Induction of mucosal immune responses by Brucella abortus antigens using delivery systems based on chitosan nanoparticles

심수진 서울대학교 대학원 2020 국내박사

브루셀라증은 그람 음성인 브루셀라 (Brucella)속 균의 감염에 의해 지속적으로 발생되고 있는 주요한 인수공통전염병 중 하나이다. 브루셀라증은 호흡기, 소화기 및 생식기의 점막을 통해 감염이 된다. 브루셀라균이 점막 표면을 통해 침입 한 후에는 다양한 전략을 사용하여 숙주 면역 반응을 회피하고 숙주내에서 생존하며 만성 감염을 유발한다. 동물에서 브루셀라증 예방을 위해 다양한 백신들이 개발되어 사용되어 왔다. 그러나 이들은 항생제 내성, 진단 방해, 임신 동물의 유산 등의 부작용뿐만 아니라 사람에게 병원성을 유발하는 등 다양한 문제를 나타내었다. 따라서 이러한 문제점을 극복할 수 있는 브루셀라증 백신의 개발이 필요한 시점이다. 브루셀라증은 사람과 동물에서 점막을 통해 감염되기 때문에, 주 감염 경로인 점막 면역을 유도하기 위한 항원 전달 시스템의 개발이 동시에 요구된다. 많은 연구를 통하여 B. abortus 재조합 단백질이 새로운 백신 후보로써 논의되어 왔다. 이들 항원은 whole cell 백신에 비해 병원성이 낮고 효과적이며, 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있기 때문이다. 그러나 재조합 단백질이 whole cell 백신보다 면역원성이 낮은 경향이 있기 때문에 재조합 단백질 항원을 이용하여 전신 면역을 유발하기 위해서는 효과적인 백신보조제 및 투여 경로가 고려되어야 한다. 비강 경로는 약물 전달이 편리하고 전신 및 국소 점막 면역을 유도할 수 있기 때문에 효과적인 백신 투여 경로 중 하나로 생각되어 왔다. 비강을 통해서 투여된 항원에 대한 면역반응은 Nasal-associated lymphoid tissues (NALT)에서 유도된다. NALT는 T 세포와 B 세포 등 면역세포를 가지고 있고, NALT의 상피에는 antigen-sampling cell인 Microfold (M) 세포가 존재한다. M 세포는 통과하는 외부항원을 인식하고 면역 반응을 개시한다. 키토산은 키틴의 탈 아세틸화 반응을 통하여 얻어진 생체재료로써 가장 폭넓게 이용되는 천연 다당류 중의 하나이다. 이는 생체적합성, 생분해성, 무독성과 같은 생체재료로서의 우수한 물리화학적 특성을 가지고 있으며 점막 전달에 유용한 중합체로서 활용되고 있다. 본 연구에서는 점막 표면에서 일어나는 빠른 제거를 극복하고 M 세포를 통해 NALT로 항원을 전달하기 위해서 키토산 나노입자를 바탕으로 하는 B. abortus 항원 전달체를 개발하고 면역유도능을 평가하였다. 첫 번째로, B. abortus의 malate dehydrogenase (Mdh)를 키토산 나노 입자 (CNs)에 담지하였고, 이들이 항원 전달을 향상시키고 면역반응을 유도할 수 있는지 in vitro M 세포 모델을 이용하여 조사하였다. CNs-Mdh를 자극한 그룹은 Mdh 단일 자극 그룹과 비교하여 M 세포 모델에서 Mdh의 향상된 전위를 유도 하였다 (P<0.05). CNs-Mdh 자극 그룹은 Mdh 자극 그룹 보다 많은 IL-1β 및 IL-6의 생산을 유도하였다. 또한, CNs-Mdh의 자극에 의해 M 세포의 TLR2, MyD88, TRAF6, IRF4 및 CD14의 유전자 발현이 증가 하였다 (P<0.05). 둘째로, CNs-Mdh의 BALB/c 마우스 비강 내 접종이 비강 면역의 표적 부위인 NALT를 활성화하여 점막 면역을 유도하는지 확인하였다. 먼저 접종 후 NALT에서 시간별 유전자 발현 양상을 RNA-seq기법을 이용하여 분석하였다. CNs-Mdh의 비강 내 투여는 처음 1 시간에 상피 세포 및 근육 세포의 viability를 감소시켰으나 6 시간에 과립구, 호중구 및 림프구와 같은 면역 세포의 세포 이동을 유도하였고, NALT 내에서 12 시간에 IL-6 signaling pathway를 활성화시켰다. 이러한 면역 세포의 활성화는 또한 high-mobility group box 1 protein (HMGB1) signaling pathway의 활성화와 점막 면역에 필요한 DCs의 성숙을 촉진시켰다. 면역 2주 후 CNs-Mdh 그룹의 분변 및 질 분비물에서 항원 특이적 IgA의 생성이 유의적으로 높게 검출되었다 (P<0.05). 셋째로, Mdh와 더불어 B. abortus의 주요 항원인 외막단백질 (Omp) 10 및 19를 CNs에 담지하고, BALB/c 마우스에게 비강 내 단일 면역 후 점막 및 전신 면역반응을 분석하였다. 이들 항원을 또한 복합으로 접종하여 다수의 항원 특이 반응의 유도 여부를 분석하였다. 비강접종 6주 후, 항원 특이적 IgG가 모든 그룹에서 유도되었으며 주로 IgG1의 생산이 우세하였다. 세포 및 체액 면역분석에서 B. abortus의 항원이 담지된 CNs이 Th2 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 점막 면역의 경우, CNs-Mdh 그룹에서는 비강 세척물 및 분변에서 Mdh 특이적 IgA가 검출되었고 CNs-Omp10 및 Omp19 그룹에서는 혈청, 비강 세척물, 질분비물 및 분변에서 각 항원에 대한 특이적 IgA가 검출되었다 (P<0.05). 복합 항원으로 면역한 군에서는 혈청과 비강 세척물에서 Mdh에 대한 특이적 IgA가 생성되었다 (P<0.05). 결론적으로 이러한 연구의 결과들은 키토산 나노입자를 이용한 B. abortus 항원의 비강 내 면역이 브루셀라 항원에 대한 전신 면역을 유도하기 위한 성공적인 전달 시스템을 보여주었으며, 이는 효과적인 점막백신 개발에 기여할 수 있을 것으로 생각된다. Brucella species, Gram-negative, facultative intracellular bacteria, are the causative agent of brucellosis which is the most common zoonotic disease. Brucellosis is transmitted through the mucosal membrane in the respiratory, digestive, and genital tracts of both animals and humans via drinking of unpasteurized milk or direct/ indirect contact with infected animals. At present, vaccines against Brucella abortus, such as Rev. 1, S19 and RB51, have been used to control the disease. However, these vaccines have some drawbacks, such as interference with diagnosis, abortion in pregnant animals, pathogenicity in humans, and antibiotic resistance. Therefore, the development of an effective vaccine without side effects for brucellosis has been required. In addition, developing delivery systems to induce immunity in the mucosal membranes as a primary barrier is required. Drug delivery by the intranasal route was considered the preferred route of administration for its convenience and induction of systemic and mucosal immunity. The inductive site of the mucosal immune response against inhaled antigen has been known as the nasal-associated lymphoid tissue (NALT). It contains microfold cells (M cells), which are cells that are specialized for the phagocytosis across the epithelium of antigens, and immunocompetent cells that play key roles in the defense against pathogens. To overcome the rapid clearance of antigens at the mucosal surface and improve uptake of antigen into the MALT, a strategy using delivery systems based on nanoparticles are promising application in mucosal administration of antigen. The chitosan, a natural linear polyaminosaccharide, is obtained by alkaline deacetylation of chitin. The chitosan has been known as a useful polymer for mucosal delivery due to ionic binding between positive charge of abundant amino groups in chitosan and negative charge of carboxyl group of sialic acid residues on mucin. Based on the current knowledge, delivery system with chitosan nanoparticle (CNs) and B. abortus antigens were developed and investigated the activation of gene networks and the induction of mucosal and systemic immunity with the system in this study. As the first study, B. abortus malate dehydrogenase (Mdh) was loaded in mucoadhesive CNs. Then, an in vitro M cell model was used to investigate whether CNs-Mdh improve the antigen delivery and could induce an inflammatory response. Mdh loaded CNs induced enhanced transport of Mdh in the M cell model as compared to Mdh stimulation group (P<0.05). CN-Mdh stimulation group showed significantly higher production of IL-1β and IL-6 in comparison with Mdh stimulation group. Also, gene expression of TLR2, MyD88, TRAF6, IRF4 and CD14 were significantly increased by stimulation with CNs-Mdh. Second, the time-dependent gene expression of NALT was analyzed after intranasal immunization of BALB/c mice to identify how CNs-Mdh affect the target site of nasal immunization and induction of mucosal immunity. Intranasal immunization of CNs-Mdh reduced cell viability of epithelial and muscle cells at first 1 h, then induced cellular movement of immune cells such as granulocytes, neutrophils, and lymphocytes at 6h, and activated IL-6 signaling pathway at 12h within NALT. The immunization also promoted signaling pathway for high-mobility group box 1 protein (HMGB1), followed by the maturation of DCs required for mucosal immunity in immune cells. Significant amounts of antigen specific IgA were detected in the fecal excretions and genital secretions from the CNs-Mdh-immunized group after 2 weeks-post immunization (wpi). Third, three B. abortus promising antigens, Mdh, outer membrane proteins (Omp) 10 and 19, were individually loaded in CNs and induction of mucosal and systemic humoral immunity were investigated after intranasal immunization of BALB/c mice. These antigens were also coimmunized as cocktail (Cocktail) to evaluate multiple antigen specific vaccine candidates. At 6 wpi, antigen specific total IgG was increased in all of the immunized groups, predominantly IgG1 (P<0.05). Analysis of cellular and humoral immunity with ELISpot and ELISA showed that B. abortus antigens-loaded CNs elicited Th2-polarized response. In the analysis of mucosal immune responses, anti-Mdh IgA from nasal washes and fecal excretions, and anti-Omps IgA from sera, nasal washes, genital secretions, and fecal excretions were significantly increased in single antigen immunized groups (P<0.05). In the Cocktail-immunized group, anti-Mdh IgA were significantly increased (P<0.05). Those results suggested that the intranasal immunization of B. abortus antigens-loaded CNs was an optimal delivery system to induce systemic and specific mucosal immune response to the antigens.

Molecular epidemiology and comparative genomics of Staphylococcus aureus isolated from domestic cows with bovine mastitis

고대성 서울대학교 대학원 2022 국내박사

황색포도알균은 사람과 동물에서 중요한 병원체로서 사람의 약 30% 에서는 상부호흡기계나 피부에서 정상적으로 발견되기도 한다. 하지만 기회감겸을 일으켜 연부조직 감염, 화농성 관절염, 골염, 수술 후 창상감염, 패혈증, 식중독 등을 일으키며 소에서는 유방염의 주요 원인균으로 알려져 있다. 소는 황색포도알균의 주요 보균 동물로 알려져 있으며 따라서 소와 사람에서 분리된 균주들의 유전적 역학관계를 밝히는 것이 필요하다. 이 연구에서 나는 황색포도알균에 적용할 수 있는 새로운 타이핑 기법을 개발하고 이를 바탕으로 소와 사람에서 분리된 균주들에 대해 다양한 유전적 특징들을 비교함으로써 두 숙주에서 분리된 균주들의 관련성을 증명하였다. 사람과 소에서 분리된 황색포도알균의 유전적 관계를 결정하기 위해 Multi-Locus Sequence Typing, spa typing, Pulsed-Field Gel Electrophoresis 등 다양한 분자적 기법이 사용되어 왔으나 비용 등의 측면에서 한계가 있었다. 따라서 나는 이러한 점들을 개선할 뿐 아니라 황색포도알균의 균주들 간 분화과정을 이해할 수 있고 RNA polymerase subunit B (rpoB) 유전자와 관련된 항생제 내성정보를 알 수 있도록 rpoB sequence typing (RSTing) 방법을 개발하였다. 나는 유방염을 앓고 있는 국내 젖소 (22농장, 72두 및 84분방) 에서 분리된 황색포도알균에 대해서 spa typing 과 RSTing을 수행하였고 농장 내 분리주들 사이에 관련성을 확인할 수 있는 프로파지 타이핑 (mPPTing) 방법을 개발하였다. 또한 사람유래 황색포도알균과 비교하기 위해 RSTing 및 mPPTing 방법을 각각 국내 환자 분리주들 (n = 14)에 실제로 적용하였고 GenBank database (n = 166)의 사람 분리주들에 대해서는 in silico 분석을 진행하였다. 그 결과 사람과 소에서는 각각 RST10-2와 RST4-1이 가장 우점하는 RST였으며, 여러 typing 방법을 통해 비교된 소와 사람의 분리주들은 서로 구분되는 양상을 나타냈다. 항생제 내성검사 결과 소 분리주들에서 메치실린 항생제 내성 유전자는 검출되지 않았다. 또한 mPPTing을 통해 같은 농장 내에서 분리된 서로 다른 분리주들 간에 prophage의 점진적인 획득 양상이 확인되어 분리주들 간 역학 관계를 파악하는데 도움을 주었다. 이것으로 보아 RSTing 및 mPPTing은 황색포도알균의 분자 역학적 분석을 위해 적용할 수 있는 방법임을 알 수 있다. 소에서 가장 높은 빈도를 나타냈던 RST10-2은 비단 소 뿐 아니라 다른 국가의 사람 분리주들에서도 역시 나타나고 있다. 하지만 아직까지 소 유방염으로부터의 RST10-2 MSSA(Methicillin susceptible Staphylococcus aureus)의 완전한 게놈 서열은 보고된 바 없다. 따라서 소와 사람에서 분리된 RST10-2 분리주들의 진화 관계를 분석하기 위하여 spa type과 prophage type이 다른 2개의 소 유래 분리주 (PMB64-1 (t2489 / mPPT0), PMB81-4 (t127 / mPPT1-2-3))에 대하여 비교 유전체학 연구를 수행하였다. 그 결과 PMB64-1 및 PMB81-4의 유전체는 다른 RST 보다 사람 대표균주 RST10-2 (MSSA476, MW2 등)와 높은 상동성을 나타냈다. RST10-2 분리주들 중 대부분은 아미노산 서열에 일부 변이가 확인된 4개의 병원성 유전자를 가지고 있었고 이와 함께 5개의 위유전자를 공유하는 것으로 나타났다. 그러나 PMB64-1 및 PMB81-4는 사람 RST10-2 분리주들과 비교해 다른 분리주의 특이적인 위유전자들과 mobile genetic elements (MGEs)를 획득한 것으로 확인되었다. 소에서 분리된 RST10-2 분리주들의 공통인 위유전자 프로필과 병원성 유전자들의 높은 동일성이 확인되었다. 따라서, 소 유방염 유래 RST10-2 MSSA 분리주는 사람의 MSSA 및 CA-MRSA 분리주들과 진화 관계를 가질 수 있으며, 소에 좀 더 적응된 분리주라고 생각해 볼 수 있다. 즉, RST10-2의 경우 소와 사람 분리주간의 진화관계가 있는 것으로 보인다. 또한 RST4-1과 RST2-1에서 소와 사람 분리주간 진화관계 가능성에 대해 파악하는 것이 필요할 것이다. 따라서 각 RST별로 소 RST4-1 (PMB179) 및 RST2-1 (PMB196) 분리주와 사람 유래 RST4-1, RST2-1 분리주들에 대한 유전체 비교 분석을 수행하였다. 그 결과, 각각 131개의 RST4-1 분리주들과 54개의 RST2-1 분리주들로부터 각각 257개 및 180개의 위유전자 프로필을 확인하였다. 대부분의 분리주는 분리주 특이적인 위유전자들을 가지고 있었으며 다양한 위유전자 프로필이 RST4-1 및 RST2-1 분리주들 가운데 명백하였다. 그러나 RST4-1 분리주들은 RST2-1 분리주들에 비해 공유되는 위유전자가 더 많은 것으로 나타났고, 역학적으로 관련이 있는 것으로 확인된 분리주들 간에는 더욱 더 공통의 위유전자를 공유 하고 있었다. MGEs, 병원성 유전자 및 항생제 내성 유전자에 대한 비교 분석 결과 PMB179와 PMB196이 사람 RST4-1, RST2-1 분리주들과 분자적으로 명백하게 구분되지는 않았다. 흥미롭게도 RST4-1 또는 RST2-1 분리주들의 각 집단 내 비교에서 genomic islands와 항생제 내성 유전자의 점진적 획득 관계가 확인되었다. 이 경우 사람의 RST4-1 및 RST2-1 분리주들이 기회 감염으로 인하여 명백한 임상증상을 나타내는 소 유방염을 초래하는 것으로 판단된다. 상기 결과들을 종합해 볼때 RSTing과 mPPTing을 적용하여 황색포도알균에 대하여 몇 가지 특성을 확인할 수 있었다. 첫째, RSTing을 통해 각각 사람에서는 RST4-1, RST2-1이 소에서는 RST10-2가 우점한다는 것을 확인하였다 둘째, 소 분리주들 가운데 각 종에서 우점하는 RST4-1, RST2-1과 RST10-2 분리주를 골라 유전체 서열 정보를 바탕으로 위유전자, 병원성 유전자, mobile genetic elements, 항생제 내성 유전자에 대해 비교하여 사람과 소 분리주들의 연관성을 있음을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 사용된 RSTing, mPPTing의 적용과 국내 소 분리주에 대하여 처음으로 진행된 유전체 서열 분석은 황색포도알균의 국내역학 규명에 유용한 분석방법이 될 것으로 기대된다. Staphylococcus aureus is an important pathogen in both humans and animals and is most commonly found in the upper respiratory tract as well as on skin. However being the opportunistic pathogen that it is, it can cause a variety of other problems, such as soft tissue infection, purulent arthritis, post-operative wound infection, sepsis, and food poisoning; moreover, it is a major cause of mastitis in cows. In particular, bovine harbor a major reservoir of S. aureus. Because S. aureus has infectivity both cow and humans, it is beneficial to demonstrate the epidemiological relationship of S. aureus isolated from cows and humans. In this study, I developed new typing technique that can be applied to S. aureus and elucidated the relevance of S. aureus by comparing various genetic characteristics from cow and human isolates. Various molecular techniques, such as multi-locus sequence typing (MLST), spa typing, and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) have been used to determine the genetic relationship between human and cow derived S. aureus, however there are limitations regarding time and cost. I developed rpoB sequence typing (RSTing) and molecular prophage typing (mPPTing) methods to applied these techniques to detect S. aureus isolated from dairy cows with mastitis (22 farms, 72 cows, 84 udders). Additionally, to apply RSTing and mPPTing for S. aureus isolated form humans, the techniques were applied to Korean patient isolates (n = 14), and in silico analysis was performed with human isolates from the GenBank database (n = 166). RST10-2 and RST4-1 were the highest RSTs detected in cows and humans, respectively, and the isolates of cows and humans showed distinct patterns. And RSTing was simple compared to other typing techniques because only 8 primers were required for typing. Furthermore, the gradual acquisition of prophage between different isolates from the same farm was confirmed through mPPTing, which greatly helped to understand the epidemiology between isolates. Therefore, RSTing and mPPTing are simple and economical methods for molecular epidemiological analysis of S. aureus. The complete genomic sequence of RST10-2 methicillin susceptible S. aureus (MSSA) isolated from bovine mastitis has not yet been reported. Therefore, in order to investigate the evolutionary relationship between RST10-2 strains isolated from cows and humans, the complete genomic sequences of two strains with different spa types and prophage types [PMB64-1 (t2489/mPPT0), PMB81-4 (t127/mPPT1-2-3)] were determined. The genomic sequences of PMB64-1 and PMB81-4 showed more homology with representative human RST10-2 strains (MSSA476, MW2, and others) compared with other RSTs. Most of RST10-2 strains had four variable virulence genes with high amino acid identity, and it shared five pseudogenes. However, it was confirmed that PMB64-1 and PMB81-4 obtained strain-specific pseudogenes and mobile genetic elements (MGEs), which human RST10-2 strains did not. The unique pseudogene profile and high identity of the virulence genes were verified in RST10-2 field strains isolated from dairy cow with bovine mastitis. Thus, RST10-2 MSSA isolated from bovine mastitis may share evolutionary similarities with human MSSA and community-acquired MRSA (CA-MRSA) isolates. It could even be said in simple terms that cow- derived RST10-2 MSSA are a more adapted strains than that found in humans. It is also necessary to investigate the evolutionary relationship of RST4-1 and RST2-1 between cow and human, as these subtypes have been identified at high frequencies in humans. Thus, complete genomic sequences were determined, and comparative genomics was performed with two variants of the human and the bovine RST4-1 (PMB179) and RST2-1 (PMB196) genotypes. 257 and 180 pseudogene profiles were identified from 131 RST4-1 strains and 54 RST2-1 strains, respectively. Most strains had strain-specific pseudogenes, and overall various pseudogene profiles were evident among the RST4-1 and RST2-1 strains. However, RST4-1 strains showed a higher level of shared pseudogenes than RST2-1 strains, and shared more common pseudogenes among epidemiologically related strains. Comparative analysis of MGEs, virulence genes and antibiotic resistance genes showed that PMB179 and PMB196 were not molecularly distinct from human RST4-1 and RST2-1 strains. Interestingly, the comparison of each group of RST4-1 or RST2-1 strains confirmed the gradual acquisition relationship between genomic islands and antibiotic resistance genes. In this case, it is thought that human RST4-1 and RST2-1 strains are opportunistically infected, resulting in bovine mastitis and in due course, the clinical symptoms. In conclusion, this study applied novel typing techniques RSTing mPPTing in S. aureus. It was found that these methods has the advantage of convey various information as well as time and cost compared to the existing typing methods. In addition, it was confirmed that RST4-1, RST2-1 were dominant in humans and RST10-2 was dominant in cows. Through comparative genomics comparing pseudogenes, virulence genes, MGEs and antibiotic resistance genes of RST10-2, RST4-1 and RST2-1 strains, it was emphasized that there was an epidemiological relationship between human and bovine S. aureus strains. The application of the novel typing methods used in this study and the first complete genome sequence analysis for Korean cow isolates are expected to play an important role in the further epidemiological study of S. aureus.

Pathological and Immunological Evaluation of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Modified-Live Virus and Subunit Vaccines

김한진 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is linked to economically important disease in modern swine industry causing reproductive loss and respiratory disease. PRRS virus (PRRSV) is further divided into two major types, PRRSV-1 and PRRSV-2. PRRSV-1 and PRRSV-2 were first isolated in Europe and North America respectively around 1991, both strains are still dominant in that discovered continent. But both PRRSV-1 and PRRSV-2 has appeared together in Asian countries including Korea and caused more complicated disease. PRRS vaccination, while it does not completely prevent PRRSV infection, is one of the most powerful methods for managing PRRS. Vaccination with a homologous strain is more effective than vaccination with a heterologous strain and modified live vaccines has reduced production and economic losses and wild‐type virus shedding. Currently, four Modified Live Virus Vaccines (MLV), two based on PRRSV-1 and two based on PRRSV-2 are commercially available in the Korean market. However, no studies have been performed yet to assess the efficacy of these 4 PRRSV MLV vaccines against heterologous PRRSV-1 and PRRSV-2 field viruses. For this reason, this study evaluated the efficacies of two different MLV 1 commercial PRRS vaccines and two different MLV 2 commercial PRRS vaccines' efficacies in growing pigs through PRRSV-1 and PRRSV-2 challenges. Either MLV 1 vaccines reduced lung lesions and PRRSV positive cells only in homologous PRRSV-1 challenges but either MLV 2 vaccines showed cross protection not only homologous PRRSV-2 but also heterologous PRRSV-1. With these results, studies were expanded to test PRRSV-1 and PRRSV-2 co-infected commercial farm comparing MLV 1 with MLV 2 vaccine efficacies. Regardless of the type of MLV, all vaccinated groups generally exhibited improved growth rate compared to the unvaccinated pigs but as the previous study indicated, either of the MLV 2 vaccines had a better overall growth rate compared to the pigs vaccinated with either of the MLV 1 vaccines. MLV 1 vaccination failed to reduce any type of PRRSV-1 or PRRSV-2 viremia while MLV 2 vaccines decreased PRRSV-2 viremia. Taken together, MLV 2 vaccines can be more efficacious than MLV 1 vaccines in PRRSV-1 and PRRSV-2 co-infected farms. Although PRRS MLV vaccines has been more efficacious than killed vaccines, there has been growing concerns about the safety fo live vaccines, especially breeding farms. To meet this demand, relatively recently PRRS subunit vaccine was developed claiming little adverse effects appearing vaccines using whole virus for antigen but no comparative field studies between PRRS subunit vaccines and PRRS MLV were done before. In this study, the efficacy of a porcine reproductive and respiratory syndrome subunit and a modified-live virus vaccine against respiratory diseases in endemic farms were compared. Three farms were selected based on their history of respiratory diseases caused by co-infection with both PRRSV-1 and PRRSV-2. Pigs vaccinated with the PRRS subunit vaccine had a similar or better efficacy against respiratory disease and had a better growth performance compared to those vaccinated with the PRRS MLV vaccine. But at the peak of PRRSV-1 and PRRSV-2 viremia, both PRRS subunit vaccine and MLV's neutralizing antibodies and T-cell responses against PRRSV-1 and PRRSV-2 were at low levels suggesting that either vaccine is only able to provide a partial protection against co-circulating PRRSV-1 and PRRSV-2. Lastly, effectiveness of a commercial PRRSV subunit vaccine against heterologous PRRSV-1 and PRRSV-2 challenge in late-term pregnant gilts were investigated. Regardless of the challenge strain's genotype, the vaccinated gilts carried their pregnancies to term and farrowed between days 114 and 115 of gestation while unvaccinated gilts aborted between days 105 and 110 of gestation. The vaccinated gilts had a significantly lower level of PRRSV viremia and significantly higher levels of virus-neutralizing antibodies and interferon-γ-secreting cells compared with the unvaccinated gilts. These results revealed that vaccination in late-term pregnancy with PRRSV subunit vaccine was efficacious against reproductive failure due to heterologous PRRSV-1 and PRRSV-2 infection. 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS)은 번식 저하 및 호흡기 질환을 일으키는 현대 양돈 산업에서 경제적으로 가장 중요한 질병이다. PRRS 바이러스(PRRSV)는 크게 PRRSV-1 및 PRRSV-2 의 두 가지 균주로 나누어 지는데 PRRSV-1과 PRRSV-2 는 1991 년경 유럽과 북미에서 각각 처음 분리되었으며, 두 균주 모두 발견된 대륙에서 여전히 우세한 균주이다. 그러나 우리 나라를 비롯한 아시아 국가는 PRRSV-1과 PRRSV-2 가 함께 나타나 더 심한 합병증을 일으킨다. 동종 균주를 사용한 백신 접종은 이종 균주를 사용한 백신 접종보다 더 효과적이며 약독화 생백신은 생산 및 경제적 손실과 야외 바이러스 배출을 줄였다. 현재 국내에는 4 개의 약독화 생백신이 판매 중이며 2개는 PRRSV-1 유래 약독화 생백신이고 나머지 2개는 PRRSV-2 유래 약독화 생백신이다. 그러나 PRRSV-1 및 PRRSV-2 야외 이종 바이러스에 대한 4 가지 약독화 생백신의 효능을 평가한 연구는 아직 수행되지 않았다. 이러한 이유로, 본 연구는 육성돈에 PRRSV-1 및 PRRSV-2 를 공격접종하여 두 개의 MLV 1 상용 PRRS 백신과 두 개의 MLV 2 상용 PRRS 백신의 효능을 평가했다. 두 개의 MLV 1 백신은 동종 PRRSV-1 공격접종에서만 폐 병변과 PRRSV 감염 세포를 감소시켰지만, 두 개의 MLV 2 백신은 동종 PRRSV-2 뿐만 아니라 이종 PRRSV-1 공격접종에서도 교차면역을 나타냈다. 이러한 결과를 가지고 MLV 1과 MLV 2 백신 효능 비교 실험을 PRRSV-1 및 PRRSV-2 함께 감염된 일반 양돈장으로 확대하였다. MLV의 유형에 관계없이 모든 백신 접종 그룹은 일반적으로 백신을 접종하지 않은 돼지에 비해 향상된 성장률을 보였지만 선행 연구처럼 MLV 2 백신이 MLV 1 백신을 접종 한 돼지에 비해 전체 성장 속도가 더 좋았다. MLV 1 백신 접종은 PRRSV-1 과 PRRSV-2 어느 것도 바이러스 혈증을 감소시키지 못한 반면 MLV 2 백신은 PRRSV-2 바이러스 혈증을 감소 시켰다. 종합하면 MLV 2 백신은 PRRSV-1 및 PRRSV-2 혼합감염 농장에서 MLV 1 백신보다 더 효과적일 수 있다. PRRS 생독백신이 사독백신보다 더 효과적이긴 하지만 생독백신의 안전성에 대한 우려가 커지고 있는데 종돈장의 경우 더욱 그러하다. PRRS 서브유닛 백신과 PRRS MLV 간의 야외임상 비교 연구는 수행되지 아니하여 돼지 생식기 및 호흡기 증후군을 보이는 농장에서 PRRS MLV 백신과 PRRS 서브유닛 백신의 효능을 비교하였다. PRRSV-1 및 PRRSV-2 와의 혼합감염으로 인한 호흡기 질환의 병력을 바탕으로 3 개의 농장이 선택 되었다. PRRS 서브유닛 백신을 접종 한 돼지는 MLV 백신을 접종 한 돼지에 비해 호흡기 질환에 대해 비슷하거나 더 나은 효능을 보였으며 성장률도 좋았다. 그러나 PRRSV-1 및 PRRSV-2 바이러스 혈증이 가장 높을 때, PRRS 서브유닛 백신과 MLV 모두 PRRSV-1 및 PRRSV-2 에 대한 중화항체와 T 세포 반응이 낮은 수준이었으며 이는 PRRSV-1 및 PRRSV-2 혼합감염에 대한 부분적 방어로 여겨진다. 마지막으로 임신 후기 후보돈에서 PRRS 서브유닛 백신의 PRRSV-1 과 PRRSV-2 이종 바이러스 공격접종에 대한 효과를 연구하였다. 공격 균주의 유전형에 관계없이, 백신 접종한 후보돈은 임신 114 일에서 115 일 사이에 정상적으로 분만을 했으나 백신 접종을 하지 않은 후보돈은 임신 105 일에서 110 일 사이에 유산하였다. 또한, 백신 접종한 후보돈은 백신을 접종하지 않은 후보돈에 비해 PRRSV 바이러스 혈증 수준이 상당히 낮았고 바이러스 중화 항체 및 인터페론 -γ 분비 세포 수준이 상당히 높았다. 이러한 결과는 임신돈에서 이종 PRRSV-1 및 PRRSV-2 감염으로 인한 번식 질환에 PRRSV 서브유닛 백신이 효과가 있음을 보여주었다.

Endo-parasites and pathologic findings in narrow-ridged finless porpoise (Neophocaena asiaeorientalis) habiting in Korean seas

김선민 서울대학교 대학원 2020 국내박사

상괭이(Neophocaena asiaeorientalis)는 동아시아에 분포하는 소형 쇠돌고래이다. 최근 그 개체수가 급감하며 멸종위기종으로 분류되고 있다. 한국 바다는 현재 가장 많은 수의 상괭이가 서식하는 곳으로 최근 몇 년간 종 보전을 위한 여러 연구가 수행되어 왔다. 하지만 상괭이의 감염성 질병에 대한 국내 연구는 전무한 상황이다. 상괭이의 기생충성 질병에 대한 분석을 위해 2016년부터 2019년까지 4년 동안 총 107마리의 상괭이를 부검하여 여러 장기의 내부기생충을 채집하였다. 이 기생충들을 기생 부위별로 나누어 형태학적, 유전학적인 방법으로 종 동정을 실시하였다. 총 8종의 선충 (Parurus asiaeorientalis, P. sunameri, Stenurus nanjingensis, Halocercus pingi, H. sunameri, H. taurica, Anisakis pegreffii and Crassicauda magna)과 6종의 흡충 (Nasitrema sunameri, N. spathulatum, N. dalli, Campula oblonga, Synthesium tursionis and S. nipponicum)과 한 종의 조충 (Diphyllobothrium fuhrmanni)이 동정되었다. 이 중 N. dalli와 S. nipponicum은 상괭이 감염의 첫 보고이다. 각 기생충의 유병률은 숙주의 체장, 즉 성장 단계과 유의미한 관련이 있었으며, 이를 통해 H. pingi와 Crassicauda를 제외한 모든 종이 먹이원을 통해 감염되는 것으로 추정된다. 동, 남, 서해의 세 지역에 따른 유병률 차이 및 성별에 따른 유병률 차이는 모든 종에서 유의하지 않은 것으로 드러났다 (P>0.05). 기생충 감염은 숙주의 건강 상태, 질병, 좌초 행동 및 더 나아가 집단의 생존에 영향을 미칠 수 있다. 멸종 위기인 상괭이의 종 보전을 위해 기생충이 숙주에 미치는 영향을 정확히 판단하는 것은 매우 중요하다. 내부 기생충 감염으로 인한 병리적 병변이 발생한 조직에 대하여 육안 및 조직학적 분석을 실시한 결과, 위에서는 궤양, 미란, 출혈, 울혈, 색소 침착, 점막 비후, 박리, 경화, 천공과 과각화 및 위염 등의 다양한 증상이 발견되었다. 간에서는 육아종성 병변 및 담관 벽 비후가 주로 나타났으며, 유선에서는 결절 및 선충 감염에 의한 것으로 추정되는 상피근종 소견이 보였다. 폐에 기생하는 선충은 석회화 결절, 울혈, 기종, 수종 등의 육안적 소견과 기관지 폐렴 및 다발성 기관지염 등의 조직병리학적 소견을 보였다. 이 중 Halocercus pingi는 어미로부터 수직감염되는 것으로 추정되며, 중감염되는 경우 신생 동물의 호흡을 방해해 생존에 치명적인 영향을 미치는 것으로 판단된다. 이 종의 정확한 감염 기전을 밝히기 위해서는 태아에의 감염 또는 유즙 내 충란의 존재를 확인해야 한다. 기생충이 숙주에 미치는 병리적 영향에 대한 보다 정확한 분석을 위해서는 각 기생충의 정확한 생활사 규명이 수반되어야 할 것이다. 바다에 서식하는 기생충 중 가장 많은 연구가 이루어져 비교적 그 정보가 많은 아니사키스 종에 대한 계통분류학적, 계통지리학적 분석을 실시하였다. 동해, 남해 및 서해의 세 해역에서 수집한 상괭이의 위에서 검출된 아니사키스는 모두 Anisakis pegreffii로 동정되었다. 각 해역별로 30마리씩, 총 90마리의 A. pegreffii 세 유전자 (ITS, rrnS 및 cox2) 시퀀스를 분석한 결과, 두 종류의 미토콘드리아 유전자 (rrnS, cox2)의 유전적 다양성은 높은 편이나 핵 유전자 (ITS)는 단 하나의 하플로타입을 나타내었다. 세 해역간의 집단 구조는 없는 것으로 밝혀졌다. 다양한 숙주를 가지는 아니사키스의 간접 생활사 및 세 해역을 분리할만한 지형적 장애물이 없는 지리적 특징이 아니사키스의 유전자 흐름을 원활하게 하는 요인으로 분석된다. 보다 정확한 요인 분석을 위해 아니사키스 속의 중간숙주인 어류, 두족류 및 종숙주인 다른 해양 포유류의 국내 아니사키스 감염 현황에 대한 종합적인 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것으로 생각된다. 세 유전자 중 분화 정도가 가장 높은 미토콘드리아 cox2 유전자를 Genbank에 등록된 세계 여러 해역의 하플로타입과 비교 분석하였다. 그 결과, 한국을 포함한 전 세계의 하플로타입은 크게 두 그룹으로 나뉘었으며 물리적 거리에 비례하는 유전적 거리와 panmixia가 동시에 나타나는 경향을 보였다. 한국 바다에 서식하는 상괭이의 내부기생충을 동정하고 숙주의 성장 단계, 성별 및 서식 해역에 따른 유병률을 조사하여 전체적인 감염 현황을 정리하였다. 상괭이의 위, 장, 간, 폐, 두개골 내 공간, 유선 및 근육 등 다양한 내부 장기에는 선충, 흡충 및 조충이 감염되어 있었다. 대부분의 기생충들은 성장 단계에 따라 식이성으로 감염되는 것으로 확인되었다. 몇 종의 기생충은 상괭이의 건강 상태에 위협이 되고 있다. 멸종 위기에 처한 상괭이의 종 보전을 위해 보다 광범위하고 체계적이며 지속적인 모니터링이 절실히 필요하다. The narrow-ridged finless porpoise (Neophocaena asiaeorientalis) is a small porpoise distributed in East Asia from Taiwan to Japan. The largest number of narrow-ridged finless porpoises inhabit the Korean seas. Several studies were performed to aid the conservation of the species there. However, research on infectious diseases was not performed for this species in Korea. Therefore, parasitic infestations in this species were studied as the first step of research on infectious diseases in narrow-ridged finless porpoises captured in the seas around the Korean peninsula. The narrow-ridged finless porpoises are classified as an endangered species because the population has recently declined sharply in all the countries they inhabit, including Korea, Japan, and China. The purpose of this study is to collect basic biological information about the species which is the most numerous and common in Korean seas, using analyses of parasites as an ecological indicator. During five years (2016 - 2019), a total of 107 narrow-ridged finless porpoises were dissected to examine parasitogenic diseases. The endo-parasites were collected from their organs and tissues during dissection. The collected parasites were classified according to the collected organ, morphological characteristics, and phylogenetic groups. Eight species of nematodes (Parurus asiaeorientalis, P. sunameri, Stenurus nanjingensis, Halocercus pingi, H. sunameri, H. taurica, Anisakis pegreffii and Crassicauda magna) and six species of trematodes (Nasitrema sunameri, N. spathulatum, N. dalli, Campula oblonga, Synthesium tursionis and S. nipponicum) and one cestode species (Diphyllobothrium fuhrmanni) were identified. Two trematodes, N. dalli and S. nipponicum, were first recorded from this porpoise species in this study. The parasite prevalence was significantly related with total body length of the host (in terms of growth stage), suggesting that the porpoise are infected with the parasites except H. pingi and C. magna, through taking food in the seas. The relationship between prevalence of the parasites and sea sector or host sex was not statistically significant (p>0.05). The parasitic infections in the narrow-ridged finless porpoise should be comprehensively surveyed to conserve more effectively this endangered species. The parasitic infections caused gross and pathological lesions in the stomach such as ulcer, erosion, hemorrhage, congestion, mottled macular pigmentation, mucosal hypertrophy, desquamation, solidification, perforation, hyperparakeratosis, and gastritis. In the liver, granuloma and hyperplasia of the bile duct wall were frequently observed. In the mammary glands, solid nodules and myoepithelioma were found. Lung nematodes were found provking the calcified nodules, congestions, emphysema and edema and also histopathological lesions such as bronchopneumonia and multifocal bronchitis. The lungworm, H. pingi was considered to be infected vertically from dam to fetus or calf. When heavily infected, it could be lethal to the neonates by disturbing breathing. To elucidate a mode of infection of this species, infection in fetus and/or existence of eggs in milk of the dam should be investigated. The complete life cycle of each parasite should be investigated for a more accurate examination of the pathological effect on the host species. Phylogenetic and phylogeographical analyses of Anisakis which has been intensively studied compared with other marine parasites were carried out. All nematodes from the stomachs of narrow-ridged finless porpoises inhabiting the three sea sectors of the Korean peninsula—the East sea, the Southern sea, and the Yellow sea—were identified as A. pegreffii. Three genes of 30 worms each from the sea, 90 worms in total were sequenced and analyzed. The mitochondrial genes were highly diverse, while the nuclear genes were conserved, showing only one haplotype in one gene. No genetic population structure among the three sea sectors was found. The indirect life cycle of A. pegreffii which has various intermediate and definitive hosts was analyzed as the factors that facilitate gene flow of A. pegreffii. The topographical features of Korean waters, which have no geographical barrier to separate the three seas were also could make high gene flow of A. pegreffii. A more accurate factor analyses would require a comprehensive examination of the infectious status of the genus Anisakis in other species, including fishes and cephalopods as intermediate hosts, and other final cetacean hosts. The most differentiated gene among the three genes, mitochondrial cox2 gene were compared with haplotypes from worldwide oceans registered in Genbank. The haplotypes of worldwide oceans including the Korean haplotypes from this study were largely divided into two groups. Both of genetic distance related to geographical distance and panmixia of haplotypes were observed. Collectively, this study clarified infection status of the endo-parasites in the narrow-ridged finless porpoises in Korean seas. The narrow-ridged finless porpoises were infected with nematodes, trematodes and cestode in various internal organs. Most of the helminth species were found to infect to the hosts by preying related to growth stage. Several parasite species were found to be fatal to the health status of the narrow-ridged finless porpoises. More extensive, systematic and continuous monitoring are strongly needed for conservation of the species.

Identification of causative agents with high mortality in marine bivalve and application of bacteriophage to prevent Vibrio coralliilyiticus infection

김현중 서울대학교 대학원 2020 국내박사

Ostreid Herpesvirus-1 (OsHV-1)은 부유유생기부터 부착기 단계 치패의 대량 폐사를 유발하는 병원체 중 하나이다. OsHV-1의 감염으로 인한 대량 폐사는 전 세계적으로 매년 지속적으로 발생하고 있지만, 현재까지 그 치료법은 개발되지 않고있다. 2017년 11월 이후, 한국의 해만가리비 종묘 생산장에서 지속적인 대량 폐사가 발생하였다. 5-10일령의 유생이 급속하게 수조의 바닥에 가라 앉으며 90% 이상의 폐사율을 기록 하으며, 이러한 대량 폐사의 지속적인 발생으로 인해 한국의 이매패류 종묘 생산장에서는 원활한 유생의 생산이 불가능하게 되어 그 경제적 손실이 매우 크게 발생하였다. 원인 불명의 대량 폐사 원인체를 규명하기 위해 본 연구가 수행되었고, PCR, sequencing 그리고 TEM을 통한 실험 결과 OsHV-1이 원인체로 지목되었다. PCR을 통한 연구에서 폐사한 모든 유생이 OsHV-1 양성반응을 나타냈으며, TEM을 통한 유생의 조직 검경 결과에서도 viral capsid가 관찰되었다. 검출된 OsHV-1의 염기서열을 분석한 결과, 본 연구에서 분리된 OsHV-1은 OsHV-1 µVar로 분류되었다. 계통분석을 통해 기존에 보고된 OsHV-1들과의 근연성을 분석한 결과, 지리적으로 근접한 한국, 중국 그리고 일본에서 보고된 OsHV-1 µVar보다 유럽의 variants들과 더욱 근연성을 나타냈었다. 본 연구의 결과는 해만 가리비에서 OsHV-1 µVar을 분리 및 분석에 대한 최초의 보고이다. Vibrio spp.는 수생생물의 질병을 유발하는 주요 세균으로 알려져 있으며, 그 중에서도 Vibrio coralliilyticus는 산호와 이매패류 유생의 대량 폐사를 유발하는 주요 원인체로 보고되고 있다. 2000년대 중반 이후 한국의 참굴 종묘 생산장에서 지속적인 대량 폐사가 발생하였으나 원인체가 Vibrio속 세균으로 추정된다는 연구 결과만 있을 뿐, 그 원인체 분석에 대한 명확한 연구는 현재까지 진행되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 국내 최초로 대량 폐사가 발생한 참굴의 종묘 배양장의 유생에서 V. coralliilyticus의 분리 및 동정을 수행하였다. 참굴 유생에 분리된 V. coralliilyticus의 인위감염 실험과 항생제 감수성 검사를 통해 고병원성의 항생제 다재 내성 세균임을 확인하였다. 분리된 V. coralliilyticus의 전체 유전자 염기서열 분석을 통해 2개의 chromosomes (Chr I, Chr II)과 2개의 plasmids (pSNUTY1, pSNUTY2)로 구성된 것을 확인하였다. 두 chromosome의 기능분석 결과, Chr I에 세포의 기본 기능과 관련된 유전자가 Chr II에 비해 더 많이 있는 것으로 확인되었으며, 계통수 분석 결과 본 연구에서 분리된SNUTY-1은 기존에 보고된 V. coralliilyticus strains와 매우 근연한 것으로 나타났다. SNUTY-1은 pSNUTY2라는 독특한 plasmid를 가지고 있는 것으로 확인되었는데, 이는 한국의 분리주가 다른 지리학적 기원에서 나온 V. coralliilyticus들과는 차이가 있음을 의미한다. 본 연구의 결과는 V. coralliilyticus의 생물 다양성에 대한 중요한 통찰력 및 독성인자 연구를 위한 정보를 제공함으로써 양식산업에서의 V. coralliilyticus 감염을 예방하기 위한 데이터로 활용 될 수 있을 것으로 기대된다. 항생제 다재 내성균의 출현과 함께 항생제 대체재 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중, 박테리오파아지 (파아지)는 자연계에 존재하는 친환경 물질로 항생제의 대안으로 지목되어 활발한 연구가 진행중에 있다. 본 연구에서는 이매패류 종묘 배양장에서 참굴 유생의 대량 폐사를 유발하는 항생제 다재 내성 V. coralliilyticus의 감염을 예방하기 위한 방안으로, V. coralliilyticus에 특이적으로 감염하는 파아지의 분리, 특성 분석 그리고 참굴 유생에 직접 적용하여 그 예방효과를 검증하기 위해 실시되었다. 실험 결과, V. coralliilyticus에 감염하는 파아지 pVco-14를 분리하였으며, TEM을 통한 관찰을 통해 Siphoviridae에 속하는 것으로 확인하였다. pVco-14의 특성 분석 및 안정성 검사에서 실제 양식장의 매우 적합한 것으로 확인되었다. pVco-14의 예방 효과를 입증하기 위해 in vivo test를 실시한 결과, 파아지를 처리한 실험군에서 참굴 유생이 월등한 생존율을 나타낸 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 pVco-14가 해양 이매패류 종묘생산장에서 V. coralliilyticus 감염을 예방하기 위한 예방제로 사용될 수 있으며, 항생제의 오남용으로 인한 슈퍼박테리아의 출현 및 환경 오염을 줄일 수 있음을 시사한다. This study was conducted to identify the causative agent with high mortalities in marine bivalve hatcheries in Korea and to find out the alternative method against antibiotics abuses. Since November 2017, high mortalities of larvae of bay scallop (Argopecten irradians) were reported in hatcheries located at the southern area of Republic of Korea. Over 90% of larvae aged 5 to 10 days sank to the bottom of the tank and died. The hatcheries could not produce spat and thus artificial seed production industry incurred huge losses. We identified Ostreid Herpesvirus-1 μVar (OsHV-1 μVar) associated with mass mortality by PCR, sequencing and transmission electron microscopy (TEM). All the samples were positive for OsHV-1 μVar with 99% sequence identity to previously reported OsHV-1 μVar sequences. Partial sequence of ORF-4 of OsHV-1 detected in this study was more closely related to sequences isolated from Europe. This is the first report to confirm the mortality caused by an OsHV-1 infection in the bay scallop. We first isolated and characterized a high virulent of Vibrio coralliilyticus designated as SNUTY-1 that was the cause of Pacific oyster larvae mortality in Korea. SNUTY-1 showed anti-microbial resistance to β-lactams, such as penicillins, cephalosporins, and carbapenems. We sequenced and assembled the complete genome of SNUTY-1 (5,842,676 bp), consisting of two chromosomes (Chr I and Chr II) and two plasmids (pSNUTY1 and pSNUTY2). SNUTY-1 had a unique plasmid (pSNUTY2), which could mean that the Korean isolate is different from other sequenced V. coralliilyticus strains from different geographical origins. Toxic proteins such as cytolysin/ hemolysin and extracellular metalloprotease genes were encoded on Chr I and Chr II of SNUTY-1. These data facilitate the control of V. coralliilyticus infections in aquaculture by providing valuable insights into the biodiversity of this organism and valuable information for the study of virulence factors. We isolated and characterized the phage that specifically infects V. coralliilyticus. The phage was designated pVco-14 and classified as Siphoviridae. We also investigated the potential efficacy of the isolated phage against V. coralliilyticus infection. pVco-14 was stable at wide temperature (4-37℃) and pH (5.0-9.0) ranges. When oyster larvae were pre-treated with the phage before the bacterial challenge, mortality of the phage-treated oyster larvae was lower than that of the untreated control. These results suggest that pVco-14 has potential to be used as a prophylactic agent for preventing V. coralliilyticus infection in marine bivalve hatcheries and can reduce the overuse of antibiotics. Overall, the present study offers important insight into the biodiversity of the OsHV-1 and Vibrio spp. and provides valuable information for the aquaculture. Futher studies are required to determine appropriate treatments for preventing OsHV-1 and V. coralliilyticus infection-induced mass mortality events at marine bivalve hatcheries. As invertebrates, including bivalves, do not have acquired immune systems, disease prevention methods (e.g. vaccination) are very limited compared to fish. Therefore, the application of bacteriophage may be a solution for the prevention of bacterial disease in invertebrates. The results of our study showed that phage potentially can be used as an effective substitute for antibiotics in the field of bivalve artificial seedling production while reducing the generation of antibiotic-resistant bacteria and environmental pollution.

Pharmacokinetics and toxicity evaluation following oral exposure to bisphenol F

이소민 서울대학교 대학원 2022 국내박사

Bisphenol F(BPF) is a substitute material for bisphenol A and is widely used in household products as a raw material for polycarbonate resin, epoxy resin, and plastic reinforcement. It is known to be mainly used in food containers, thermal paper for receipts, and coatings for water pipes. In some countries, BPF has been detected in drinking water and human urine samples. However, due to the lack of safety evaluation data on BPF, it is difficult to establish appropriate guidelines for the proper use of the substance, and social anxiety is increasing accordingly. This study investigated the use, exposure route and distribution flow of BPF, a household chemical. To determine the no-observed-adverse-effect level (NOAEL) and target organ of BPF after exposure, a single-dose oral toxicity, dose-range finding (28 day oral), repeated dose toxicity (90 day oral), and genotoxicity (reverse mutation, chromosomal abnormality, in vivo micronucleus test) tests were performed. The pharmacokinetic profile was also obtained. The test results are as follows; In the pharmacokinetic study, it was confirmed that single oral exposure to BPF resulted in systemic exposure; In single oral dose toxicity test, the approximate lethal dose was found to be 4,000 mg/kg and confusion and convulsion was shown in the test animals. Through the 28-day repeated oral administration toxicity test, the dose concentration of the 90-day repeated administration toxicity test was determined to be 200, 100, 50, 10, and 2 mg/kg/day for males and 1 mg/kg/day for females. In the results of 90-day repeated oral toxicity test results, there was significant weight loss in the test substance administration group of 200 mg/kg/day for males and 30 mg/kg/day or more for females, and lacteal dilatation in the small intestine in the groups administered with males 10 mg/kg/day or more and 15 mg/kg/day or more for females, a decrease in total cholesterol in the male group administered 50 mg/kg/day or more and 5 mg/kg/day or more female administration group and prothrombin time extension in the male 200 mg/kg/day group and female 15 mg/kg/day or more group were observed. All findings showed reversibility. Considering the possibility of unintentional lifetime exposure to BPF, the NOAEL was calculated as 2 mg/kg/day for males and 1 mg/kg/day for females, and the target organ was the small intestine. Genotoxicity tests confirmed that BPF does not induce genotoxicity. The results of this study can be used as a scientific basis for BPF safety management to promote physical and mental health of the public, and it is expected that it will contribute to the revitalization of related industries by relieving anxiety about household chemicals. 비스페놀 F는 비스페놀 A의 대체물질로 폴리카보네이트 수지, 에폭시 수지, 플라스틱 보강재의 원료로 생활용품에 널리 사용되고 있다. 비스페놀 F는 생활화학물질로서 우리 생활에서 주로 식품용기, 영수증용 감열지, 수도관용 코팅 등에 주로 사용된다. 우리나라를 포함한 일부 국가에서는 비스페놀 F가 식수 및 사람의 소변 샘플에서 검출되고 있다. 하지만 비스페놀 F에 대한 안전성 평가 자료가 부족해 물질의 올바른 사용을 위한 적절한 가이드라인을 마련하기 어렵고 이에 따른 사회적 불안도 높아지고 있다. 본 연구에서는 비스페놀 F의 경구 노출에 따른 약동학적 프로파일을 얻을 수 있었고, 단회투여 독성시험, 28일 반복투여 독성시험 및 90일 경구투여 독성시험을 통한 무독성량 (NOAEL, no-observed-adverse-effect level) 및 표적장기 확인 및 유전독성(미생물복귀돌연변이, 염색체이상, in vivo 소핵시험) 시험을 수행하였다. 약동학 연구에서 비스페놀 F에 대한 단일 경구 노출이 전신 노출을 초래하는 것을 확인하였고, 단회 경구투여독성시험에서 대략적인 치사량은 4,000 mg/kg으로 나타났고 실험동물에서 혼미, 경련 등의 증상이 나타났다. 28일 반복 경구투여 독성시험을 통해 90일 반복 투여 독성시험의 투여농도를 수컷 200, 100, 50, 10, 2 ㎎/㎏/day 및 암컷 60, 30, 15, 5, 1 ㎎/㎏/day로 설정하여 시험하였고, 90일 반복투여 독성시험의 경우, 수컷 200 ㎎/㎏/day 및 암컷 30 ㎎/㎏/day 이상 투여군에서 체중 감소, 수컷 10 ㎎/㎏/day 이상 및 암컷 15 ㎎/㎏/day 이상 투여군에서 소장의 암죽관 확장(lacteal dilatation), 수컷 50 ㎎/㎏/day 이상 및 암컷 5 ㎎/㎏/day 이상 투여군의 총 콜레스테롤 감소와 수컷 200 ㎎/㎏/day 및 암컷 15 ㎎/㎏/day 이상 투여군의 프로트롬빈 시간 연장이 관찰되었고 상기 모든 소견은 가역성을 나타내었다. 비스페놀 F가 비의도적으로 일생 기간동안 노출될 가능성을 고려하여 NOAEL은 수컷 2 ㎎/㎏/day 및 암컷 1 ㎎/㎏/day으로 산출하였으며, 표적 장기는 소장으로 판단하였다. 마지막으로 유전독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다. 본 연구의 결과는 비스페놀 F 안전관리의 과학적 근거로 활용되어 국민의 신체적/정신적 건강을 도모할 수 있으며 생활화학물질에 대한 불안감을 해소시켜 관련 산업의 활성화에 기여할 수 있을 것으로 기대한다.

Detection of potential zoonotic viruses in animals and evaluation of antiviral activities of chitosan and nano graphene oxide against coronaviruses

김청웅 서울대학교 대학원 2022 국내박사

Emerging zoonotic diseases have the potential to cause serious human health problems and economic losses. While some zoonotic diseases, such as avian influenza and rabies, have been well investigated, the occurrence and prevalence of newly emerged viral pathogens in livestock and wildlife reservoir species is not well known. Thus, in this study, potential zoonotic viruses in bats and pigs were isolated and genetically analyzed to evaluate the risk of cross-species transmission to humans. The viral isolate from Eptesicus serotinus, HCQD-2020 strain, was subjected to next-generation sequencing and bioinformatic analyses. Sequence annotation results indicated that this strain contains seven common open reading frames (ORFs) in the typical order 5’- UTR-ORF1ab-S-ORF3-E-M-N-ORF7-3’-UTR. The comparison of the whole-genome sequence and the conserved amino acid sequence of replicated proteins also revealed that the new strain was distantly related with other known species in the alphacoronavirus genus. Additionally, phylogenetic and in silico prediction analyses suggested that this novel species of alphacoronavirus strain is capable of cross-species infection, especially in the order Artiodactyla. To investigate the prevalence of Torque teno sus virus (TTSuV) in livestock animals, TTSuVs were isolated from pigs with respiratory problems (n = 470). Phylogenetic analyses of these viruses were conducted to evaluate the cross-species transmission of the viruses. In total, positive rates of 16% (75/470) and 36% (168/470) were detected for TTSuV1 and TTSuV2, respectively. Thirty-eight (8%) of the 470 pigs were detected as co-infections of TTSuV1 and TTSuV2. Whole genome sequencing analyses revealed that two strains, M117 and N86, belong to subtype 1b and 1c of TTSuV1 and the N116 strain was located in subtype 2b. Furthermore, two field strains, M256 and N119 were determined to be within genogroup 3 of subgroup 3c, which contains highly conserved ORFs of Anelloviruses. Development of effective disinfectants against zoonotic pathogens is one of the most urgent prerequisites for prevention of transmission and outbreak of zoonoses. Therefore, the antiviral effects of two natural substances, chitosan and nano-graphene oxide (nanoGO), against coronaviruses were evaluated. When 1% chitosan solution was used at a 100-800-fold dilution concentration, the porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) titer decreased over 4 log10 TCID50//mL compared to the control virus. Similarly, 1% nanoGO solution with 500-800 fold dilution concentration effectively reduced PEDV and BCoV infection titers over 4 log10 TCID50//mL compared to the control groups. Cytotoxicity of chitosan and nanoGO was not observed in Vero cell lines at all concentrations tested, suggesting that chitosan and nanoGO have strong antiviral activities against coronaviruses without cytotoxic effect. Although future studies of cytotoxicity in other cell lines are required, chitosan and nanoGO are safe ingredients for use as non-toxic disinfectants against zoonotic viral diseases such as coronaviruses. Furthermore, continuous surveillance of novel zoonotic viral pathogens in wildlife and livestock animals along with the development of an effective decontamination strategy should be maintained to respond to crises caused by zoonotic pathogens. 최근 신종 및 변종 인수공통 바이러스(zoonotic virus)의 출현으로 전 세계의 공중보건학 위험의 증가와 함께 막대한 경제적 손실을 초래하고 있다. 이들 대부분 바이러스는 동물에서 유래하였으며, 향후 사람에게 질병을 유발할 수 있는 잠재적인 인수공통 바이러스들이 여전히 자연계에 존재하고 있다. 따라서 사람으로의 종간 전파를 초래할 수 있는 동물 바이러스들을 조사하고, 이들 바이러스의 인체 감염 가능성을 선제적으로 평가하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 국내 서식 박쥐와 국내 사육 돼지에서 각각 신종 바이러스를 분리하고, 이들 바이러스가 인수공통 바이러스로서 인체에 잠재적인 위험이 있는지를 평가하기 위하여 유전체 분석 및 계통유전학적 분석을 하였다. 그리고, 이러한 인수공통 바이러스의 전파를 효과적으로 차단·제어할 수 있는 소독제 개발을 위하여 천연물질인 키토산 (chitosan)과 나노그래핀 옥사이드 (nano-graphene oxide, nanoGO)의 코로나바이러스에 대한 소독 효과를 평가하였다 먼저, 2020년 7월부터 9월까지 강원과 경북지역에 서식하고 있는 박쥐 4종 6개체에서 신종 바이러스 분리를 시도하였다. 그 결과 경북 지역에서 서식하고 있는 문둥이박쥐 (Eptesicus serotinus)에서 코로나바이러스를 분리하였으며, 바이러스 분리주 HCQD-2020는 전자현미경 관찰에서 코로나바이러스의 특징적인 형태를 보였다. 또한 계통유전학적 분석 결과 이 바이러스는 알파코로나바이러스에 속하였으며, 그동안 밝혀지지 않은 새로운 종(species)으로 밝혀졌다. 전장유전체 시퀀싱 결과 HCQD-2020의 유전체의 길이는 28,000 bp 이며 총 7개의 Open reading frame (ORF)로 이루어져있었다. 알파코로나바이러스에서 보존된 부위로 알려진 아미노산 영역(region)은 총 7개로서 nonstructural proteins (Nsp) 3, Nsp5, 및 Nsp12~16이다. HCQD-2020과 다른 알파코로나바이러스를 비교 분석한 결과 7개 영역 모두에서 유사도가 International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV)에서 지정하는 intraspecsies cutoff 기준인 90% 이하였다. 또한 전장유전체를 이용한 계통유전학적 분석 결과 HCQD-2020는 알파코로나바이러스에 속하였다. ORF1a, ORF1b 및 4개의 주요 단백질 코딩 유전자 대상으로 topology 분석을 하였으며 ORF1a, ORF1b를 제외한 다른 유전자에서는 다른 종과 유사도가 낮았다. 다른 숙주 감염 가능성을 평가하기 위해 In silico 분석한 결과 우제목 (Artiodactyla)와 양박쥐아목 (Vespertilioniformes) 모두 감염될 수 있으며 이는 HCQD-2020가 종간 전염을 일으킬 수 있는 것으로 예측되었다. 다음으로, 돼지 유래 토크티노바이러스 (Torque teno sus virus, TTSuV)로 인한 국내 사육 돼지에서의 유병률을 조사하고, 돼지에서 유행하고 있는 바이러스와 사람 바이러스 간의 유전적 관련성을 계통유전학적으로 분석하였다. 전국 9개 지방에서 2017~2018년에 걸쳐 총 470 샘플을 수집하였으며 TTSuV1 양성검출률은 16%(38/470)였으며 TTSuV2의 경우 36%(168/470) 였다. TTSuV1 과 TTSuV2 동시 감염 양성검출률은 8%(38/470) 였다. 양성샘플 중 3 종(M117, N86, N116)에 대하여 전장유전체분석을 진행하였고 M117과 N86은 각각 TTSuV1 subtype 1b와 1c에 속하며 N116은 TTSuV2 subtype 2b에 속하였다. 추가적으로 돼지샘플에서 사람에게서 발견되는 TTV genogroup 3을 검출하였다. 총 2개의 종(M265, N119)이 검출되었으며 모두 전장유전체는 3,817 bp 이며 M265는 3개의 ORF(ORF1, ORF2, ORF3)로 N119는 4개의 ORF(ORF1, ORF2-1, ORF2-2, ORF3)으로 구성되어 있었다. 이 종들은 98.4%의 일치율을 보였으며, ORF1 기준으로 다른 TTVs 와 계통유전학적 분석 결과 genogroup3의 subgroup 3c에 속하였다. ORF1, ORF2, ORF3 아미노산 비교분석 결과 분리된 두 스트레인은 다른 TTVs 와 아르기닌 풍부 지역 또는 motif 같은 공통적인 서열이 확인되었다. 이는 돼지에서 발견된 스트레인이 사람에게서 발견된 TTV와 관련성이 있음을 의미한다. 사람과 동물에서 공중보건학적 및 경제적 피해를 초래하는 코로나바이러스들에 대한 소독제 연구가 활발히 이루어지고 있다. 본 연구에서는 천연물질인 키토산과 나노그래핀 옥사이드가 코로나바이러스에 대한 항바이러스 효능이 있는지를 in vitro cell culture 시스템을 이용하여 경수 희석액 과 유기물 희석액 조건에서 평가하였다. 키토산의 경우 porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)를, nanoGO의 경우 PEDV, bovine corona virus (BCoV), 및 SARS-CoV-2를 사용하여 항바이러스 효능을 평가하였다. 키토산은 1% 수용액으로 100~800배수 희석농도로 30분간 처리하였을 때 경수 희석액 조건에서 150배 희석배수까지, 유기물 희석액 조건에서는 100배 희석배수까지 PEDV 감염 역가 (infectious titer)가 control 바이러스에 비해 104 이상이 감소하였다. 나노그래핀 옥사이드는 1% 수용액으로 50~800배수 희석농도로 30분간 처리하였을 때 유기물 희석액 조건에서는 100배 희석 배수까지 PEDV와 BCoV 감염 역가가 대조군 보다 104 이상이 감소하였다. 키토산과 나노그래핀 옥사이드는 실험한 모든 희석농도에서 세포독성을 보이지 않았다. Immunofluorescence assay (IFA) 결과에서는 키토산이 경수 희석액 조건에서는 50배 희석배수, 유기물 희석액 조건에서는 1배 희석배수까지 PEDV의 감염 억제하였으며, 나노그래핀 옥사이드는 유기물 희석액 조건에서 50배 희석배수까지 PEDV 및 BCoV의 감염을 억제하였다. 또한 나노그래핀은 중화 실험에서 8배 희석배수까지 SARS-CoV-2를 억제하는 것을 확인하였다. 결론적으로 키토산과 나노그래핀 옥사이드는 코로나바이러스에 대하여 유의미한 제어 효과가 있으며 또한 세포독성을 나타내지 않았다. 이상의 결과를 종합할때, 야생동물 및 주요 산업동물에서 코로나바이러스 및 토크티노바이러스와 같은 인수공통전염병 유발 바이러스들이 존재하고 있어 이에 대한 지속적인 감시 및 연구가 필요하고, 이들 바이러스의 전파 및 감염병 발병을 최소화할 수 있는 신규제어물질에 대한 지속적인 연구 또한 필요하다고 판단된다.

Studies on improving the efficacy of fish vaccines using a novel methodology : antigen, administration, and delivery

윤새길 서울대학교 대학원 2020 국내박사

Control and prevention of disease is a high priority in aquaculture, and vaccination is important to prevent outbreaks. Here, poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles (MPs) approximately 36 μm in diameter were used to encapsulate and deliver Aeromonas hydrophila formalin-killed cells (FKC) as an antigen, and the innate and adaptive immune responses of cyprinid loaches and common carp were assessed following vaccination. The antigen was confirmed to be well encapsulated by scanning electron microscopy analysis of PLGA MP sections. Blood and head kidney specimens were collected and analyzed for bacterial agglutination activity and relative mRNA expression of immune-related genes (IL-1β, IL-10, TNF-α, lysozyme C, TGF-β, and IgM) at 2, 4, 6, and 8 weeks post vaccination (wpv). For both fish species, the curve of antibody titer over time was shallower in the PLGA group than the FKC group. These titers in loaches and carp were very similar in the two vaccination groups until 8 and 6 wpv, respectively, but differences were subsequently noted in both species until the end of experiment. Loaches and carp were then challenged with A. hydrophila at 12 and 20 wpv, and 10 and 14 wpv, respectively, and relative survival rates were calculated. For both species, the PLGA groups demonstrated higher survival rates at all time points. Relative expression of IL-1β and TNF-α mRNA was significantly upregulated in the PLGA group at 2 and 4 wpv. Moreover, PLGA-MP vaccination increased relative mRNA levels of lysozyme C and IgM, which were significantly higher than those observed with FKC treatment at 2 wpv and 4, 6, and 8 wpv, respectively. In conclusion, PLGA-MP vaccines have the potential to induce longer and more potent immune responses than FKCs alone, and protect both cyprinid loaches and common carp with greater efficiency. Over the last 50 years, various approaches have been established for the development of antigens for immunostimulation. We used phage lysate (PL), composed of inactivated antigens by the lytic bacteriophage pAh 6-c for A. hydrophila JUNAH strain to develop a vaccine for the prevention of A. hydrophila infection in Cyprinus carpio (common carp). We also assessed the poly D,L lactide-co-glycolic acid (PLGA) microparticles encapsulation method to increase the efficiency of the vaccine. Six groups of vaccines involving encapsulated by PLGA, formalin killed cells, or phage lysate at low or high concentration were prepared for intraperitoneal injection in C. carpio. Blood specimens and head kidney samples were collected at various time points for bacterial agglutination assay and to assess relative expression of immune-related genes interleukin-1 beta (IL-1β), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), lysozyme C, and serum amyloid A (SAA). The vaccine groups using high dose phage lysate antigen showed significantly higher agglutination titers than all other groups at 4- and 6-weeks post vaccination (wpv), with the titer of the PLGA encapsulated vaccine group being highest from 10 wpv to the end of the experiment. The survival rate of fish immunized with the phage lysate vaccines were higher than that of fish immunized with the formailin killed cells vaccine in the challenge experiment conducted 6 wpv. Additionally, the PLGA-encapsulated high dose phage lysate antigen vaccinated groups showed the best protective efficacy in the challenge experiment 12 wpv. Vaccines using the phage lysate antigen also showed higher IL-1β and lysozyme C gene expression at 7 days post vaccination (dpv) and 2 wpv, and higher TNF-α gene expression was seen at 7 dpv. Higher SAA gene expression was seen in these groups at 1 dpv. These results suggest that phage lysate antigen has the potential to induce robust immune responses than formalin killed cells-based vaccines, and could be more effective as a novel inactivated antigen in preventing A. hydrophila infection in C. carpio. Immunization by bath immersion is likely the simplest method of fish vaccination. Although the route of immunogenicity has not been fully identified, immersion vaccination is clearly a useful labor-saving technique. In this study, microbubble (MB) treatment was assessed for its ability to improve the efficacy of bath immersion vaccination in the cyprinid loach. MBs are commonly defined as minute particles of gas with a diameter of less than 100 μm, which generated free radicals. Here, the efficacy of MB treatment for vaccination enhancement in the cyprinid loach was assessed in direct challenge experiments using the virulent A. hydrophila JUNAH strain; assessments comprised agglutination titer assay and non-specific parameter analysis. Agglutination titers were high in loaches that were immunized via injection with inactivated cells (FKC group); however, non-specific immune activation parameters (e.g., lysozyme, superoxide dismutase, and phagocytic activity) were more increased in loaches that were immunized via bath immersion with MB treatment. Moreover, MB-treated loaches showed comparable survival rates, relative to loaches immunized via injection with formalin inactivated cells. Thus, higher levels of non-specific immune parameters suggest increased efficacy of this vaccine approach. Improving the effectiveness of bath immersion vaccine will increase its affordability and ease of application in aquaculture. In this study, the methods of encapsulating antigen with a biodegradable material, strengthening immersion vaccines, and use of novel antigen were applied to enhance the effectiveness of fish vaccines against A. hydrophila infection. The efficacy of the methods used in this study was verified through analysis of adaptive and innate immunity and performing a challenge experiment compared to the FKC vaccine, and excellent results were achieved. Therefore, these methods will be useful to prevent diseases caused by fish pathogens. We should attempt to develop better vaccines, considering the rising economy in aquaculture and public health of consumers. 수산업에서 질병의 제어와 예방 아주 높은 우선순위를 가지며, 백신은 이 질병의 발생을 예방할 중요한 수단이다. 여기서, 대략 36 마이크로미터 크기의 poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles (MPs)을 사 용하여 Aeromonas hydrophila formalin-killed cells (FKC)을 항원으로 캡슐화 하였으며, 미꾸라지와 잉어에서 선천 및 적응 면역 반응을 평가하였다. PLGA MP 절편의 주사 전자 현미경 분석을 통해 항원은 잘 캡슐화 된 것을 확인 하였다. IL-1β, IL-10, TNF-α, lysozyme C, TGF-β, 그리고 IgM의 면역 관련 유전자의 상대적 mRNA 발현과 세균 응집 활성의 분석을 위 해 혈액 및 두신 샘플을 수집하였다. 두 어종 모두에서 항체 역가 곡선 은 PLGA 그룹이 FKC 그룹보다 완만하였다. 미꾸라지와 잉어의 항체 역가는 각각 8주와 6주를 기점으로 실험 종료에 가까워질수록 FKC 그룹과의 차이가 벌어지기 시작하였다. 이후 두 어종은 각각 12주와 20주 그리고 10주와 14주에 A. hydrophila 균주를 공격접종 하였으며, 상대 생존률을 계산하였다. 두 종 모두에서 PLGA 그룹이 모든 실험 시점에서 높은 생존률이 나타났다. IL-1β와 TNF-α의 mRNA는 PLGA 그룹에서 2주와 4주에 유의미하게 상향 조절되었다. 더욱이 PLGA-MP 백신접종은 lysozyme C와 IgM의 mRNA 유전자 발현량이 각각 2주와 4주 그리고 6주와 8주에서 유의미하게 높게 나타나는 것을 확인하였다. 결론적으로 PLGA MP 백신은 FKC 백신보다 더 길고 강한 면역 반응을 유도할 가능성이 있으며, 미꾸라지와 잉어의 질병을 예방하는데 큰 효과가 있을 것으로 보인다. 지난 50년 동안 면역자극을 위한 항원의 개발을 위해 다양한 접근법 들이 만들어져 왔다. 우리는 A. hydrophila JUNAH의 용해성 박테리오파아지인 pAh 6-c를 이용하여 불활화한 항원으로 구성되어 있는 파아지 용해물을 사용하여 잉어에서 A. hydrophila 감염을 예방하는 백신을 개발하고자 하였다. 앞선 연구에서 사용된 PLGA를 이용하여 항원을 캡슐화하여 백신으로 사용하였으며, 이를 선천면역과 적응면역 반응을 측정하여 효과를 평가하였다. 항체 역가 실험에서는 PLGA를 사용한 그룹이 캡슐화 없이 단독의 항원인 FKC나 phage lysate를 사용한 그룹보다 높은 항체가를 보여 주었다. 그러나 같은 PLGA 그룹 내에서도 phage lysate를 사용한 그룹이 FKC를 캡슐화한 그룹보다 높은 항체가를 나타내었다. TNF-α, IL1β, lysozyme C, 그리고 SAA의 유전자 발현 또한 PLGA 그룹이 높은 발현량을 보였으며, phage lysate를 사용한 그룹이 더 높은 발현량을 보였다. 이러한 결과는 종합적으로 phage lysate가 FKC 보다 강도 높은 면역 반응을 유도할 잠재력이 있음을 보여준다. 침지법을 통한 면역강화는 어류 백신접종법 중 가장 쉬운 방법으로 보인다. 면역원성을 제공하는 경로가 아직 완전히 밝혀지지는 않았음에도 침지 백신법은 노동력 절감을 위한 아주 용이한 방법임에는 틀림이 없다. 본 연구에서는 마이크로버블 처리가 잉어에서 침지 백신의 효율을 증가시키는 능역이 있음을 평가하고자 한다. 마이크로버블은 약 100 마이 크로미터 미만의 직경을 가지는 작은 가스 입자로 정의하고는 한다. 여기서는 백신의 효율 증진을 위한 마이크로버블 처리의 효율을 잉어에서 항체가와 면역인자 분석을 통해 평가하고자 한다. 항체가에서는 FKC를 복강 주사한 그룹이 침지 그룹들 보다 높게 나타났지만, lysozyme, superoxide dismutase, 그리고 phagocytosis 활성은 오히려 마이크로버블을 처리한 침지그룹에서 더 증가하는 것을 확인 하였다. 더욱이 마이크로버블 처리 그룹의 미꾸라지는 FKC 주사 그룹과 비교했을 때 비슷한 생존율을 보였다. 비특이성 면역 파라미터의 높은 수준은 이 백신법이 효력 증가를 시킬 수 있음을 보여준다. 지금까지의 연구들에서 생분해성 물질을 이용한 항원의 캡슐화 방법, 침지 백신의 효과 증진을 위한 방법, 새로운 항원의 적용을 통해 A. hydrophila 감염에 대한 어류백신의 효과를 향상시키고자 하였다. 본 연구에서 사용된 방법론들은 선천 면역과 적응 면역 반응의 분석과 공격실험을 통해서 기존의 FKC 백신과 비교하고자 하였으며, 훌륭한 결과를 보여주었다. 그러므로 이 방법론들은 어류 질병의 예방을 위해 가치가 있을 것으로 보인다. 앞으로 우리는 수산업이라는 특성을 고려한 더 나은 백신의 개발과 공중 보건을 위해 노력해야 할 것이다.

Molecular epidemiology and characterization of recently identified H9N2 subtype influenza A viruses from wild birds in Korea

남치영 서울대학교 대학원 2023 국내석사

조류인플루엔자 바이러스는 Orthomyxoviridae에 속하는 인플루엔자 A 바이러스로, 야생조류 특히 물새류가 중요한 자연 숙주이다. 이 바이러스는 8개 RNA 유전자 분절로 된 게놈을 가지고 있어 바이러스 변이와 바이러스 간 재조합에 의한 신종 또는 변종 바이러스의 출현이 빈번하게 일어난다. 조류인플루엔자 바이러스는 16개의 H형과 9개의 N형이 존재하며, 자연계에서 바이러스 간 유전자 재조합을 통하여 144개의 아형 조합이 가능하다. 이 중, 조류인플루엔자 H9N2 바이러스는 전 세계적으로 야생조류와 가금류에 널리 퍼져 있는 대표적인 아형이다. 이 바이러스는 유전적으로 G1, Y439, Y280 등 최소한 세 개 이상의 하위 계통을 가지고 있다. 이 중 Y280 및 G1 하위 계통의 H9N2 조류인플루엔자 바이러스는 가금 산업에서의 경제적 피해 뿐만 아니라, 인체 감염을 일으킨 사례들도 보고되었다. 국내의 경우 Y439 하위 계통의 H9N2 조류인플루엔자와 Y280 하위 계통의 H9N2 조류인플루엔자가 1996년과 2020년에 각각 국내에 유입되어 가금 농장에 경제적 피해를 초래하였다. 본 연구에서는 조류인플루엔자 국내 예찰 프로그램을 통하여 2020/2021 동절기 동안 채취한 2,890개의 야생조류 분변 시료에서조류인플루엔자 H9N2 바이러스를 분리하여 생물학적 및 분자유전학적 특성을 조사하였다. 그 결과 조류인플루엔자 바이러스 13주(H1N1형 5주, H3N2형 4주, H9N2형 4주)를 분리하였다. 이 중 H9N2 분리주는 모두 전남 해남 지역에 서식하는 회색기러기(Anser anser) 군집으로부터 분리하였다. 조류인플루엔자 H9N2 바이러스 분리주는 모두 유전적으로 동일하여, 그 중 A/Greylag goose/South Korea/SW21/2021 (H9N2, 이하 SW21)를 선발하여 바이러스 특성 조사에 사용하였다. 조류인플루엔자 H9N2 바이러스 SW21 분리주는 56°C에서 30분 이상 열처리 한 이후에도 HA 활성을 유지하는 열 내성 바이러스였다. 또한, 이 바이러스는 HA유전자 분절이 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 특성인 HA분절부위의 monobasic amino acid 서열(PAASDR/GLF)을 가지고 있었으며, 종란 계태아에 대한 치사성을 나타내지 않았다. 이 바이러스 분리주는 포유류 세포(MDCK와 A549세포)에서 낮은 증식성을 보였으며, 게놈 분석에서도 포유류 병원성과 관련된 유전자 부위에서 변이가 관찰되지 않았다. 백신주로 사용되고 있는 H9N2 바이러스인 01310 E20과 표면단백질들의 아미노산 서열들을 비교한 결과, SW21과 01310 E20의 항원성 차이는 교차방어가 성립하지 않는 Y280 하위계통의 바이러스에 비해 현저히 적었다. 본 연구에서는 SW21 분리주 게놈의 염기서열 분석을 실시하여 분자유전학적 특성을 조사하였다. 이를 위하여 2019년 이후 야생조류(오리 및 기러기)에서 분리된 조류인플루엔자 H9N2바이러스 분리주 5주의 유전자 정보를 포함하였다. 그 결과, 국내 야생조류에서 분리된 조류인플루엔자 H9N2 바이러스 분리주는 유라시아 계통과 북미 계통의 다양한 야생조류 바이러스들로부터 유전자를 획득하여 출현한 재조합 바이러스였다. 이들 바이러스의 유전자 재조합 양상은 분리 시기와 야생조류 종에 따라 다양하였다. 이 결과는 유라시아 뿐만 아니라 북미 대륙 야생조류에서 존재하는 바이러스 간에 철새 이동경로의 교차 지점(번식지)에서 조류인플루엔자 바이러스 간 유전자 교환이 빈번하게 일어나고 있음을 시사한다. 국내 가금에서 분리된 조류인플루엔자 H9N2 바이러스 분리주의 계통분석학적 분석 결과, Y439 하위 계통 바이러스는 유라시아 계통의 야생조류 바이러스 분리주와 유전적 관련성을 나타내었다. 그러나, Y280 하위 계통 바이러스는 인근 국가에서 유행하는 가금 바이러스와 유전적 관련성을 보여 이 바이러스의 국내 유입 과정에서의 야생 조류의 관련성을 찾아내지 못했다. 결론적으로, 본 연구 결과는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스가 동절기 야생 철새를 통하여 지속적으로 국내에 유입되고 있다는 사실을 말해준다. 또한, 본 연구를 통하여, 유라시아와 북미 대륙에서 존재하는 다양한 조류인플루엔자 바이러스 간 유전자 재조합이 빈번하게 일어나고 있음을 밝혀냈다. 중요하게도 야생 철새에서의 고병원성 조류인플루엔자 H5Nx 바이러스의 신종 출현 과정에서 저병원성 조류인플루엔자 바이러스가 내부 유전자 공여자 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 따라서 본 연구 결과는 가금 산업 피해 예방과 공중보건 향상을 위하여 야생조류 특히 철새에서의 지속적인 조류인플루엔자 예찰의 필요성과 중요성을 강조한다. Avian influenza virus (AIV) is a member of the influenza A virus in the family Orthomyxoviridae, and its natural reservoir is wild birds, especially waterfowl. AIV has an RNA genome, comprising eight gene fragments; thus, the emergence of novel AIVs or their variants frequently occur in nature through mutations and genetic re-assortments. AIV has 16 hemagglutinin (HA) types and 9 neuraminidase (NA) types, and 144 AIV subtypes can be generated by recombining HA and NA subtypes in nature. Of them, the H9N2 subtype virus is widespread in wild birds and poultry worldwide, and genetically has at least three sublineages such as G1, Y439, and Y280. In particular, Y280 and G1 sublineages of H9N2 AIV cause clinical diseases in poultry, especially in East Asia, and even human infections. In Korea, two sublineages, Y439 and Y280, of H9N2 AIV have been introduced from neighboring countries in 1996 and 2020, respectively, and their epidemics resulted in substantial economic loss in the poultry industry. This study screened the collected fecal samples of wild birds during the winter season of 2020/2021 as a part of the National Avian Influenza Surveillance Program by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. RT-PCR-positive fecal samples were inoculated to chicken embryonated eggs, and biological properties and genomic characteristics of an isolated H9N2 subtype AIV were analyzed. Results revealed that 13 AIVs, including H1N1 (n = 5), H3N2 (n = 4), and H9N2 (n = 4), were isolated from fecal samples of wild birds. Of them, H9N2 AIVs were all isolated from a population of Greylag goose (Anser anser) in Haenam, Jeollanamdo province. The H9N2 AIV isolates were all genetically identical to each other; thus, representative isolates A/Greylag goose/South Korea/SW21/2021 (H9N2, abbreviated SW21) were selected for the study. The H9N2 AIV isolates SW21 are heat stable and retain HA activity at least for 30 min at 56°C. In addition, the SW21 (H9N2) virus has a monobasic amino acid sequence (PAASDR/GLF) at the HA cleavage site, with characteristics of low pathogenicity AIV (LPAI), and low lethality for chicken embryonated eggs. The SW21 (H9N2) virus poorly propagated in mammalian cells (MDCK and A549) compared to human influenza A virus strain PR8. In addition, genetic mutations associated with mammalian adaptation were not found in the genome of the SW21 (H9N2) virus. Next, the full genome of the SW21 (H9N2) virus was sequenced. Previously reported sequences of other H9N2 AIV isolates (n = 5) from wild ducks and geese in Korea since 2019 were added to the analysis. Phylogenetic analyses of each segment of six viruses were performed with reference influenza virus sequences. Results revealed that Korean isolates of H9N2 AIV from wild birds were re-assortment viruses that acquired genes from various AIVs from Eurasia (EA), North America (NA), and Eurasia–Pacific America (EA–PA) lineages. The re-assortment pattern varied depending on virus isolate, isolation time, and bird species. This finding implies that genetic exchange between multiple AIVs might actively occur in natural reservoirs, such as ducks and geese in their habitats, and even in overlapping areas (e.g., Siberia and Alaska) between different migratory bird flyways. Y439 sublineage viruses closely related to H9N2 viruses from wild birds in Eurasia were found in H9N2 AIVs from poultry birds in Korea. This suggests the possibility that wild birds, especially ducks and geese, might have carried Y439 sublineage viruses into Korea. Eight genes of Y280 sublineage poultry viruses were all closely related to poultry viruses of the same sublineage in EA but not to Y439 sublineage poultry viruses and viruses from wild birds. This indicates that the Y280 lineage virus excreted from poultry of neighboring countries is highly likely to be directly transmitted to domestic poultry via unknown routes rather than the virus of the Y280 lineage being introduced into Korea through wild birds or recombination of Y439 lineage viruses. However, this does not guarantee that wild birds are unrelated to the introduction of Y280 sub-lineage viruses into Korea. So, it is still not clear by which routes the virus had been introduced into Korea. In conclusion, the results revealed that re-assortment events have frequently occurred between various AIVs, and they have been frequently introduced into Korea through the wild bird migration during the winter season. Importantly, LPAI viruses have been reported as a donor of internal genes to H5Nx and H7N9 AIV, which cause clinical diseases in poultry and even fatal human infections. Therefore, results emphasize the necessity and significance of strengthening AIV surveillance for disease prevention in poultry and public health.

Preventive Effect of Molybdate on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

이승우 서울대학교 대학원 2019 국내박사

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is categorized into non-alcoholic fatty liver (NAFL) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and has emerged as a common public health problem that can progress to end-stage liver disease, such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). However, the underlying mechanisms of NAFLD pathogenesis are not fully understood and there are no medications approved by the Federal Drug Administration for the treatment of NAFLD. Hepatic steatosis, characterized with excessive hepatic lipid accumulation, is the hallmark pathological finding in NAFLD and oxidative stress is a major pathologic contributor to development of NAFLD. The endoplasmic reticulum (ER) stress caused by accumulation of unfolded proteins in the ER may play an important role in the progression and development of NAFLD. Autophagy plays a major role in cellular homeostasis and impaired autophagy may contribute to the pathogenesis of NAFLD. Autophagy and apoptosis are interconnected stress response pathways. In the present study, expression of proteins associated with ER stress, autophagy and apoptosis was analyzed in human NAFL and NASH tissues to elucidate the roles of those proteins in pathogenesis of NAFLD. Levels of some ER stress?transducing transcription factors, such as cleaved activating transcription factor 6 (ATF6), spliced X-box binding protein 1 (XBP1s) and CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein (CHOP), were higher in NASH than in the normal tissues. However, the expression of a majority of the ER chaperones and foldases analyzed, including glucose-regulated protein 78 (GRP78) and protein disulfide isomerase (PDI), was lower in NASH than in the normal tissues. Levels of apoptosis markers, such as cleaved poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), were also lower in NASH tissues, in which expression of some B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) family proteins was up- or down-regulated compared to the normal tissues. The level of the autophagy substrate p62 was not different in NASH and normal tissues, although some autophagy regulators, such as autophagy protein 16L1 (ATG16L1) and microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3-II (LC3-II), were up-regulated in the NASH tissues compared to the normal tissues. Levels of most of the proteins analyzed in NAFL tissues were either similar to those in one of the other two types, NASH and normal, or were somewhere in between. These findings suggest that regulation of certain important tissues processes involved in the unfolded protein response (UPR) and apoptosis were broadly compromised in human NAFLD tissues. A previous study reported that treatment with molybdate reduces hepatic levels of lipids in diabetic rats. Potential activities of molybdate as an antioxidant have also been demonstrated in various animal models. Accordingly, I evaluated the effects of sodium molybdate dihydrate (SM) on hepatic steatosis and associated disturbances in a widely used mouse model of the metabolic disease. Male C57BL/6 mice at 10 weeks of age were fed a methionine- and choline-deficient diet (MCD) and bottled water containing SM for four weeks. The SM treatment markedly attenuated MCD-induced accumulation of lipids, mainly triglycerides, in the liver. Lipid catabolic autophagic pathways were activated by SM in the MCD-fed mouse livers, as evidenced by increased formation of LC3-II together with decreased levels of the autophagic substrate p62. MCD-induced oxidative damage, such as lipid and protein oxidation, was also alleviated by SM in the liver. However, the SM treatment did not affect the expression of ER stress-related proteins in the MCD-fed mouse livers. The level of MCD-induced hepatocellular damage was not also affected by SM. These findings suggest that molybdate effectively prevents MCD-induced lipid accumulation without causing adverse effects in the mouse liver, and that the lipid catabolic processes may involve the activation of autophagy. Taken together, the present study may provide an insight into the pathogenesis of human NAFLD and suggests a beneficial effect of molybdate in the treatment and prevention of NAFLD. 비알콜성 지방간 질환 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 단순 지방간 (non-alcoholic fatty liver, NAFL)과 지방 간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH)을 포함하는 질환으로 간경화 (cirrhosis) 및 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma)을 포함한 말기 간 질환으로 진행될 수 있기 때문에 중요한 공중 보건 문제로 다루어지고 있다. 그러나 NAFLD의 발병 기전은 완전히 규명되지 않았으며, 현재까지 치료제로서 미국 연방 식품의약국의 승인을 받은 약물은 없다. 간 내 과도한 지방 축적은 NAFLD의 특징적인 병리학적 소견이며, 활성산소종 (reactive oxygen species)의 증가로 인한 산화적 스트레스 (oxidative stress)는 NAFLD 발병의 주요 인자로 알려져 있다. 그리고 NAFLD의 발병과 진행에 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 내 미접힘 단백질 (unfolded protein)의 축적에 의해 유발되는 소포체 스트레스 (ER stress)가 중요한 요소로 작용할 수 있다고 최근 보고되었다. 또한, 세포 내 손상된 소기관과 단백질, 지질 등을 분해하는 자가포식 (autophagy)작용이 NAFLD 발병과 관련이 있음을 시사하는 연구도 보고된 바 있다. Autophagy와 세포사멸 (apoptosis) 작용은 서로 억제하면서 교차 조절한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 NAFLD의 분자생물학적 경로를 규명하고자 사람의 NASH, NAFL 그리고 정상 간 (normal) 조직에서 ER stress, apoptosis, autophagy와 관련된 단백질들의 발현 수준을 western blot을 통해 분석하였다. 그 결과, ER stress 신호전달 전사인자인 cleaved activating transcription factor 6 (ATF6), spliced X-box binding protein 1 (XBP1s) 그리고 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein (CHOP)의 단백질 발현 수준은 normal 조직에 비해 NASH 조직에서 더 높았다. 반면, 미접힘 단백질 반응 (unfolded protein response, UPR)에 관여하는 glucose-regulated protein 78 (GRP78)과 protein disulfide isomerase (PDI)를 포함한 ER 샤페론 및 폴딩 효소들의 발현 수준은 normal 조직에 비해 NASH 조직에서 더 낮았다. NASH 조직에서 B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) 계열 단백질들의 발현 조절장애 (dysregulation)가 관찰된 가운데, cleaved poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)과 같은 apoptosis 마커 단백질들의 발현 수준은 normal 조직에 비해 NASH 조직에서 더 낮았다. Autophagy 조절 인자인 autophagy protein 16L1 (ATG16L1)과 microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3-II (LC3-II)의 발현 수준은 normal 조직에 비해 NASH조직에서 더 높았지만, autophagy 기질 단백질인 p62은 두 조직 간에 유의한 발현 변화가 관찰되지 않았다. 위 3개 분자생물학적 경로와 관련된 단백질들의 NAFL 조직 내 발현은 normal 조직 또는 NASH 조직과 유사한 경향을 보이거나, 두 조직의 중간 수준이었다. 이러한 결과는 사람의 NAFLD 조직에서 UPR 및 apoptosis와 관련된 특정 중요 조직 과정의 조절이 광범위하게 손상되었음을 시사한다. 이전 연구에서 몰리브덴산염 (molybdate) 투여는 당뇨병 쥐의 지질 수준을 감소시키는 것으로 보고하였다. 또한, 산화방지제 (antioxidant)로서의 molybdate의 잠재적인 활성은 다양한 동물 모델에서도 입증되었다. 따라서, 본 연구에서는 광범위하게 사용되고 있는 대사성 질환 마우스 모델 중 하나인 메티오닌-콜린 결핍 식이 (methionine- and choline-deficient diet, MCD) 모델을 이용하여 NAFL 및 그와 관련된 장애에 대한 molybdate의 영향을 평가하였다. 10 주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 MCD와 molybdate을 함유한 식수를 4 주간 투여하였다. 그 결과, molybdate 투여는 MCD에 의해 유발된 간 내 지질 축적을 현저히 약화시켰다. 그리고 MCD를 섭취한 마우스의 간에서 molybdate 투여는 LC3-II의 형성을 증가시킴과 동시에 p62 단백질의 발현 수준을 감소시킴으로서 지질 이화 작용과 관련된 autophagy 경로를 활성화시켰다. MCD에 의한 지질 및 단백질 산화와 같은 산화적 손상 (oxidative damage)도 간에서 molybdate에 의해 완화되었다. 반면, molybdate 투여는 MCD를 섭취한 마우스의 간에서 ER stress와 관련된 단백질들의 발현에는 영향을 미치지 않았다. 또한, MCD에 의한 간세포 손상 정도도 molybdate 투여에 의해 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 molybdate이 마우스 간에서 부작용을 일으키지 않으면서 MCD에 의해 유발된 NAFL을 autophagy 작용의 활성화를 통해 효과적으로 완화시킬 수 있음을 시사한다. 본 연구는 사람 NAFLD의 발병 기전에 대한 새로운 지견과 더불어 NAFLD의 치료 예방제로서 molybdate의 가능성을 제시하고 있다.