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최성일 The Graduate School, Yonsei University 2003 국내박사
융합단백질 발현기술은 (fusion protein technology) 대장균에서 목적단백질 (target protein) 을 수용성으로 발현하는 가장 효과적이어서 특히 단백질 공급이 문제시 되는 포스트 게놈 시대 (post genomic era)에 이 것을 풀 수 있는 유용한 방법으로 알려져 있다. 융합짝 (fusion partner)은 연결되어 있는 목적 단백질에 세퍼론 기능을 하는 것으로 알려져 있는데 구체적으로 융합짝이 어떻게 이런 기능을 하는지는 알려져 있지 않다. 그런데 단백질의 수용성과 높은 순수 전기도 (net charge or average net charge)의 관계가 잘 알려져 있어서 순수 전기도를 높이는 방법으로 RNA 결합을 이용하였다. 즉 RNA가 결합하면 높은 음전하와 거대성이 융합짝의 성능을 더 향상 시킬 수 있다는 것이다. 이 전략을 바탕으로 RNA결합단백질을 선정하여 그 기능을 확인하여 본 결과 현존하는 가장 우수한 융합짝으로 알려진 말토스 결합 단백질 (MBP)보다 성능이 우수한 LysRS와 NP를 발굴하고 여기에 비교할 만한 수준인 Hsp15, C5, 그리고 LysN을 개발하였다. 이 융합짝들은 목적단백질의 수용성과 접힘을 모두 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 특히 LysRS는 목적 단백질의 수용성과 접힘을 향상하는 뛰어난 능력이 있으므로 단백질 발현과 생산에 중요한 도구 (tool)로 사용될 수 있다. 융합짝의 기능에 이 단백질의 크기가 관여할 수 있다는 사실을 보여주었고 융합짝의 세퍼론 기능이 멀티도메인 단백질의 접힘을 설명할 수 있다는 놀라운 가능성을 제시하였다. LysRS의 수용성 향상에 이것과 결합하는 lysine tRNA가 특이적으로 기여함을 lysine tRNA를 coexpression 함으써 생체에서 증명하였다. 이런 사실을 보다 명확히 증명하기 위해서 RNA 존재하에 재접힘을 (refolding)하여 상대적 비교 수준 기준으로 볼 때 위의 가능성을 확인하였다. 이런 결과는 여기서 제시된 RNA 결합단백질을 이용한 융합짝 개발이 합리적이며 이제까지 밝혀지지 않은, 즉 단순히 RNA가 결합함으써 RNA가 결합단백질에 세퍼론이 될 수 있음을 제시하였다. 생체내에 비슷한 환경에서 융합짝의 세퍼론 기능을 연구하기 위하여 항체를 이용한 모델을 만들어서 항체도 세퍼론이 될 수 있음을 보여주었다. 이러한 일련의 실험들은 기존의 세퍼론 모델 (the molecular chaperones)로 대부분이 설명이 안 되는 것이어서 실험자료와 이미 밝혀진 자료에 근거하여 전혀 다르지만 현재의 밝혀진 사실과 잘 부합하는 새로운 세퍼론 모델을 만들었다. 요약하면 여기서 제시된 새로운 융합짝 개발 전략, 개발된 융합짝, RNA의 새로운 세퍼론 기능, 그리고 제시된 세퍼론 모델은 생체내 단백질 접힘과 단백질 생산 기술에 새로운 방향성을 제시해 줄 것으로 사료된다. The fusion protein technology suitable for high-throughput protein expression and production is a prerequisite tool in post-genomic era. Here, a new strategy for developing fusion partners with solubility enhancement of target proteins was devised using RNA binding proteins (RBP), assuming that the binding of highly charged RNA can promote the solubility of its cognate protein fused proteins. Based on the above approach, several well known RNA binding proteins were selected and tested. Even though only limited numbers of RBP were tested, E. coli LysRS and NP were superior to MBP, a popular fusion partner for solublility enhancement. Furthermore, C5 of RNase P, LysN (N-terminal domain of LysRS), and Hsp15 were comparable to MBP in solubility enhancement. In addition, the chaperone activity of fusion partner was shown to explain the role of N-terminal domain for the folding of multidomain in vivo that has been an enigma in protein folding. Coexpression in vivo of RNA enhanced the solubility of cognate proteins specifically, which supports the notion that protein folding is facilitated by RNA-binding and RNA could serve as molecular chaperone, mechanistically distinct from the classical protein interaction mediated molecular chaperones. Consistent with this view, in vitro refolding yield of LysRS-GFP was enhanced in the presence of cognate lysine tRNA. The strategy for development of fusion partner using RNA binding proteins and the novel RNA binding mediated protein folding not only give new insights into evolution of molecular chaperones but also provide a useful technology for commercial production of recombinant proteins.
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