 때 PCR이 가장 높았으며 또한 PCR은 적은 량의 시료로 준비한 소량의 DNA로부터 약 5시간 안에 결과를 얻을 수 있었다. 반면에 방울점 교잡법은 특별한 기구 없이 몇 번의 완충액의 교환으로 시험하는 장점이 있으나 결과의 판독에 2일이 소요되고 민감도와 특이성 모두 PCR에 못 미친다. 또한 전자현미경에 의한 핵내 봉입체 관찰은 유충이나 크기가 작은 새우에서는 가능하지 않았으며 두 가지 바이러스의 구별도 불가능하다. 따라서 이들 작은 크기의 새우의 경우 PCR이 가장 좋은 진단 방법이라고 확인되었다. 본 실험에서는 1998년의 증세를 보인 새우시료에서는 33%, 11%가 RV-PJ, WSBV에 감염되고 55%가 두 가지 모두에 감염되었음을 나타내었다. 또한 1999년에 의뢰된 새우 시료 중 증세를 갖는 36%의 새우가 RV-PJ에 감염되고 50%가 RV-PJ와 WSBV모두에 감염되었음을 나타내어 우리 나라에 수입되는 알과 유충의 검색 및 이들 바이러스가 국내에 토착화되어 있는지 검색할 필요가 있겠다. In 1993, the mortality of the penaeid shrimp cultured in the south and east sea of Korea has increased massively to a point where the shrimp industry was threatened due to the lack of the disease control. Since more than 30% of shrimp eggs in Korea is imported from Japan and Taiwan, there is a great possibility of contamination from Rod Shaped Nuclear Virus (RV-PJ) in Japan and White Spot Baculovirus (WSBV) in Taiwan. Various kinds of crutaceans are considered as carriers which spread such viral disease wherever they go. For these reasons, a rapid and facile diagnosis of the viral disease in shrimp is required. Two different kinds of detection method were developed in this study. One was a faster PCR using DNA prepared from the crude homogenate of shrimps and the other was a dot blot hybridization method using biotin labeled PCR products of RV-PJ and WSBV. When penaeid shrimps were collected in several shrimp farms from 1998 to 1999, they were examined with an electron microscopy, PCR, and dot blot hybridization. A PCR with the rapid purification method was turned out to be the most sensitive and rapid method to detect the virus. A PCR method took 5 h while dot blot hybridization took 2 days. It provided the knowledge of DNA based batch screening for multiple samples of diseased shrimps by small scale of DNA purification. When shrimps were screened with these methods, 33%, 11%, and 55% of diseased shrimps in 1998 were found out to be infected with RV-PJ, WSBV, and both virus, respectively. In 1999, 36% and 50% of diseased shrimps were infected with only RV-PJ and both virus while infection with only WSBV was not observed, showing shrimps cultured in Korea are infected or contaminated from both virus.