Heterologous expression of B. Subtilis protoporphyrinogen oxidase in E. coli

Kim, Myojoung Chonnam National Univ. Graduate School 1999 국내석사

The Implementation of Smart Home System Based on 3G and ZigBee in Wireless Network System

Liu Dan Chonnam National Univ. 2012 국내석사

Characterization of yliH gene in Salmonella enterica serovar typhimurium

박경화 Chonnam National Univ. 2007 국내박사

Salmonella typhimurium 14028s의 DNA microarray에서 yliH 유전자가 대수발육기에 비하여 생장정지기에 25배 이상 많이 발현되는 것을 관찰하였다. 최근 발표된 논문에 따르면 Escherchia coli에서는 yliH 유전자가 biofilm형성을 조절하는 것으로 보고되었다. 그러나 Salmonella typhimurium에서 yliH 유전자의 특성은 아직 규명되지 않았다. 먼저 S. enterica serovar typhimurium와 E. coli에서 yliH 유전자의 상동성을 조사하였고 76% 일치함을 발견하였다. 저자는 S. typhimurium에서 yliH 유전자의 역할을 알아보고 분자생물학적 특성을 규명하고자 하였다. 유전자 lacZ가 yliH 유전자의 promoter 부위하단에 연계된 (yliHp-lacZ) 리포터 플라스미드를 함유하는 S. typhimurium을 제조하고 b-galactosidase 활성을 이용하여 yliH의 발현양상을 조사하였다. yliH 유전자 발현은 생장정지기 sigma factor인 rpoS 의 영향은 받지 않고 긴축반응시 증가하는 ppGpp에 의해 조절되어짐을 관찰하였다. 유전자 yliH의 기능을 밝히기 위해 gene disruption technique을 이용하여 yliH 유전자가 기능을 하지 못하는 돌연변이 균을 제작하였으며 이 균주는 야생형과 성장 속도는 비슷함을 관찰하였으나 변이균의 운동성은 야생형에 비해 저하됨을 관찰하였고 장내 부착능도 감소됨을 관찰하였다. 야생형과 변이균의 생물막 형성은 미미하여 yliH 유전자가 생물막형성에 미치는 영향은 불확실하였다. Salmonella Typhimurium remains the most frequently isolated in human salmonellosis and can cause a systemic, typhoid-like disease in mice. Complete genome sequence of S. typhimurium has been determined. YliH is uncharacterized protein in Salmonella , which was found to be induced at the stationary phase of growth as determined by DNA microarray analysis. We further analyzed regulation of yliH expression and the phenotype of the mutant defective in yliH gene. The yliH gene is composed of 381 base-pair nucleotide. The overall amino acid sequence revealed 76.38% amino acid identity and 88.98% similarity with E. coli yliH. To examine the regulation of yliH expression at the molecular level, we constructed yliHp-lacZ fusion in plasmid and analyzed its activity in various mutant backgrounds. yliH was found to be induced ~25-fold at the entry of stationary phase in wild type (WT) Salmonella. This induction of yliH expression was not dependent on the stationary phase sigma factor σ38,but dependent on stringent signal molecule, ppGpp and its putative mediator, dksA. It was interpreted to mean that stationary phase gene induction may require reduction of stable RNA gene expression by ppGpp, which should allow RNA polymerase to be engaged in the transcription of stationary phase inducible genes. Alternatively, stationary phase gene induction may be achieved directly by the conserted action of ppGpp, DksA, and other component. To examine the role of the yliH gene in S. typhimurium, we constructed yliH mutant strain in S. typhimurium 14028s background and evaluated the growth rate, motility, adhesion, invasion, lethality, and biofilm formation. yliH mutant was 60% less lethal than WT as determined using BalB/c mice. yliH mutant showed decrease in motility and adherence to intestinal mucosa in comparison with WT Salmonella. However, invasion into HEp-2 cell of hepatic origin was indifferent between WT and the mutant. Neither WT nor yliH mutant formed a detectable biofilm.

Synergistic interaction of thalidomide and morphine in antiallodynic effect on spinal nerve ligation-induced pain in rat

이형곤 Chonnam National Univ. 2008 국내박사

Background: Thalidomide, tumor necrosis factor (TNF)-α inhibitor, has shown antinociceptive effects. The antinociceptive effect of morphine has been debatable in terms of neuropathic pain. The aim of this study was to investigate the effect of thalidomide and morphine in neuropathic pain. In addition, the characteristics of interaction between thalidomide and morphine were examined. Materials and Methods: Sprague-Dawey male rats weighing 100-120g were used. Neuropathic pain was induced by lumbar spinal nerve ligation (L5,6). Thalidomide (6.25, 12.5, 25, 50 mg/kg) and morphine (3, 10, 30 mg/kg) were injected intraperitoneally,and 50% probability paw withdrawal threshold (PWT) was determined with von Frey test. Isobolographic analysis was performed to determine the interaction between morphine and thalidomide. Results: Both drugs significantly reduced the paw withdrawal threshold in a dose-dependent manner. ED50 (95% confidence interval) values of thalidomide and morphine were 15.2 (11.7-19.8) mg/kg or 5.2 (3.7-7.4) mg/kg, respectively. An isobolographic analysis showed a synergistic interaction between thalidomide and morphine with total fractional value 0.04. Conclusion: Thalidomide has an antiallodynic effect in neuropathic pain induced by spinal nerve ligation in rats, and synergistically acts with morphine. The synergism produced by morphine and thalidomide could serve asan alternative method in the clinical use of cytokine-modulating drugs for the treatment of neuropathic pain. 연구배경: Thalidomide는 일부 피부질환, 혈액 종양 , 만성 염증성 질환 등에서 엄격한 제한 하에 사용되어오고 있다. Thalidomide 작용의 정확한 기전은 밝혀져 있지는 않지만 주 효과는 종양괴사인자(tumor necrosis factor)의 생성억제이다. 신경계의 교세포에서 분비되는 종양괴사인자는 신경병통증의 주 원인기전인 신경접합부의 가소성과 연관이 있으며, 신경세포에 직접 또는 간접적으로 작용을 하여 신경감작 등과 같이 신경세포의 활성을 증가시킨다. 몇몇 보고들에 의하면 thalidomide는 염증성 또는 신경병 통증 모형에서 항침해 효과를 보인다. 또한 교세포는 morphine의 진통작용이나 내성 발현에도 관련이 있음이 밝혀졌으며, 신경병통증과 morphine의 내성 발현의 기전에 공통점이 있으며 그 기전의 주요 역할이 교세포 및 종양괴사인자와 같은 염증매개물질에 의해 이루어진다. 본 연구는 쥐의 척수신경결찰 모형에서의 thalidomide의 효과를 조사하고 thalidomide와 morphine의 상호작용을 평가하였다. 방법: 100-120g의 쥐를 대상으로 무작위로 대조군, thalidomide, morphine군으로 나누고 척수신경결찰을 한 후 11일째 실험을 시행하였다. 각 약물의 용량 반응을 조사하기 위해 thalidomide 6.25, 12.5, 25, 50mg/kg와 morphine 3, 10, 30mg/kg를 복강내로 주입 30분 후 von Frey test를 시행하여 평가하였고 약물의 상호작용을 평가하기 위해 isobolographic analysis를 시행하였다. 결과: 두 가지 약제 모두 대조군에 비해 의의 있게 회피 역치를 용량 의존적으로 억제하였다. 각각의 ED50은 thalidomide 15.2(11.7-19.8)mg/kg, morphine 5.2(3.7-7.4)mg/kg 이었다. Isobolographic 분석상 total fraction value 0.04로 항이질통 효과에 있어서 morphine과 thalidomide는 상승작용을 보였다. 결론: Thalidomide는 쥐의 척수신경 결찰에 의한 신경병성 통증 모델에서 항이질통 효과를 보였으며 morphine과 상승작용 효과를 보였다. Thalidomide의 morphine과의 상승작용은 Thalidomide와 같은 염증매개물질 억제 치료제를 통증 영역에서 적용하는 경우 단독 사용 시의 부작용을 억제하는 방법의 하나로 제시될 수 있을 것이다.

Anticancer activity of PEGylated matrix metalloproteinase cleavable peptide-conjugated adriamycin against brain tumor cell

임승호 Chonnam National Univ. 2007 국내박사

Although matrix metalloproteinases (MMPs) play a crucial role in the invasion and growth of malignant gliomas, their increased activity in tumor environment can be used as a specific target for chemotherapy. The author investigated whether polymer-drug conjugates formed via MMP-cleavable peptide linkages could provide MMP-responsive tumor targeting and cytotoxicity for malignant glioma cells. One end of an MMP-cleavable peptide was attached to the end of methoxy polyethylene glycol (MPEG) while the other end was attached to adriamycin (ADR). The release of drugs in the presence of conditioned media of U87MG cells was investigated. The cytotoxicities of the MMP-cleavable MPEG-peptide-ADR (PPA) conjugates and non cleavable MPEG-ADR (PA) conjugates were investigated using U87MG cells. The 1H nuclear magnetic resonance (NMR) spectra confirmed the conjugation of the two ends of the peptide to the ends of MPEG and ADR, respectively. Gelatin zymography showed that MMP-2 was strongly expressed in the media of U87MG cells. The PA conjugate did not release ADR either in the phosphate buffered saline (PBS) or conditioned media of U87MG cells. The PPA conjugate released ADR in the presence of the conditioned media of U87MG cells, but not in PBS only. In the cytotoxicity test using U87MG cells, ADR and PPA conjugate showed similar antiproliferative activities, while the cytotoxicity of PA conjugate was lower than that of ADR. Considering that the cytotoxicity of the PPA conjugate was similar to that of ADR, MMP-cleavable polymer-drug conjugates can be used as targeting carriers for the purpose of inhibiting the proliferation of malignant glioma cells. 뇌종양은 주로 암세포의 국부침윤에 의한 종양의 확산이 치사율을 높이는 주요인으로 알려져 있다. Matrix metalloproteinases (MMP)-2 와 9는 암세포의 침윤과 전이 성장에 결정적인 역할을 하는 효소 중 하나로 알려져 있다. 그러므로 침윤을 억제할 수 있는 항암제의 개발이 뇌종양의 치료에 중요하다. MMP-분해성 펩타이드 연결을 이용한 고분자약물의 개발은 항암제의 MMP 반응성 암표적화가 가능하므로 뇌종양의 침윤을 효과적으로 억제할 수 있을 것이다. MMP 반응성 고분자 약물을 합성하기 위해 MMP-분해성 펩타이드(Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly)를 MPEG에 공유결합시키고 항암제인 아드리아마이신을 펩타이드에 공유결합시켰다. MMP 비반응성 고분자약물을 만들기 위해 MPEG에 아드리아마이신을 공유결합시켰다. U87MG 세포로부터 추출한 MMP를 첨가하여 약물 방출 실험을 하였다. 또한, MMP 반응성 MPEG-peptide-ADR 공유결합체 (PPA) 와 MMP 비반응성 MPEG-ADR 공유결합체 (PA)의 세포 독성을 각각 U87MG 세포에 대하여 비교하였다. 1H NMR 스펙트라를 통하여 펩타이드가 MPEG의 말단에 공유결합 되었으며 아드리아마이신이 펩타이드의 말단에 합성되었음을 확인하였다. 젤라틴 자이모그라피 결과 U87MG 세포의 배지에서 MMP-2가 가장 강하게 발현되었으며 다른 세포에서는 약하거나 거의 발현되지 않았으며 세포 자체에서는 거의 발현되지 않았다. 약물방출실험에서 MMP 비반응성 PA는 인산완충용액과 U87MG 세포의 배지, 모두에서 아드리아마이신이 방출되지 않았다. MMP 반응성 PPA는 U87MG세포의 배지를 첨가한 경우 아드리아마이신이 공유결합체로부터 분해되어서 방출되었으나 인산완충용액을 첨가한 경우에는 아드리아마이신을 방출하지 않았다. U87MG세포를 이용한 독성 비교실험에서 MMP 분해성 PPA는 ADR과 비슷한 세포독성을 보였으나 MMP 비반응성 PA는 ADR보다 세포독성이 약함을 알 수 있었다. 결론적으로 PPA는 암세포의 MMP-2의 분비에 반응성을 가지고 있으므로 암세포에 표적성 약물전달체로써 가능성이 있음을 알 수 있었으며 특히 뇌종양세포의 침윤을 억제하는데 효과가 있을 것으로 기대된다.

Biological control of root-knot nematodes by gelatinolytic bacteria

진룽더 Chonnam National Univ. 2007 국내박사

젤라틴 분해 특성을 가진 박테리아를 근권토양으로 부터 분리하였으며16S rRNA gene sequence analysis에 의해 Bacillus luciferensis, Enterococcus sp. 및 Bacillus megatirium 으로 동정하였다. Bacillus luciferensis는 protease를 생성함을 확인하였으며 나머지 두 균주는 HCN 및 proteases를 생성함을 확인하였다. 분리 된 3종의 박테리아의 처리는 Meloidogyne incognita 의 암컷 세포벽을 분해함으로써 몸체를 파괴함을 확인하였다. B. luciferensis, Enterococcus sp. 및 B. megatirium 를 처리한 토마토는 무처리구와 비교할 때 더 큰 초장과 생체중을 보였고 2기 유충, 난낭 및 뿌리혹지수는 더 낮은 값을 나타내었다. 또한 Enterococcus sp. 의 처리는 가장 강한 항 선충 활성을 나타내었다. 따라서 Enterococcus sp. 를 선정하여 부식된 톱밥 및 키틴퇴비와 혼합하여서 선충 방제 효과를 검증 하였다. Gelatin을 기질로 한 액체배지에서 84시간 배양 후 Enterococcus sp. 의 gelatinase 활성은 48.6 ㎕/ml에 도달하였으며 높은 gelatinase활성은 120시간까지 유지되었다. 노출된 환경에서의 대량배양에서도 미생물의 밀도 및 gelatinase 활성은 2.8 × 108 CFU 및 40.2 ㎕/ml 의 수치를 나타내었다. Cadusafos 를 처리한 근권 토양에서 2기 유충의 밀도는 composted sawdust + Enterococcus sp. 처리 및 composted sawdust처리에 비해 낮은 반면, 뿌리 중 eggmasses는 더 높았다. composted sawdust + Enterococcus sp. 의 처리는 가장 높은 초장과 생체중을 보여주었다. 또한 cadusafos처리, composted sawdust + Enterococcus sp. 처리, composted sawdust처리에 비해 무리처구의 토마토 뿌리는 언제나 많은 H₂O₂ 를 생성 하였다. 실험의 후반부에서 cadusafos및 무처리구에서 토마토 잎이 황화 되고 시들음 증상을 보였으나 composted sawdust + Enterococcus sp. 및 composted sawdust 처리구에서는 정상적인 생육을 보였다. 상추 정식 후 50일째에 Enterococcus sp. + chitin compost 처리구에서 건물중과 엽면적 모두 가장 높은 값을 보였으며 cadusafos처리구는 뿌리에서 eggmass, egg 및 2기 유충의 밀도가 가장 낮은 수치를 나타냈다. 비록 cadusafos 보다는 낮은 항선충 활성을 보였지만 Enterococcus sp. + chitin compost 처리구는 대조구에 비해 eggmass, egg 및 2기 유충을 각각 60.7%, 86.3% 및 72.2% 감소시켰다. Three gelatinolytic bacteria possessing a strong ability in liquefying gelatin were isolated from rhizosphere. Based on the 16S rRNA gene sequence analysis, the bacteria were identified as Bacillus luciferensis, Enterococcus sp. and Bacillus megatirium, respectively. All of the bacteria were regarded to produce gelatinase, protease and hydrogen cyanide (HCN), except Bacillus luciferensis which do not produce HCN. Bodies of Meloidogyne incognita females were completely destroyed in the presence of each bacterium. In the pot trails, second stage juveniles, eggmasses and gall index were lower in the plants grown in the gelatinolytic bacteria amended treatments where the populations of the gelatinolytic bacteria was greater than control at each time point. Furthermore, amendment of tomato plant with B. luciferensis, Enterococcus sp. and B. megatirium promoted plant growth in shoot length and fresh weight compared to control treatment. Gelatinase activity of the Enterococcus sp. which showed the strongest nematicidal activity was reached to 48.6 μl/ml in a minimal medium containing gelatin as sole carbon source. Enterococcus sp. was combined with the composted sawdust which contained abundant phenolic compounds or chitin compost to develop an effective bioformulations. Eggmasses in roots were higher, while second stage juveniles in rhizosphere at cadusafos were lower compared to composted sawdust + Enterococcus sp. and composted sawdust. However, highest shoot length and fresh weight were found in composted sawdust + Enterococcus sp. during the study period. Throughout the experiment, H₂O₂ production in control was always higher than cadusafos, composted sawdust + Enterococcus sp. and composted sawdust. At the end of experiment, tomato plant leaves in cadusafos and control turned yellow and drooped; however, plants in composted sawdust + Enterococcus sp. and composted sawdust treatments appeared to be normal. Furthermore, both the shoot dry weight and leaf area in the lettuce plant increased mostly by the amendment of Enterococcus sp. with chitin compost at 50 days after transplanting. Although the eggmasses, eggs in root and second stage juveniles in rhizosphere was lowest in cadusafos, those in Enterococcus sp. + chitin compost were reduced by 60.7%, 86.3% and 72.2% compared to control. This study is the first report in control of root-knot nematodes by gelatinolytic bacteria. These results indicate the potential of gelatinolytic bacteria to alleviate nematode parasitism in important vegetable crops.

Synthesis, structural analysis, and characterization of various glycosides using glycosyltransferases from Leoconostoc mesenteroides

문영환 Chonnam National Univ. 2007 국내박사

Leuconostoc mesenteroides B-1299CB와 512FMC M1FT로부터 얻은 당전이 효소를 이용하여 EGCG, quercetin, arbutin 및 acarbose 배당체 화합물들을 합성하였다. 이들 화합물들은 각각 epigallocatechin gallate 7-O-a-D-glucopyranoside, epigallocatechin gallate 7,4"-O-a-D-glucopyranoside, epigallocatechin gallate 7,4'-O-a-D-glucopyranoside, epigallocatechin gallate 4"-O-a-D-glucopyranoside, epigallocatechin gallate 4'-O-a-D-glucopyranoside, quercetin-3-O--D-glucopyranoside, quercetin-4-O--D-glucopyranoside, 4-hydroxyphenyl β-isomaltoside와 4-hydroxyphenyl β-isomaltotrioside, 1І-β-D-fructofuranosyl-α-acarbose으로 구조해석하였다. 이들 배당체 화합물들은 항산화 활성에 있어서는 수용체 화합물보다는 낮았지만, 물에 대한 용해도, 항갈변 효과가 크게 증가되었으며, tyrosinase 와 당분해 관련 효소들의 저해 활성은 그대로 유지되고, 생체내 gluconeogenesis와 antioxidant 활성에 있어서는 수용체 보다 전반적으로 좋은 효과를 보였다. 앞으로 glcosyltransferases와 이들 산물들은 식품, 화장품 및 의약 산업에 응용될 수 있을 것으로 사료된다. Various glycosides were synthesized by the reaction of acceptor reaction with sucrose and glycansucrases from Leuconostoc mesenteroides. Their structures were assigned as epigallocatechin gallate 7-O-a-D-glucopyranoside, epigallocatechin gallate 7,4"-O-a-D-glucopyranoside, epigallocatechin gallate 7,4'-O-a-D-glucopyranoside, epigallocatechin gallate 4"-O-a-D-glucopyranoside, epigallocatechin gallate 4'-O-a-D-glucopyranoside, epigallocatechin gallate 4¢,4"-O-a-D-glucopyranoside, quercetin-4-O--D-glucopyranoside, quercetin-3-O--D-glucopyranoside, 4-hydroxyphenyl β-isomaltoside, 4-hydroxyphenyl β-isomaltotrioside, 1І-β-D-fructofuranosyl-α-acarbose after 1H, 13C, HSQC, H-H COSY, HMBC analyses. Epigallocatechin gallate glucosides showed a different antioxidant effects according to their structures and showed the strong stability in a browning resistance than epigallocatechin gallate. Furthermore, the water solubility of the glucosides was 50-120 times higher than epigallocatechin gallate. Quercetin-4-O--D-glucopyranoside evidenced slower effects on DPPH radical scavenging activity (SC50 = 25.2 μM) than quercetin (SC50 = 6.5 μM). The water solubility was 12.7 mM, whereas the quercetin was barely soluble in water. The Ki value of quercetin-4-O--D-glucopyranoside (674.5 μM) was almost identical to that of quercetin (673.3 μM) with regard to tyrosinase inhibition effects. 4-Hydroxyphenyl β-isomaltoside exhibited slower effects on DPPH radical scavenging effects than arbutin and almost similar effects on tyrosinase inhibition effects. However, the glucoside showed better inhibitory effect than arbutin on MMP-1 production induced by UVB. 1І-β-D-fructofuranosyl-α-acarbose showed stronger effects on inhibition effect against α-amylase (porcin pancreatics) and amyloglucosidse (aspergillus niger), not α-glucosidase (baker’s yeast) and CGTase (Bacillus marcerans), comparing with that of acarbose.

Biocompatibility of titanium carbo-nitride coatings with fetal rat calvarial cells and human gingival fibroblasts

김지은 Chonnam National Univ. 2008 국내박사

Surface modification is a promising technique to improve mechanical properties of titanium and titanium alloys by changing the surface composition or microstructures. Surface coating with titanium nitride is one of the methods that improve the properties of titanium alloy. These nitride layers have high hardness and low friction coefficients protect against release of ions from Ti-6Al-4V alloy. Therefore, TiN coatings on Ti-6Al-4V alloy is expected to increase the life expectancy of surgical implants and prosthesis. However, cellular responses to TiN on Ti-6Al-4V alloy are poorly understood. In this study, titanium carbo-nitride coating had been deposited on Ti-6Al-4V alloy by arc ion plating. The biocompatibility of TiN and TiCN coating on Ti-6Al-4V alloy with fetal rat calvarial cells and human gingival fibroblasts was assessed by scanning electron microscopy, enzyme linked immunoabsorbent assay, alkaline phosphatase activity, and reverse transcription polymerase chain reaction method. In ELISA analysis, mean concentrations of IL-1β and IL-6 were 49.5 pg/㎖, 65.0 pg/㎖, 64.3 pg/㎖, 53.4 pg/㎖ and 35.8 pg/㎖, 39.5 pg/㎖, 44.3 pg/㎖, 36.8 pg/㎖ on tissue culture plate, cp-Ti, TiN, and TiCN surface respectively. There was no statistical difference between control and different thin coating surfaces. Mean level of ALPase activity was 775 U, 650 U, 780U, and 703 U on glass, cp-Ti, TiN, and TiCN respectively. ALPase activity of cells cultured on TiN and TiCN surface was similar to that seen on cp-Ti. After 1 day culture, the expression of IL-6, OPG, and RANKL mRNA from fetal rat calvarial cells was evaluated by semiquantitive RT-PCR. RANKL mRNA expression level was similar in all samples whereas, RANKL mRNA expression level was increased approximately 2.5-fold when induced with IL-1β. OPG mRNA was expressed uniformly in all samples. IL-6 mRNA expression level was similar in all samples whereas, IL-6 mRNA expression increased approximately 2.8 folds when induced with IL-1β. The mRNA expression of cyclooxygenase-1 (COX-1) and -2 (COX-2) was evaluated in human gingival fibroblasts. COX-1 mRNA was constitutively expressed in human gingival fibroblasts. COX-2 gene was also expressed uniformly in all samples. To evaluate the effect of TiN and TiCN coating on Ti-6Al-4V alloy surface on osteoblast differentiation, the mRNA expression of type I collagen, bone sialoprotein, and osteocalcin mRNA was assessed in fetal rat calvarial cells. The expression level of COL-I and BSP mRNA level was similar on glass, cp-Ti, TiN, and TiCN at day 7. These results suggest that Ti-based surface coatings, such as TiN and TiCN have good biocompatibility. This property could make carbo-nitride coatings on Ti-6Al-4V alloy suitable for orthopedic and dental implants. 타이타늄과 그 합금의 표면 구성과 미세구조의 변화를 주는 표면 처리는 기계적 성질을 개선시키는 중요한 기술이다. TiN 코팅은 타이타늄 합금의 성질을 개선시키는 방법 중 하나로 합금의 강도를 증가시키고 마찰계수를 낮추어 Ti-6Al-4V 합금의 이온 방출을 막는다. 그래서 Ti-6Al-4V 합금 표면에 TiN 코팅을 통해 임플란트의 수명을 증진시킬 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 Ti-6Al-4V 합금 표면의 TiN 코팅이 세포반응에 미치는 영향에 대한 보고는 부족하다. 이번연구에서는 Ti-6Al-4V 합금에 TiN과 TiCN 코팅을 하고 사람 섬유모세포와 백서 태자 두개관세포에서의 생체적합성을 주사전자 현미경, IL-1β와 IL-6 ELISA 분석, 알칼리 인산 분해효소 활성 및 유전자 분석을 통하여 알아보았다. 1. 백서 태자 두개관세포에서의 IL-1β와 IL-6 분석에서, IL-1β의 농도는 조직배양용기, 타이타늄, TiN 코팅 및 TiCN 코팅에서 각각 49.5 pg/㎖, 65.0 pg/㎖, 64.3 pg/㎖, 53.4 pg/㎖으로 모든 표본에서 비슷하였고, IL-6의 농도도 각 각 35.8 pg/㎖, 39.5 pg/㎖, 44.3 pg/㎖, 36.8 pg/㎖로 모든 표본에서 비슷하였다. 백서 태자 두개관 세포에서의 COL-I과 BSP mRNA 발현은 모든 표본에서 유사한 수준으로 관찰되었다. 사람 치은 섬유모세포에서 RANKL mRNA 발현은 모든 표본에서 비슷하였으나, IL-1β로 자극시 RANKL mRNA의 발현이 2.5배 증가하였다. 사람 치은 섬유모세포에서의 IL-6 mRNA 발현과 COX-2 mRNA 발현은 모든 표본에서 그 발현정도가 비슷하였다. 2. 백서 태자 두개관세포에서의 알칼리 인산 분해 효소 활성도는 조직배양용기, 타이타늄, TiN 코팅 및 TiCN 코팅에서 각각 775 U, 650 U, 780 U, 703 U로 모든 표면에서 비슷한 활성도를 나타내었다. 3. 백서 태자 두 개관세포에서의 RANKL, OPG 및 IL-6 mRNA 분석에서 RANKL mRNA 발현은 모든 표본에서 비슷하였으나, IL-1β로 자극시 RANKL mRNA의 발현이 2.5배 증가하였다. OPG mRNA의 발현은 모든 표본에서 비슷하였다. IL-6 mRNA의 발현도 RANKL mRNA 발현에서와 유사하게 모든 표본에서 그 발현정도가 비슷하였다. 사람 치은 섬유모세포에서의 COX-2 mRNA 발현도 RANKL과 IL-6 mRNA 발현과 비슷하게 모든 표본에서 발현정도가 비슷하였다. TiN 코팅과 TiCN 코팅이 조골 세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 7일째 백서 태자 두개관 세포에서 type I collagen (COL-I), bone sialoprotein 및 osteocalcin mRNA 분석을 시행하였다. COL-I과 BSP mRNA 발현은 모든 표본에서 유사한 수준으로 관찰되었으나 OCN mRNA는 발현되지 않았다. 이상의 결과 TiN 코팅과 TiCN 코팅은 순수 타이타늄에서와 같은 우수한 생체적합성을 보여주며 따라서 Ti-6Al-4V 합금에 TiN 코팅과 TiCN 코팅이 정형외과용 및 치과용 임플란트 표면 사용될 수 있음을 의미한다.

Search for neutron-antineutron oscillation in super-Kamiokande

장지승 Chonnam National Univ. 2007 국내박사

A search for Neutron-Antineutron Oscillation, a process of |delta B|=2 predicted by L-R symmetric gauge theories, was undertaken using the 24.5×10^33 neutron-yr exposure of the Super-Kamiokande I, incorporating most major sources of experimental uncertainties. Observing 20 candidates and 21.6 background events with 10.4% signal detection efficiency, the lower limit on oscillation time for neutrons bound in 16O has been determined to be 3.20x10^32 yr at the 90% CL without inclusion of the effect of systematic uncertainties. This limit is better than the previous best limit of 7.2x10^31 yr in Soudan 2 by factor of about 4.5. Taking 15.2% uncertainty in efficiency and 32.1% uncertainty in background rate into account, the lower limit for neutrons bound in 16O was estimated to be 1.78x10^32 yr at the 90% CL and the corresponding limit for free neutrons was calculated to be 1.25x10^8 s using a theoretical suppression factor of 3.6x10^23 s^(-1).

Role of YWHAB (14-3-3 β) in the migration and invasion of human malignant glioma cell lines

박성근 Chonnam National Univ. 2008 국내박사

Objective: In a previous study, the author putatively identified 14-3-3β(YWHAB), galectin-1, calpain, and FRJ22905 as genes that participate in malignant glioma motility. Furthermore, 14-3-3β was found to be highly expressed in motile cell lines. In the present study, the author confirmed that 14-3-3β modulates the migration and invasion of human malignant glioma cells. Material and Methods: To profile the genes associated with malignant glioma cell motility, the author used RNA differential displays using the GenefishingTM DEG technique and validated results by Northern blotting in human malignant glioma cell lines (U343MG-A, U87MG, U87MG-10'). was identified in U87MG, a highly motile cell line. In order to investigate the role of 14-3-3β in the migration and invasion of human glioma cells, thus U87MG cells were transfected with antisense 14-3-3β cDNA plasmid. To follow motility changes after transfection, simple scratch testing and matrigel invasion assays were performed. Morphologic and cytoskeletal (actin, vimentin) changes were documented by light and confocal microscopy. In addition, doubling times of the transfectant and endogenous 14-3-3β levels were determined in various glioma cell lines and correlated with motility. Results: The 14-3-3β was highly expressed in the motile cell lines. After transfection with a 14-3-3β antisense-construct, U87MG cells became small and flat and actin was depolarized. The migration abilities of antisense 14-3-3β cDNA transfected U87MG cells were inhibited markedly versus parental U87MG cells. The doubling times of transfected and parent cells were 32h and 37h respectively. Endogenous 14-3-3β expressions in the four human glioma cell lines were directly correlated with their migratory and invasive abilities. Conclusions: The present study indicates that 14-3-3β modulates the migration and invasion of human malignant glioma cell lines. It is hoped that this knowledge will be found useful by those trying to develop therapeutic approaches for the treatment of glioma. 신경교종은 발생초기부터 세포들이 주변 정상 뇌를 침윤하는 특성을 가지고 있다. 따라서 침윤관련 연구는 매우 중요하며, 악성신경교종 세포주들에서 세포 이동능에 관한 유전자를 탐색하고, 이들의 기능에 대하여 연구하였다. 실험방법은 이동능에 큰 차이를 보이는 악성신경교종 세포주 들을 선정하였고, 세포주간에 차이가 많이 나는 유전자를 DD-PCR 를 통하여 탐색한 결과, YWHAB(14-3-3β)는 이동능이 월등한 세포에서 높은 발현을 보였다. 본 연구에서는 14-3-3β이 악성신경교종 세포의 침윤에 영향을 미치는 지에 대해 연구하였다. Antisense 14-3-3β plasmid를 이동능력이 높은 U87MG 악성 신경교종 세포주에 형질전환을 시켰으며, 형질 변환된 세포주을 이용하여 simple scratch technique와 matrigel assay을 시행하였고 모세포의 이동능과 침윤능과의 차이를 비교 확인하였다. 또한 형질 전환시킨 U87MG 악성신경교종 세포주의 double time을 조사하였고, 형태학적 변화, 세포골격 단백의 발현차이 등을 관찰하였다. 악성 신경교종 세포주들 (U343MG-A, U373MG, U251MG, U87MG)의 고유 이동능에 따른 14-3-3β의 발현차이를 알아보았다. 실험결과 antisense 14-3-3β plasmid를 처리한 세포에서 형질 전환된 세포들의 이동능과 침윤능은 현저히 감소하였고(p<0.003), doubling time은 모 세포주의 32시간에 비하여 antisense 형질 전환된 U87MG는 37시간이었다(p>0.05). 또한 antisense 형질 전환된 세포는 좀 더 납작하고, 원형으로 변화되었다. 악성 신경세포주 들에서 고유 이동능이 높을수록 14-3-3β의 발현이 높았다. 위와 같은 실험결과로 보아 14-3-3β는 악성신경교종 세포주의 침윤능과 이동능을 증가시키는데 중요한 역할을 하는 유전자로 판단이 되며, 향후 악성신경교종의 침윤 억제치료에 이용될 가능성을 시사하였다.