지적 장애 관련 cnu071 유전자의 분리 및 기능 분석

이솔비 忠南大學校 大學院 2016 국내석사

Intellectual disability (ID), also called mental retardation (MR), is a generalized neurodevelopmental disorder defined by an IQ score under 70. It is characterized by deficited learning and adaptive behaviors. ID is caused by genetic factors; chromosomal abnormalities, genes defects, and environmental problems, such as social problems and infections. However, the exact causes and treatments for the ID are yet to be well defined. Here I have studied a gene named as cnu071, which was identified as a candidate gene for ID, from human patients using the Genome Wide Association Studies (GWAS). During sequence analysis, I found that there was 90% homology between the human and zebrafish cnu071 proteins. Using the whole-mount in situ hybridization (WISH) method, I examined the mRNA expression pattern of the cnu071 during zebrafish development. I also established cnu071 knockout (KO) zebrafish using CRISPR/Cas9 system. I found a phenotype of swim bladder defect in cnu071 KO mutant zebrafish. Some of fish were able to survive up to the adult stage at low frequency. To understand the molecular mechanism, I analyzed expression of several molecular markers in the cnu071 KO mutant, using WISH method. There were no significant difference in the expressions of these molecular markers at early larval stages. However, at the adult stage, I found a significant change in the size of brain in cnu071 KO fish, compared to that of wild type fish. In relation to ID patients, I tried to test neurobehavioral changes in the cnu071 KO fish. In social behavior test, cnu071 KO fish showed a significant reduction in their social interaction. From these results, I suggest that cnu071 is a causative gene for ID in humans.

Prenatal Developmental Toxicity Study of Aluminum Oxide Nanoparticles in Sprague-Dawley Rats

정지성 忠南大學校 大學院 2019 국내석사

산화 알루미늄 나노 입자(Al2O3 nanoparticles)는 전기 절연, 높은 기계적 강도 및 내마모성을 가지고 있어 산업계에 많이 활용되는 나노 소재 중 하나이며 식품 첨가제, 의약품 등에 광범위하게 사용되고 있다. 산화 알루미늄 나노 입자 사용량은 해마다 증가하여 작업환경 및 소비자 제품을 통한 노출 가능성이 높아지고 있다. 그 중 임산부 및 태자 또한 산화 알루미늄 나노 입자에 노출 수 있으나 아직까지 완전히 연구되지 않았다. 이전 연구에 따르면 산화 알루미늄 나노 입자가 산화적 손상을 통해 유전, 세포 및 신경 독성을 일으킨다고 알려져 있지만 임신 기간 중 경구 노출에 따른 독성 정보는 제한되어있다. 본 시험은 임신 암컷 SD랫드에 산화 알루미늄 나노 입자 (30 nm) 투여 후 모독성 및 발생독성학적 영향과 임신 중 분포에 대해 조사하였다. 임신 6일부터 19일까지 매일 0, 20, 60 및 200 mg/kg 용량으로 경구 투여한 후 임신 20일에 제왕절개를 실시하여 외표 소견, 내부 장기 및 골격 검사를 통해 변이/기형을 판단하였다. 모동물 검사에서, 임신 동물의 일반 증상, 체중, 사료 섭취량, 육안 소견 및 장기 중량 측정 또는 관찰결과 모독성은 확인되지 않았다. 그리고 제왕절개결과, 황체수, 착상수, 초기 및 후기 흡수, 사망 및 생존 태자수, 성비, 착상 전∙후 손실률, 태자 및 태반 중량 지표에서 알루미늄 나노 입자 투여와 관련된 변화가 관찰되지 않았다. 태자의 형태학적 검사결과, 부형제 대조군과 비교하여 변이의 유의한 변화는 없었고 기형 소견 또한 관찰되지 않았다. 그리고 모동물과 태자의 조직 및 혈액에서 알루미늄 농도를 분석한 결과, 체내 흡수는 관찰되지 않았다. 나노 입자의 물리화학적 특성과 노출 경로가 체내 흡수 및 분포에 영향을 줄 수 있으며 대사와 배출의 종별 차이는 발달독성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 알루미늄의 건강위해성평가는 연령, 신장 기능, 위 pH 등을 고려해야 하므로 본 시험결과는 산화 알루미늄 나노 입자의 생체 내 독성 및 분포에 대한 정보를 제공하여 위해성 평가자료로 활용될 것으로 판단된다.

Discovery of ARPC2 modulator by connectivity map and Investigation of its anti-metastatic activity

최지연 忠南大學校 大學院 2020 국내박사

ARPC2 is a subunit of the Arp2/3 complex, which is essential for lamellipodia, invadopodia and filopodia, and ARPC2 has been identified as a migrastatic target molecule. To identify ARPC2 inhibitors, I generated an ARPC2 knockout DLD-1 human colon cancer cell line using the CRISPR/Cas9 system and explored gene signature-based strategy, such as a connectivity map (CMap) using the gene expression profiling data of ARPC2 knockout and knockdown cells. From the CMap-based drug discovery strategy, I identified pimozide (a clinically used anti-psychotic drug) as a migrastatic drug and ARPC2 inhibitor. Pimozide inhibited the migration and invasion of various cancer cells. Through drug affinity responsive target stability (DARTS) analysis, cellular thermal shift assay (CETSA) and pull-down assay, it was confirmed that pimozide directly binds to ARPC2. Pimozide increased the lag phase of Arp2/3 complex-dependent actin polymerization and inhibited the vinculin-mediated recruitment of ARPC2 to focal adhesions in cancer cells. To validate the likely binding of pimozide to ARPC2, mutant cells with altered amino acids at the expected binding site were prepared. Pimozide strongly inhibited the migration of ARPC2F247A and ARPC2Y250F mutant cells, consistent with the calculation of binding affinity. In other mutated cell, ARPC2E184A and ARPC2F185A, pimozide was resistant to the inhibitory effect of migration. Therefore, pimozide is a potential ARPC2 inhibitor and ARPC2 is a new molecular target. Taken together, the results of this study provide new insights into the molecular mechanism and target that are responsible for the antitumor and anti-metastatic activity of pimozide. 암 환자 사망의 90% 이상의 원인은 전이 때문이며, ‘세계보건기구’ 에서 암 사망의 주범은 전이라고 밝혔다. 암 전이는 혈관을 통한 세포의 이동에 의해 일어나며, 세포는 이동하려는 방향으로 액틴섬유를 모아 세포막을 길게 늘어뜨려 다리처럼 이용한다. ARPC2는 액틴의 형성에 관여하는 단백질인 Arp2/3 복합체 중 하나로, 최근 암 전이 억제의 표적 단백질로 효과적인 결과를 보였다. 본 연구에서는 ARPC2 의 조절물질을 찾기 위해서, 먼저 CRISPR/Cas9 system을 이용하여 ARPC2가 결손된 대장암 세포주를 제작하였다. ARPC2가 결손된 대장암 세포주는 이동속도가 현저히 줄어들어 있었으며, 층상위족의 형성이 감소되어 있었다. 그리고 원래의 대장암 세포주와의 connectivity map분석을 통해 유전자 발현 양상을 비교한 결과, 결손 세포주와 비슷한 발현 양상을 가진 화합물 10개 중 현재 항정신성약물로 쓰이고 있는 pimozide를 선택하였다. Pimozide는 대장암 세포주 뿐만 아니라 다른 종류의 암세포들의 이동도 저해했으며, 전이 동물 모델에서도 효과적인 억제 효과를 나타냈다. Pimozide의 타겟을 찾기 위한 방법으로 DARTS assay와 CETSA 그리고 pull down assay를 이용하였으며, 그 결과 ARPC2에 직접 결합한다는 것을 확인하였다. Pimozide는 Arp2/3 복합체가 유도하는 액틴의 중합반응을 지연시켰으며, 세포내 신호전달에 의해 세포와 기질이 결합할 때 필요한 vinculin단백질과 ARPC2의 결합을 감소시키며, 층상위족이 형성되지 않는 것을 확인하였다. ARPC2 결손 대장암 세포주에 예측되는 결합부위를 돌연변이 시킨 ARPC2 단백질을 역으로 발현시켜 실험해본 결과, 예측한 E184, F185, F225, F247 그리고 Y250에 둘러 쌓인 포켓에 pimozide가 결합한다는 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 pimozide의 전이 억제 효과는 ARPC2의 직접적인 결합을 통해 이루어짐을 확인하였으며, connectivity map을 통한 약물의 새로운 분자적 기전 연구 및 탐색의 새로운 방법을 제시하였다.

아조벤젠을 도입한 아마이드 덴드론의 가역적 형태전이

김용현 인하대학교 대학원 2013 국내석사

본 연구실에서는 최적의 분자의 디자인을 통해 양친성 아마이드 덴드론을 합성하였다. 특히, 파이렌을 포칼포인트에 도입한 아마이드 덴드론의 경우 수용액 상에서 베시클 구조를 이룬다는 사실을 발견하였다. 형성된 베시클의 표면은 소수성의 파이렌으로 노출되어 있기에 베시클이 분산된 수용액에 싸이클로덱스트린을 넣게 되면, 표면에 노출된 소수성의 파이렌과 싸이클로덱스트린의 호스트-게스트 상호작용에 의해 싸이클로덱스트린의 내부로 파이렌이 삽입된다. 아마이드 덴드론의 친수성-소수성 비가 달라짐으로써 베시클이던 구조체의 형태가 나노튜브로 형태전이를 하였다. 또한, 폴리프로필렌글라이콜을 형성된 나노튜브 수용액에 넣었을 때 폴리프로필렌 글라이콜과 싸이클로덱스트린과의 상호작용으로 싸이클로덱스트린은 나노튜브 표면에서 떨어져나와 폴리프로필렌글라이콜과 슈도로텍산의 형태를 이루며, 나노튜브의 구조체는 베시클로 형태전이하였다. 이는 형광특성을 지닌 유기나노튜브를 새로운 메커니즘을 통해 제조할 수 있었다는 점, 싸이클로덱스트린의 기능기 교체를 통해 쉽게 표면개질이 가능한 나노튜브를 만들 수 있다는 점과 가역적인 메커니즘이 가능하다는 점에 있어서 이전 나노튜브의 개념과는 차별화된 결과물이었다. 새로운 시스템의 나노튜브 형성과 더불어 외부자극에 의해 형태전이를 보이는 나노튜브시스템을 개발하기 위해 본 연구에서는 자외선에 의해 트랜스-시스 이성질화현상을 보이는 것으로 알려진 아조벤젠을 아마이드 덴드론의 포칼포인트로 도입하고자 하였다. 실험 결과로 링커물질을 기존 에틸렌다이아민에서 부틸렌 다이아민으로 교체함으로써 아조벤젠을 도입한 아마이드 덴드론의 싸이클로덱스트린과 쿠커비터릴에 의한 나노튜브형성을 관찰할 수 있었다. 또한, 아다만탄아민을 도입하여 나노튜브에서 베시클로 가역적 형태전이가 관찰됨을 관찰하였다.

아조벤젠을 도입한 아마이드 덴드론의 자기조립 거동과 가역적 형태전이

황지환 인하대학교 대학원 일반대학원 2015 국내석사

본 연구실에서는 최적의 분자의 디자인을 통해 양친성 아마이드 덴드론을 합성하였다. 특히, 2세대 amide dendron의 focal point에 azobenzene이 도입된 2G-Azo의 자기조립 거동을 관찰하였다. 덴드론의 focal point에 도입된 azobenzene은 UV 빛을 조사하면 trans형태에서 cis형태로 구조전이가 일어나는 특성을 보이고 trans형태는 α-cyclodextrin (CD)과 inclusion complex를 형성하지만, cis 형태는 α-CD와 inclusion complex를 형성하지 못하는 것으로 알려져 있는 물질이다. 따라서, focal point에 azobenzene이 도입된 amide dendron과 α-CD의 분자인식에 의한 구조변화를 UV 빛의 조사를 통해 가역적으로 되돌릴 수 있는 것을 확인하였다. 2G-Azo는 수용액상에서 vesicle 형태로 자기조립되는 것을 TEM과 SEM을 통해 확인하였고 dynamic light scattering을 통해 약 250 nm의 평균직경을 갖는 것을 확인하였다. 여기에 azobenzene과 inclusion complex를 형성할 수 있는 α-CD를 넣어주면 분자인식에 의해 inclusion complex를 형성하게 되는 것을 UV/vis absorption spectrum을 통해 확인하였다. 또한, inclusion complex의 형성을 통해 자기조립의 building block이 변화하여 전체 자기조립 구조 자체가 변화한 것을 TEM과 SEM을 통해 확인하였다. 그 결과 직경이 약 60 nm인 나노튜브형태로 자기조립 되는 것을 확인하였다. 그 후, 만들어진 나노튜브에 α-CD와 inclusion complex를 azobenzene보다 더 강하게 형성한다고 알려져 있는 PEG-adamantane를 넣어주었다. 그 결과 나노튜브 표면에 있는 α-CD가 더 이상 덴드론의 focal point에 있는 azobenzene과 inclusion complex를 형성하지 못하고 PEG-adamantane와 α-CD의 inclusion complex 형성이 더 우세하게 되었다. 따라서 전체 자기조립의 building block이 α-CD와 inclusion complex를 형성해서 된 nanotube 이전의 2G-Azo자체로 변화하게 되고 2G-Azo자체가 수용액에서 형성하는 vesicle형태로 자기조립 구조가 변화하는 것을 확인하였다.

국가연구개발정책의 형성과 영향요인 분석 : 공공선택론적 관점에서

이준호 한남대학교 2016 국내석사

우리나라는 한 해 국가연구개발정책에 투입되는 예산이 약 15조원에 이루며, 우리나라 국가연구개발정책 예산 규모는 미국, 일본 등 선진국들과 비교하여 볼 때 세계 7위권이며 절대규모 면에서는 다소 부족하지만, 국내총생산(GDP) 대비 세계 4위 수준으로 매우 높은 수준이다. 이에 따라 국가연구개발정책은 다양한 프로그램과 이를 수행하는 다양한 부처, 관계자들이 존재하고 있다. 국가연구개발정책에 다양한 정부부처와 이해관계자들이 참여하게 되면서 다양한 문제들도 발생하게 되었다. 연구과제 선정 과정에서 유착 문제, 연구비의 목적 외 사용 및 관리체계의 부실 문제, 연구 결과 부실 및 연구결과 편가 체계의 부실 문ㅈ 등 많은 문제가 나타나고 있다. 이러한 문제로 인한 비효율에 대한 다양한 대안과 발전방안들은 오래전부터 제시되었지만 매번 실행의 단계에서 진전이 이루어지지 않고 있는 현실이다. 국가연구개발정책 문제에 대한 개선이 부진한 것에 대한 이유로 여러 연구 및 언론에서는 이해관계자들의 이익추구적 행태 및 부처이기주의에 의해 효율적 개선이 어렵다고 지적하고 있는 실정이다. 따라서 본 논문에서는 공공선택론적 관점으로 관료, 정치인, 이익집단이라는 이해관계자들을 주목하여 분석을 하였다. 관료는 국가연구개발정책이 시행되는데 있어서 부처의 확장, 예산확보 등을 최우선 목표로 삼기 때문에 공익이라는 규범적 추구이익을 등한시 하고 정책의 비효율성을 야기시키는 행태를 보이는 경우가 많다. 정치인은 투표의 극대화, 재선이라는 목표를 이루기 위해 본인의 투표극대화라는 목적을 달성시켜줄 수 있는 집단의 이익을 대변하여 정책이 올바른 방향으로 가는 것을 저해한다. 이익집단과 같은 경우에는 언론과 로비 등을 통해 국가적으로 큰 이익을 가져가는 방향보다는 본인과 소속집단이 많은 이익을 받을 수 있는 방향으로 정책이 흘러가도록 언론을 이용하고, 정치인을 압박하여 정책에 본인들의 의사를 반영하기 위해 노력한다. 위에서 언급한바와 같이 각각의 이해관계자들은 본인이 규범적으로 공익을 위하여 올바르게 추구해야 할 이익이 있지만 공익보다는 사익을 위해 행동한다는 것을 알 수 있다. 결국 공공선택론에서 말하는 바와 같이 ‘개인의 이익을 추구한다.’는 것을 알 수 있다. 이러한 개인적 이익추구는 인간의 본성이므로 쉽게 바꿀 수는 없을 것으로 보인다. 하지만 이러한 사익추구로 인해 정책의 진행과정에서 비효율이 계속해서 일어난다면 제도적 개선을 통해 비효율을 줄일 수 있는 방안을 강구해야 할 것이다.

Structural Exploration of Salmonella Typhi YfdX Reveals its pH-dependent Stoichiometric Conversion

이혜선 忠南大學校 大學院 2019 국내박사

YfdX는 대장균, 이질균, 폐렴막대균, 그리고 장티푸스를 유발하는 병원균으로 알려진 살모넬라균과 같은 다양한 병원성 박테리아에 존재하는 단백질로서, yfdXWUVE 오페론에 속해 있으며 대장균 내에서는 스트레스 환경에 대한 반응을 조절하는 EvgA에 의해 발현량이 조절된다. 이러한 YfdX는 최근 연구에서 병원균의 다양한 생리학적 특성과 밀접한 관련이 있는 것으로 드러나고 있다. 대표적으로 YfdX는 살모넬라균의 병원성과 항생제 감수성을 음성적으로 조절한다. YfdX가 결핍된 살모넬라균은 β-lactam 계열의 항생제에 대한 감수성이 증가하여 박테리아의 생존률이 감소하였고, 병원성 또한 증가하여 살모넬라 감염성 모델동물인 Galleria melonella 의 생존률이 감소하는 것으로 알려져 있다. 한편, YfdX는 샤페론 활성을 가진 것으로 보고되었으며, 이를 통해 폐렴막대균 내에서 산성 스트레스 반응에 관여한다고 보고되어있다. 또한 ampicillin, ciprofloxacin, rifampicin과 같은 항생제와의 결합이 보고되었으며, YfdX의 구조 모델링과 이를 이용한 분자역학 시뮬레이션을 통해 박테리아의 부착, 침윤에 연관된 것으로 알려진 STY3179와의 결합 가능성이 제시되었다. 이와 같이 YfdX에 대한 다양한 생물학적, 생리학적 연구가 진행되고 있음에도 불구하고, 같은 오페론에 의해 조절되는 다른 단백질과는 달리 YfdX의 구조적 연구는 거의 이루어지지 않았다. 본 연구에서는 살모넬라균의 YfdX 단백질을 고순도로 정제하여 결정화를 수행하였고 다양한 조건에서 단백질 결정을 획득하였으며 X-ray 회절 데이터를 수집하여 사량체 (tetramer) 형태의 삼차원 구조를 규명하였다. 규명한 구조를 기반으로 하여 다각도 광산란 (SEC-MALS), 소각 X선 산란(SAXS) 및 화합물을 이용한 교차연결(cross-linking) 실험을 통해, 동적인 이량체 (dimer)–사량체 (tetramer) 변환이 있음을 처음으로 확인하였고 이는 pH 의존적임을 확인하였다. 또한 구조 분석을 통해 사량체를 구성하는 결합부위에 대한 각각의 돌연변이를 제작하여 사량체를 구성하는 최소 단위를 확인하였다. 본 연구에서는 새로운 단백질 구조를 가진 살모넬라균 YfdX 단백질의 X-ray 삼차원 구조를 규명하였으며, 이전에 발견되지 않은 pH 의존적 이량체-사량체 변환을 확인하였다. 이번 연구를 통하여, 잘 알려지지 않았던 살모넬라균 YfdX 단백질의 구조학적 특징을 확인하였으며, 병원성 박테리아의 독성과 항생제 감수성 조절에 대한 새로운 가능성과 접근법을 제시할 수 있다. The antimicrobial resistance is the significant problem facing the human race. YfdX, which is the protein encoded by the yfdXWUVE operon, appears in several pathogenic bacteria including Hafnia alvei, Klebsiella pneumoniae, Shigella dysenteriae, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Salmonella Typhi, the typhoid fever-causing Gram-negative bacteria. YfdX is known to be overexpressed under the control of EvgA ( a response regulator protein controlling the expression of several proteins involved in response to environmental stress) in Escherichia coli and is associated with the acid stress response as a chaperone in K. pneumoniae. Additionally, it have been reported that YfdX binds with three antibiotics, ampicillin, ciprofloxacin and rifampicin. Further Salmonella YfdX binding with STY3179, Salmonella protein associated with bacterial adhesion and invasion, is presented using molecular dynamics simulation. Moreover, YfdX has recently been revealed as a key player modulating bacterial pathogenic virulence against Galleria mellonella and antimicrobial tolerance. YfdX deficiency in S. Typhimurium leads to its enhanced virulence and reduced antibiotic tolerance to two antibiotics, penicillin G and carbenicillin. Furthermore, this phenotype of Salmonella knockout was complemented through transient yfdX expression. Nevertheless, unlike other proteins encoded by the same operon, the structural aspect of YfdX has been poorly characterized. Here, we determined the novel fold crystal structure of Salmonella YfdX and identified a previously unknown pH-dependent stoichiometric conversion between dimeric and tetrameric states of Salmonella YfdX. This conversion was further analyzed via SAXS analysis and its structure-based mutant studies using SEC-MALS and cross-linking experiments. Further, the disharmonious stoichiometric problem was solved through observation of the Salmonella YfdX states at variable pH conditions. These results collectively provide a novel fold crystal structure of Salmonella YfdX, new pH-dependent oligomeric conversion, and new structural insight into the role of YfdX in the regulation of antibiotic susceptibility and virulence.

인간 TEAD1 YAP 결합 도메인의 구조 규명 연구 및 초파리 DARP의 구조 기반 탈인산화 효소 활성 연구

모예진 忠南大學校 大學院 2020 국내석사

TEAD family proteins are downstream transcription factors in Hippo signaling that plays a critical role in embryo development, organogenesis, and tissue homeostasis. TEAD activity is regulated by interacting with transcriptional co-activators like YAP that cannot bind DNA directly and is known to be implicated in oncogenesis of various tumors. Therefore interference of the YAP-TEAD binding is presumed to be a putative anticancer strategy. In particular, lots of studies have shown that up-regulated gene expression by TEAD1 causes cancers of the stomach, renal cell, ovaries and prostate. However to date, the apo form structure of YAP-binding domain (YBD) of human TEAD1 was not elucidated. Herein, I reports the crystal structure of YBD of human TEAD1 in the apo form with a high resolution of 1.7 Å. While the YBD of TEAD1 looks like a dimeric form in an asymmetric unit, it exists as a monomeric form, which was confirmed using the Protein Interfaces, Surfaces, and Assemblies server and size exclusion chromatography-multiangle light scattering analysis. I also compared and analyzed TEAD1 YBD via structural alignment with the TEAD1-YAP complex and other human TEAD YBDs (TEAD 2-4). Protein phosphorylation and dephosphorylation are reversibly regulated by protein kinase and phosphatase and are important mechanisms that regulate signal transduction within cells. The target residues of protein dephosphorylation, which are present in many organisms, are mainly serine, threonine and tyrosine. However, recent studies have revealed dephosphorylation targets such as aspartate, histidine, cysteine and arginine. Recently, arginine phosphatase, YwlE, is found with the structure in the bacteria, Bacillus subtilis. This enzyme is known to be a protein that is involved in stress response and plays an important role in regulating protein homeostasis in bacteria. The discovery of arginine phosphatase played a role in the characterization of arginine phosphatase. This finding could lead to the discovery of the first eukaryotic arginine phosphatase, the Drosophila DARP protein. In this study, I was able to determine the crystal structure of Drosophila DARP protein using diffraction data with good resolution of 2.2 Å. I also compared DARP protein with YwlE and representative LMW-PTP structures and found the important feature for arginine phosphatase. Based on the characteristics of the arginine phosphatase found from the structure comparison, I measured the phosphatase activity.

Functional validation of DYRK1A as an autism gene using zebrafish

김옥희 忠南大學校 大學院 2019 국내박사

DYRK1A 유전자는 21번 염색체가 정상보다 1개 많은 다운신드롬 (Down syndrome)의 원인 유전자로 알려져 있지만, 최근 대규모 인간유전체 분석기술이 발달함에 따라 정상보다 1개 적을 경우 자폐증 (Autism spectrum disorder)을 일으킨다는 것이 보고되고 있다. 본 연구에서는 자폐증 후보 유전자로서 DYRK1A를 검증하기 위해 TALEN (Transcription activator-like effector nuclease)을 이용한 DYRK1A 결손 제브라피쉬를 제작하였다. DYRK1A 유전자가 결손된 제브라피쉬는 성체 시기까지 외형적으로 정상이었으나 성체 시기의 DYRK1A 결손 제브라피쉬의 뇌를 적출하여 몸의 크기, 무게 및 나이가 같은 정상 대조군과 비교한 결과, 뇌의 크기만 통계적으로 유의하게 감소하였다. DYRK1A 결손 제브라피쉬는 수정 후 3주째에 전뇌 구역에서 세포사멸이 증가되어 1달째부터 뇌의 크기가 감소하였다. 또한, 자폐증의 대표적인 특징인 사회성 결여와 관련된 행동을 분석하여 자폐증 원인 유전자로서 DYRK1A를 검증하고자 하였다. 특히, 제브라피쉬는 무리를 지어 생활하므로 사회성 행동실험에 매우 적합하다. 사회적 상호작용 실험 (social interaction test)을 수행한 결과, DYRK1A 결손 제브라피쉬는 정상 대조군과 비교하여 Social cue와 가장 가까운 구역에서 머문 시간이 감소되었으며, 먼 구역으로의 이동 횟수가 증가되었다. 또한, 사회적 상호작용 행동실험을 한 후, DYRK1A 결손 제브라피쉬의 뇌에서 강한 사회적 자극 후의 neuronal activation의 변화 양상을 관찰하기 위해 분자 마커인 c-fos를 통해 뇌 전반적으로 활성화된 정도가 감소되었으며, 특히 시상하부에서 가장 크게 감소하였다. 또한, 24시간동안의 사회적 격리 조건에서 스트레스 호르몬의 분자 마커인 crh를 통해 DYRK1A 결손 제브라피쉬의 뇌의 시각전핵에서 발현 수준이 감소된 것을 확인하였다. 마지막으로, shoaling bowl assay를 통한 집단 행동을 관찰한 결과, 정상 대조군과 비교하여 DYRK1A 결손 제브라피쉬는 개체간의 거리가 증가되었으므로 제브라피쉬의 무리를 짓는 습성이 상당히 감소되어 있는 것을 확인하였다. 이러한 다양한 행동분석 결과를 통해 정상 제브라피쉬와 비교하여 DYRK1A 결손 제브라피쉬는 사회성이 결여되어 있음을 확인하였다. 본 연구를 통해 DYRK1A 유전자에 돌연변이가 발생하여 소두증과 자폐증을 나타내는 환자들처럼 DYRK1A 결손 제브라피쉬에서의 동일한 표현형을 확인하였으며, 사회성을 평가하는 행동 분석 방법을 통하여 자폐증의 원인유전자를 검증할 수 있음을 확인하였다. DYRK1A maps to the Down syndrome critical region at 21q22. Mutations in this kinase-encoding gene have been reported to cause microcephaly associated with either intellectual disability or autism in humans. Intellectual disability accompanied by microcephaly was recapitulated in the murine model by overexpressing Dyrk1a which mimicked Down syndrome patients. However, given embryonic lethality in homozygous mice, knock-out (KO) of this gene in the mice has proved challenging. Here, to circumvent this barrier, I have created a dyrk1aa KO zebrafish using transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated genome editing. By the development of new behavioral tests of social interaction and shoaling bowl assay, I demonstrate social impairments in dyrk1aa KO zebrafish that reproduce human phenotypes of autism in a vertebrate animal model. These results illustrate functional deficiency of DYRK1A as an underlying disease mechanism for autism. Also, I propose simple social behavioral assays as a tool for widespread study of autism candidate genes.

Targeted knockout of duox causes defects in thyroid development and social interaction in zebrafish

박종수 忠南大學校 大學院 2019 국내박사

NADPH oxidases (Nox/Duox) produce reactive oxygen species when activated by various extracellular signals. Their activity has been shown to be important for various biological and pathological processes; however, the cellular and tissue-specific roles that individual Nox/Duox members play in vivo during development remain unclear. In order to investigate the in vivo roles of Duox in zebrafish, we generated duox knockout (KO) mutation by using the CRISPR/Cas9 system. At early developmental stages, the duoxck62a/ck62a zebrafish exhibited relatively normal development compared to duox+/+ siblings. And even wound healing, neutrophil migration and also locomotor activity also normal. However, starting from juvenile stage, duoxck62a/ck62a zebrafish showed profound growth retardation resulting in short body size, defects in xanthophore pigment cell development, and abnormally enlarged thyroid follicles with goiter formation in adults. Additionally, adult duoxck62a/ck62a fish and duox+/+ fish were subjected to a battery of behavioral tests including novel tank and social interaction assay. For the first time, we demonstrate that duoxck62a/ck62a fish showed impaired anxiety response and social interaction. Taken together, our data suggest that duoxck62a/ck62azebrafish could serve as an effective animal model for further studies in thyroid development and related neurological diseases, including intellectual disability and autism. NADPH oxidases (Nox / Duox)는 다양한 세포 외 신호에 의해 활성화되면 활성 산소종 (ROS)을 생성한다. 이들의 활동은 다양한 생물학적 및 병리학적 과정에 중요한 것으로 나타나지만, 각각의 Nox / Duox 구성원이 생체 내에서의 역할은 아직 알려지지 않은 부분이 존재한다. 본 연구에서는 DUOX의 제브라피쉬 상동유전자인 duox를 분리하였고, CRISPR/Cas9 방법을 통해 duox 유전자의 녹아웃 제브라피쉬를 제작하였다. 그 결과 duox 유전자의 exon 3 에서 8개의 염기서열이 결손 된 대립형질을 가진 제브라피쉬를 획득하였다. 이형접합체 (heterozygote) 암,수 두 마리의 교배를 통해 약 25%의 duox 동형접합체 (homozygote) 돌연변이 개체를 획득하였다. 수정 후 5일째, duoxck62a/ck62a 제브라피쉬는 야생형 (duox+/+) 개체와 같은 발달상태와 상처회복, 중성구 이동경향을 보였지만, 수정 후 1달경을 기점으로 하여 duoxck62a/ck62a 제브라피쉬는 성장 지연, 크산토포어 (xanthophores) 색소세포 발달에 결함, 성체에서 갑상선종처럼 비정상적으로 커진 갑상선 소낭의 경향성을 보였다. 또한, 성체 duoxck62a/ck62a 제브라피쉬와 duox+/+ 제브라피쉬를 이용하여, ‘Novel tank assay’ 및 ‘Social interaction assay’ 분석을 포함한 행동 실험을 진행하였으며, 이를 통해 처음으로, duoxck62a/ck62a 제브라피쉬가 불안 반응의 저하와 사회적 상호 작용에 결손이 생겼음을 보여 주었다. 본 연구에서는 DUOX의 기능 연구를 위하여 제브라피쉬 상동유전자 분리 및 돌연변이 개체를 제작하였으며, 돌연변이 개체가 비정상적인 행동양상 및 발달양상을 보이는 것을 확인하였다. 이번 연구를 통하여, duox 돌연변이 제브라피쉬를 갑상선 이상 발달과 자폐증들을 포함한 신경 질환과의 연관성에 대해 새로이 연구할 수 있는 모델동물로써 유용하게 사용될 것으로 보인다.