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항원제시세포로서 CD40-활성 B 세포와 수지상세포의 기능 비교
NGUYEN HOANG TUYET MINH 전남대학교 대학원 2008 국내석사
종양항원에 특이적인 세포독성 T 림프구를 이용한 종양의 세포면역 치료는 종양에 대해서 특이 반응을 보이면서 부작용이 매우 적은 치료법으로 주목을 받고 있다. 이와 같이 종양-특이 T 세포 면역 반응을 유발시키기 위해서는 T 세포에 효과적으로 항원을 제시할 수 있는 항원제시세포의 매개가 필수적이다. 가장 강력한 항원제시세포로 알려진 수지상세포를 임상에 적용하기 위해서는 수회에 걸쳐서 다량의 수지상세포를 투여하여야 하는데, 시험관 내에서 수지상세포를 증폭할 수 없을 뿐만 아니라 대량 생산하는데 고비용이 소요되어서 임상적용을 하는데 어려운 문제점이 있다. 본 연구자는 이러한 수지상세포의 단점을 보완하여 종양에 대한 세포면역치료의 효과를 증대시킬 수 있는 대체 항원제시세포로서 CD40-활성 B 세포의 이용 가능성을 알아보기 위해서 CD40-활성 B 세포와 수지상세포의 항원제시기능을 비교 분석하였다. 정상인의 말초혈액에서 단핵구를 분리한 후 다시 림프구와 단구를 분리하였다. 분리된 단구는 GM-CSF와 IL-4를 첨가한 배양액에서 미성숙 수지상세포로 분화시켰으며, 배양 6일째에 IL-1β, TNFα, IL-6 및 PGE2를 첨가하여 표준 성숙 수지상세포로 분화시켰다. 림프구는 IL-4를 첨가한 배양액에서 CD40 리간드를 핵산전달감염시킨 J558 세포주와 공조배양하여 14일동안 B 세포를 활성화시켰다. 유세포분석기를 이용한 면역표현형 분석에서 CD40-활성 B세포와 수지상세포에서 항원제시세포의 기능과 연관된 costimulatory factor (CD80, CD86), 부착분자(CD54) 및 MHC-II 분자의 발현 정도가 두 세포에서 유사하게 높게 발현되었다. CCR7은 CD40-활성 B 세포에 비해 수지상세포에서 현저히 높게 발현되었지만, CD40-활성 B 세포의 표면에서도 이 분자의 발현이 증가되었다. CD40-활성화 B세포의 자가 T 림프구와 동종 T 림프구에 대한 자극 능력은 수지상세포에 비해서 다소 낮았다. 종양 특이 세포독성 T 림프구는 자가 CD3+ T 세포를 ARH77 세포주 융해질이 부가된 CD40-활성 B 세포나 수지상세포로 1주일 간격으로 3차례 반복 자극하여 제조되었으며, 자가 종양에 대한 세포독성 T 림프구에서 분비된 IFF-γ 분비 세포의 수는 ELSPOT 분석을 통해 측정하였다. 수지상세포로 자극되어 제조된 종양 특이 세포독성 T 림프구는 CD40-활성 B세포로 자극되어 제조된 것 보다 IFN- 분비능이 더 높게 나타났다. 그러나 CD40-활성 B 세포는 시험관내에서 대량 증폭이 가능함으로 종양항원-특이 세포독성 T 세포를 유도할 때 종양항원을 부가시킨 CD40-활성 B세포의 수를 두배 증가시켜 배양할 경우 발현된 IFN-γ 분비 세포의 수가 현저히 증가되어 수지상세포와 유사한 효과를 나타내었으며, 세포종양에 대한 살상효과는 오히려 약간 더 높게 나타났다. 결론적으로 본 연구는 종양 특이적인 세포면역치료에 있어서 CD40-활성 B세포가 향후 수지상세포를 대체할 수 있는 차세대 항원제시세포로써 매우 유용한 역할을 할 수 있음을 제시하였다. The use of cellular vaccines reliably generates tumor antigen-specific T cells both in animal models and in human. Highly efficient antigen presentation by professional antigen presenting cells (APCs) is a requisite for the development of T cell mediated immunity in vitro and in vivo. The potential need for continuous application of large number of dendritic cells (DCs) which are though as the most powerful APC might be a principle obstacle for clinical use of DC vaccines. In this study, we evaluated and compared the functions of antigen presentation of CD40-activated B (CD40-B) cells with those of DCs to confirm whether CD40-B cells could be an efficient alternative source of APCs which can compensate the limitation of DCs for cancer immunotherapy. Lymphocytes and monocytes were isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of normal donors using Percoll gradient centrifugation. To generate CD40-B cells, lymphocytes were co-cultured with CD40L-transfected J558 cell line in the presence of IL-4. Monocyte-derived DCs were differentiated from the same donor with conventional cytokine cocktail of IL-1, TNFα, IL-6 and PGE2. Both of CD40-B cells and DCs consistently expressed a high level of cell surface molecules related to APC function, such as CD80, CD86, CD54 and HLA-DR. Although the level of expression of CCR7 on mature DCs was much higher than that on CD40-B cells, this molecule was clearly up-regulated on CD40-B cells. Although DCs had superior capacity of allogeneic T cell stimulation compare to CD40-B cells, the level of cytotoxicity of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) induced by CD40-activated B cells pulsed with ARH77 lysates against ARH77 was higher than that of CTLs induced by DCs pulsed with ARH77 lysates. CTLs stimulated by mature DCs pulsed with ARH77 lysates showed a larger number of IFN- secreting cells than those stimulated by CD40-B cells pulsed with ARH77 lysates in a culture ratio of 5:1. However, CTLs stimulated by CD40-B cells pulsed with ARH77 lysates at the 1:2.5 culture ratio demonstrated the increased number of IFN γ-secreting cells against ARH77 as much as CTLs stimulated by tumor antigen pulsed DCs at 5:1 culture ratio displayed. Because CD40-B cells can be easily expanded in vitro, these results suggest that CD40-B cells are an excellent alternative source of professional APCs for antigen-specific immunotherapy for cancer.
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